Il modello invertito del cuore per la raccolta di transudati interstiziali dal cuore isolato del ratto
20 giugno 2017
Questo protocollo descrive un metodo per raccogliere il liquido interstiziale cardiaco dal cuore isolato del ratto perfuso. Per separare fisicamente il transudato interstiziale dal perfusato effluente venoso coronarico, il cuore perfuso di Langendorff viene invertito e il liquido intradito (transversato) formato sulla superficie cardiaca viene raccolto usando un tappo morbido in lattice.
L'obiettivo generale di questo modello a cuore invertito è quello di raccogliere il trasudato interstiziale cardiaco da un cuore di ratto isolato. All'interno del cuore pulsante, il senso individuale del cuore rilascia fattori paracrini e li rilascia nello spazio del fluido interstiziale circostante. Questo è importante, perché lo spazio del fluido interstiziale, trasporta informazioni per la comunicazione tra le cellule cardiache.
E questo è particolarmente importante in condizioni di infiammazione e rigenerazione del miocardio infartuato. In questo video, i miei collaboratori, Dr.Ding e Tan, vi mostreranno le tecniche con cui noi qui, in questo uh-amore, raccogliamo il liquido interstiziale dalla superficie di un cuore di ratto isolato e perfuso. Per realizzare il coperchio del cuore in lattice, o tappo, avere uno stampo in alluminio che corrisponda alle dimensioni medie del cuore di un topo e sia stato lucidato con carta smeriglio superfine.
Fissare verticalmente il collo dello stampo alla fresatrice e iniziare a ruotare lentamente lo stampo. Quindi, versare 20 millilitri di lattice liquido in un bicchiere di vetro da 50 millilitri e abbassare lo stampo rotante nel lattice fino a quando non è immerso. Quindi, sollevalo lentamente e continua a ruotare lo stampo per altri 15 minuti fino a quando il lattice non si sarà solidificato.
La rotazione è fondamentale per realizzare questa mousse e distribuire uniformemente lo strato di lattice liquido sulla superficie dello stampo. Quindi, assicurati che lo stampo ruoti mentre viene sollevato dal lattice. Una volta che il lattice è asciutto, ricoprilo con borotalco per evitare danni al lattice.
Arrestare la rotazione, quindi staccare delicatamente lo stampo dalla macchina. Rimuovere con cautela il lattice dallo stampo. Ora, collega un tubo di silicone lungo 25 centimetri all'uscita sul tappo in lattice.
Questo tubo viene utilizzato per raccogliere il trasudato cardiaco interstiziale, o CT. Quindi, fissare saldamente il palloncino ventricolare delle dimensioni di un ratto su una cannula metallica a forma di L, collegata a una siringa piena d'acqua da un millilitro. E riempi d'acqua il palloncino ventricolare delle dimensioni di un ratto. Assicurarsi che il palloncino sia ermetico gonfiandolo e sgonfiandolo più volte utilizzando la siringa.
Quindi, collegare la cannula a un trasduttore di pressione, tramite un arresto a tre vie. Infine, fare un segno sulla siringa nel punto in cui il palloncino riempirà la cavità ventricolare per la misurazione della pressione intraventricolare. Prima di procedere con la preparazione del cuore, preparare il sistema di perfusione di Langendorff secondo il protocollo di testo.
Ora, dopo aver anestetizzato completamente un ratto Wistar maschio da 300 a 350 grammi, trasferiscilo su un tavolo operatorio a temperatura ambiente. Con l'esperienza, i passaggi successivi che portano all'incannulamento del cuore dovrebbero richiedere solo circa tre minuti. Solleva la pelle e il muscolo appena sotto lo sterno, usando una pinza, e taglia intorno al margine inferiore delle costole usando le forbici pesanti.
Quindi, con le forbici sottili, fai un piccolo taglio nel diaframma al margine della costola. Quindi, taglia la costola caudalmente per fare un lembo dell'intera parete toracica ventrale. Ora, afferra delicatamente il cuore e vivilo lentamente fino a quando i vasi cardiaci iniziano ad allungarsi.
Quindi, asportare il cuore fino a quando l'aorta non è completamente esposta e trasferire il cuore in un becher da 100 millilitri contenente 50 millilitri di KHB ghiacciato. Ora, porta immediatamente il cuore all'apparato di profusione e monta l'aorta su una cannula gocciolante. Fissalo saldamente con una sutura 4-0, in modo che nessuna bolla d'aria possa entrare nel cuore.
