Name: 単離されたラット心臓からのインタースティシャル透過性収集のための逆心モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぶラット心臓の逆心モデルを用いた心臓間質液採取法。Langendorff灌流とラテックスキャップを用いて、心筋細胞間コミュニケーションに関わるパラクリン因子を含む間質液を収集する技術です。

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この研究は、NSFC 81570244、FoKo 23/2013、およびSFB 1116 / B01および心臓血管研究所デュッセルドルフ（CARID）によって資金提供された。

すべての実験は、地方の規制当局（ LANUV of Nordrhein-Westfalen、Germany）によって承認され、動物使用のガイドラインに従って実施された。動物に標準食餌を与え、 自由に水道水を与えた 。実験の各ステップに必要なすべての機器および化学物質は、 表の表に記載されています。 1.ラテックスキャップと脳室内バルーンの準備<ol><li>ラットの心臓の平均サイズ（300-350gの体重）に適合するフライス盤を使用してアルミニウムの型を作る。極端な（10/0）エメリー紙で型を磨く。 注記：モールドの詳細なメトリックを図1Aに示します 。 </li><li>アルミモールドのネックをフライス盤に垂直に固定してラテックスキャップを準備する。 注記：フライス盤は金型をゆっくり回転させます。あるいは、電気モータを使用することもできる。 </<html> &gt; <li> 20 mLの液体ラテックス（市販品、 表を参照）を50 mLガラスビーカーに注ぎます。 </li><li>モールドの本体全体がラテックス溶液に浸されるまでモールドを下げます。 </li><li>回転しながら金型をゆっくりと持ち上げます（5 cm /分）。 </li><li>モールドの表面のラテックスが凝固するまで、モールドをさらに15分間回転させ続けます。 </li><li>剥がしている間の損傷を防ぐために、タルク粉末約1gをモールドの表面に加えます（すでに薄いラテックスフィルムで覆われています）。 </li><li>すでに乾燥されたラテックスキャップを指先でカビ表面から静かに取り外します。ラテックスキャップはすぐに使用できる状態になります（ 図1B ）。 </li><li>ラテックスキャップの出口を15 cmシリコンチューブ（ID = 0.2 mm）に接続し、後でCTの収集に使用します。 </li><li>心室ラテックスバルーンを水で満たし、1mLの水で満たされたシリンジに接続されたL字形の金属カニューレにしっかりと固定する。&gt;図1C）。 注：これは、心臓の直立した位置を保証するために使用されます（下記参照）。 </li><li>添付の1 mLシリンジで数回の収縮/膨張試験を行うことにより、バルーンが気密であることを確認します。 </li><li>心房発達圧の将来の測定のために、カニューレを三方停止装置を介して圧力変換器に接続する（ 図1C ）。 </li></ol> Krebs-Henseleit Buffer（KHB）およびLangendorff灌流システムの調製<ol><li>一定流量（ローラーポンプで駆動）または定圧（ガラスカラムでの静圧で生成）モードのいずれかを使用して、Langendorff灌流システムをセットアップします。 注：Langendorff心臓準備の詳細は、以前に記載されています12 。 </li><li> 修飾されたKHB（mM単位：116.02 NaCl、4.63 KCl、1.10 MgSO 4・7H 2 O、1.21 K 2 HPO 4 </su2.52CaCl 2・2H 2 O、24.88NaHCO 3、8.30D-グルコース、および2.0ピルビン酸ナトリウム）を含む。 <ol><li> CaCl 2以外のすべての化学物質を秤量し、2Lフラスコ中で1.8Lの二重蒸留水に溶解する。 </li><li>磁気撹拌下で、カルバゲン（95％O 2 /5％CO 2 ）で少なくとも5分間平衡化（pH：7.4）するために培地を泡立てる。 </li><li> 0.74gのCaCl 2・ 2H 2 Oを加え、二回蒸留水で全量を2Lにする。 </li><li>培地をさらに5分間、撹拌し、カルベーゲンで泡立てる。 </li><li> 0.2μmフィルターを通してKHBをろ過して、心臓の微小循環を妨害し得る小さな粒子を排除する。 </li></ol></li><li> ランゲンドルフ灌流システムの準備。 <ol><li>ろ過したKHBを予め温めた水浴（38℃）に入れる。 100cmH 2 O insidの圧力を発生させるためにカルボゲンを泡立たせ続けるKHB貯水池。 </li><li>リザーバーをガラスカラムに接続して、KHBによるランゲンドルフ灌流のために100cmH 2 O静水圧を確立する。 carbogenでカラム内にKHBをバブリングし続けます。 </li><li>大動脈カニューレの出口の温度が37℃になるように加温システムの温度を調整する。 </li><li>配管システムにバブルがないことを確認してください。 </li><li> KHB中のPO 2が500〜600mmHg（血液ガス分析器で測定）に達するまで、カルボゲンでKHBをさらに5分間酸素化する。 </li></ol></li><li>灌流システムを、100cmH 2 Oの一定の圧力で、または手動切り替えを用いて約10〜20mL /分の一定流量で実行するように設定する。あるいは、交換可能なSTHポンプコントローラを使用して、灌流モードに即座に切り替えることができます。 </li></ol> 3.心の隔離とカニュレーション注：30匹の体重を有する雄Wistarラット心臓のサイズがプレキャストラテックスキャップに合うように0~350gを使用した。ラットは左動脈の結紮（LAD）を50分間行った後、再灌流を行ったか、または偽手術した。心筋梗塞（MI）の誘導のための方法論の詳細は他のところで報告されている13 。梗塞動物における逆心臓実験は、手術後5日目に行った。 <ol><li>動物の保持チャンバー（20L）に接続したイソフルラン気化器（2％V / V）を用いてラットを麻酔する。 </li><li>深い麻酔に達した後、ラットを手術台（温度制御されていない）に移す。 </li><li>鉗子を使用して胸骨のすぐ下の皮膚と筋肉を持ち上げ、肋骨の下縁を重いはさみで切る。 </li><li>細かいハサミを使用して、リブの縁にあるダイアフラムに小さな切れ目を付けます。肋骨を尾側に切断して、胸壁全体のフラップを作る。 </li><li>優しく親指で心をつかむ指および中指を持ち上げ、ゆっくりと持ち上げて、心臓血管をわずかに引き伸ばす。 </li><li>大動脈が完全に露出するまで心臓を切除する。 </li><li> 50mLの氷冷KHB（4℃）を含む100mLビーカーに心臓を置き、それを灌流装置に移す。 </li><li>直ちに、大動脈を介して滴下カニューレに心臓を取り付け、縫合糸（4-0）でしっかりと締め付ける。心臓に入る気泡を避けてください。 </li><li>一定の灌流圧（100cmH 2 O）を加える。あるいは、フル流速（20mL /分で開始）を適用することもできます。 注：胸郭の開口部から灌流カニューレへの心臓の取り付けまでの時間は、経験豊富なオペレーターの手に約3分かかるはずです。 </li></ol> 4.逆心モデル<ol><li>心臓の後壁が正面図になるまで、静かに大動脈カニューレを回転させる。 </li><li>はさみで結合組織を除去する左心房の開口部を露出させ、心室内カニューレ挿入の準備をする。 </li><li>硬質カテーテルに取り付けられた収縮したラテックスバルーンを左心房を介して左心室に挿入する。 </li><li>心室の空洞全体を満たすまでバルーンを膨らませます（膨張したボリュームはシリンジにあらかじめマークされています）。 </li><li>心臓を逆さになるまで反転させ、心室内バルーンカテーテルで心臓を支えます。 </li><li> 図1Cに示されているように、硬質金属カテーテルを備えた心室内バルーンを用いて、逆位心臓を直立位置で機械的に安定化させる。 </li><li>大動脈根の過度のねじれを避けるために、心臓の位置を調整する。 </li><li>拡張期圧を3〜5 mmHgに調整する（心内バルーンで測定; 図1C参照）。 </li><li>心臓の心外膜表面を観察し、小さな液滴が形成されることを確実にする。 </li><li>ラテックスキャップを置く軽く指を使って心臓全体を覆うように押して、心臓の表面に触れる。 </li><li>ラテックスキャップが心室の表面のほとんどを覆っていることを確認してください。 </li><li>静かに1mLシリンジで吸引することによって、キャップとチューブの内部に気泡があればそれを取り除きます。 </li><li> CTを出しているチューブの遠位開口部を、心臓の水平レベルの10cm下に調整する。 注：この手順では負の静水圧によるわずかな吸引が保証されます。 </li><li> NaClで1：1に混合した氷中に置いた1.5mLの採集管にCTの滴を集める。約0.15-1.5mLのCTを収集する。 注：氷/ NaCl混合物は、採取チューブ内の温度をゼロ（約-4℃）以下に安定化させます。 注：サンプリング時間は実験目的によって異なります。 CTの流速は、偽手術動物（n = 3）では約27±20μL/分であり、冠動脈結紮動物（n = 11）では100±47μL/分である。 </li><li> CTサンプルを秤量しスナップフリーズする液体窒素中で保存し、その後の測定のために-80℃で保存する。 </li></ol> 5. CTの分析<ol><li>科学的な質問に応じて、代謝産物の分析にCT液を使用します。 注： 図2および図3に示すデータは、定圧灌流（100cmH 2 O）から収集し、約0.15〜1.5mLのCT液を10分以内に収集した。この時間と量は、様々なプリンのプロテオーム（最小：50μL; 図2 ） 14およびHPLC（最小：20μL; 図3 ）分析に十分であった。 </li></ol>