Quindi, applicare una pressione di profusione costante o un flusso di profusione. Per stabilire l'impostazione del cuore invertito, ruotare prima delicatamente la cannula aortica fino a quando la parete posteriore del cuore non è in faccia. Quindi, taglia via il tessuto connettivo per esporre l'apertura all'atrio sinistro.
Quindi, afferra delicatamente il cuore e capovolgilo. Montare il cuore sul palloncino ventricolare preparato, con il palloncino sgonfio, e inserirlo nel ventricolo sinistro. Il cuore viene ora stabilizzato meccanicamente in posizione eretta, utilizzando il gruppo catetere a palloncino come supporto.
Gonfiare il palloncino fino a riempire l'intera cavità ventricolare, facendo avanzare lo stantuffo fino al segno di riempimento. Fissare il cuore in modo che lo stress sulla radice aortica sia minimo. Questa parte della procedura richiede pratica.
Ora, osserva l'indicatore sul palloncino e regola la pressione diastolica da tre a cinque millimetri di mercurio. Piccole goccioline dovrebbero formarsi sull'epicardio se la pressione è impostata correttamente. Quindi, tira delicatamente il cappuccio in lattice sul cuore.
Anche la superficie più ventricolare dovrebbe essere coperta. Prima di procedere, verificare la presenza di bolle d'aria all'interno del tappo. Per rimuovere eventuali bolle d'aria, aspirare delicatamente la siringa.
Ora, posiziona l'estremità del tubo di lasciar 10 centimetri sotto il cuore. Raccogli la TC gocciolante in una provetta da 1,5 millilitri e mantieni la provetta al di sotto dei quattro gradi Celsius incorporandola in una miscela 1:1 di ghiaccio e cloruro di sodio. Raccogliere tra 0,15 e 1,5 millilitri di CT, quindi pesare il campione e congelarlo in azoto liquido.
Conservalo a meno 80 gradi Celsius fino a quando non può essere lavorato. Quando si retroperfonde il modello di cuore invertito a una pressione costante di 100 centimetri di acqua, è stato possibile raccogliere tra l'1/10 e l'1% dell'effluente venoso coronarico. Il contenuto proteico del CT è stato misurato con il test BCA ed è stato in media di 1,1 milligrammi per millilitro.
La semplice elettroforesi su gel ha rivelato un ampio spettro di proteine. I campioni normali sono stati confrontati con campioni di cuori sottoposti a 50 minuti di riperfusione ischemica utilizzando 2D DIGE. Diverse proteine sono risultate sovraregolate nella TC dei cuori ischemici.
L'analisi proteomica è stata eseguita sulle proteine sovraregolate. Anche le purine erano di grande interesse. Le purine sono molecole di segnalazione fondamentali che regolano la risposta immunitaria cardiaca, il tono vasomotorio e la funzione cardiaca, in particolare dopo un danno ischemico.
L'analisi HPLC della TC ha mostrato concentrazioni elevate di molte purine nei cuori feriti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che un trans-in-date cardiaco che si forma in un cuore isolato, non imiterà completamente la vera composizione delle condizioni in-vee-vuh.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per raccogliere il liquido interstiziale cardiaco da un cuore isolato e perfuso di ratto. La tecnica prevede l'inversione del cuore perfuso con metodo Langendorff per separare il trasudato interstiziale dal perfusato venoso coronarico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Fisiologia cardiaca
- Dinamica dei fluidi
- Segnalazione paracrina
Sfondo
- Il cuore rilascia fattori paracrini nel fluido interstiziale circostante.
- Questo fluido è cruciale per la comunicazione tra le cellule cardiache.
- Comprendere la dinamica del fluido interstiziale è importante nell'infiammazione e nella rigenerazione miocardica.
- Lo studio utilizza un modello di cuore invertito per la raccolta del fluido.
Scopo dello studio
- Per raccogliere il trasudato interstiziale cardiaco da un cuore di ratto isolato.
- Per studiare il ruolo del liquido interstiziale nella comunicazione tra cellule cardiache.
- Per sviluppare tecniche per lo studio della fisiologia cardiaca in condizioni specifiche.
Metodi Utilizzati
- Isolamento del cuore di ratto mediante perfusione di Langendorff.
- Capovolgimento del cuore per facilitare la raccolta del liquido.
- Utilizzo di un tappo in lattice morbido per raccogliere il liquido interstiziale.
- Realizzazione di un modello in alluminio per il tappo in lattice, adatto alle dimensioni del cuore di ratto.
Risultati principali
- Corretta raccolta del fluido interstiziale dalla superficie cardiaca.
- Dimostrazione dell'efficacia della tecnica in un contesto di laboratorio.
- Approfondimenti sul ruolo del fluido interstiziale nella salute e nelle malattie cardiache.
- Potenziali applicazioni nello studio dell'infiammazione miocardica e della rigenerazione.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un modo affidabile per raccogliere il fluido interstiziale cardiaco.
- Comprendere la dinamica del fluido interstiziale può migliorare la ricerca cardiaca.
- Questo protocollo può essere applicato a ulteriori studi sulla comunicazione tra cellule cardiache.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Questo metodo consente il campionamento diretto del trasudato interstiziale cardiaco, fornendo l'accesso a molecole di segnalazione paracrina che regolano la funzione cardiaca e la risposta immunitaria. Isolando il liquido interstiziale dall'effluente venoso coronarico, i ricercatori possono ridurre i rischi nella validazione di bersagli nella scoperta di farmaci cardiovascolari, ottenendo informazioni meccanicistiche sugli ambienti di segnalazione rilevanti per la malattia. L'approccio favorisce una maggiore affidabilità predittiva nell'identificazione di composti promettenti, catturando biomarcatori endogeni rilasciati durante lesioni da ischemia-riperfusione e processi infiammatori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante il campionamento di fattori paracrini endogeni rilasciati nello spazio interstiziale.
- Valore operativo: Fornisce un sistema rilevante per la malattia per la validazione funzionale di bersagli in condizioni controllate ex vivo.
- Valore scientifico: Permette una riduzione del rischio meccanicistica attraverso la misurazione diretta di metaboliti purinergici e biomarcatori proteici associati a lesioni ischemiche.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara campioni biologici validati per lo sviluppo di saggi successivi mirati alle vie di segnalazione cardiaca.
- Valore operativo: Fornisce output quantitativi standardizzati e riproducibili mediante analisi HPLC e proteomica, pronti per lo screening di composti.
- Valore scientifico: Permette una valutazione affidabile degli effetti dei composti sul rilascio di biomarcatori endogeni in un microambiente controllato di fluido interstiziale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea alla scoperta traslazionale di biomarcatori identificando proteine e purine upregolate nel trasudato cardiaco ischemico.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica mantenendo la rilevanza fisiologica del modello cardiaco isolato.
- Valore scientifico: Supporta decisioni di avanzamento corrette per il rischio collegando la composizione del fluido interstiziale ai processi di infiammazione e rigenerazione miocardica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello del cuore invertito si integra nei flussi di lavoro di scoperta precoce fornendo informazioni meccanicistiche che guidano la selezione delle target e le decisioni di ottimizzazione dei composti promettenti prima delle campagne di screening fenotipico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il campionamento diretto del liquido interstiziale contenente molecole di segnale.
- Screening: Permette la preparazione per i saggi generando campioni standardizzati di trasudato adatti alla quantificazione mediante HPLC dei metaboliti purinergici.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di proteine e metaboliti che consentono analisi comparative tra condizioni di controllo e stati patologici.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica catturando biomarcatori rilevanti nei modelli di infarto miocardico e di danno da riperfusione.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la validazione di bersagli cardiovascolari in diversi ambiti terapeutici coinvolti nella segnalazione paracrina.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle reti di segnalazione paracrina cardiaca.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità attraverso la raccolta controllata di fluidi in condizioni di perfusione definite.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo accesso diretto a biomarcatori endogeni che riflettono l'interazione con il bersaglio in sistemi rilevanti per la malattia.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei candidati cardiovascolari in base alla modulazione di biomarcatori meccanicistici nel fluido interstiziale, adeguata al rischio.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze nella perfusione di Langendorff e nella chirurgia cardiaca per l'isolamento del cuore e la cannullazione retrograda.
- Richiede strumentazione specializzata, inclusi trasduttori di pressione, cateteri a palloncino e sistemi di raccolta con controllo termico.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro delle procedure di gestione, elaborazione e analisi dei fluidi (ad esempio, BCA, HPLC, 2D DIGE) per ottenere risultati riproducibili.
- Comporta la necessità di adattamenti quando si applica il modello a diverse condizioni cardiache (ad esempio, ischemia-riperfusione, infiammazione), al fine di mantenere la rilevanza fisiologica.
- Presenta limitazioni pratiche, come tassi variabili di raccolta del trasudato (17–147 µL/min) e un grado di diluizione rispetto all'effluente venoso coronarico (0,1–1%), che possono influenzare la sensibilità di rilevamento degli analiti.