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<li>Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+transudate+concentration+of+adenosine+and+inosine+in+rat+and+guinea+pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts.</a> Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).</li>
<li>Heller, L. J., Mohrman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+interstitial+adenosine+from+surface+exudates+of+isolated+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).</li>
</ol>

著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

逆心モデルは、十分に確立されたLangendorff心臓灌流技術12に基づいており、心臓を逆さまの位置に単純に反転させ、剛体の心室バルーンカテーテルを使用してこの位置を保持することによって実行される。このようにして、心臓間質液透過物は、心臓9の基部から重力によって滴下する冠状静脈流出物灌流液から物理的に分離することができる。 CTは、心臓全体の表面に配置された薄く柔軟なラテックスキャップによって連続的に収集することができる。 この方法は、Langendorff装置に加えて、最小限のコストで実施が容易である。それにもかかわらず、再現可能で安定した結果を得るためには、技術的に重要なステップがあります。これには、ラテックスキャップが心臓の形状に適切に適合し、心房ではなく心室の表面の約90％を覆うことが含まれます。 excからの時間長時間の虚血が心臓代謝および心臓攣縮の形成のリスクを負うので、3分未満でなければならない。心室内バルーンによって測定される拡張期左心室圧は、心室腔（3-5mmHg）を...

心不全（HF）は、世界中のヒトの主要死因である1 。 HFは、心筋炎、心筋への虚血性傷害、および左心室リモデリングのためにしばしば起こり、心臓の収縮機能および患者の生活の質が漸進的に悪化する。心臓病および心臓手術の進歩はHFの死亡率を著しく低下させるが、重大な病的状態を伴う必然的に進行する疾患プロセスの一時的な遅延因子として機能するだけである。したがって、有効な治療の現在の欠如は、HFを予防または逆転することができる新規な分子標的を同定する必要性を強調している。これには、細胞外マトリックスの変化、制御されない心臓免疫応答、および心臓と非心臓の細胞との相互作用が含まれる2 。 心臓の細胞がdirecにさらされる微環境負傷した心臓の免疫応答および再生応答を形成する。単離された生理食塩水灌流心臓において、CTは、生理学的および病態生理学的条件下で、間質液空間（ すなわち微小環境）に由来する小さな液滴の形態で心臓表面上に生成される3,4,5 。したがって、CT（ すなわち、間質液）の分析は、心臓の代謝および収縮機能を調節する因子を同定するか、または損傷した心臓に移動した後に免疫細胞の機能に影響を与える因子を同定するのに役立ち得る。潜在的に、これは、HFの治療のための新規治療戦略の開発につながる可能性がある。 マウスの心臓からのCTの収集は技術的に困難です。通常のランゲンドルフ灌流心臓では、CTの独占的収集は困難である。なぜなら、CTとコロナ静脈流出物の灌流液は、間質腔から放出された代謝産物/酵素の濃度を予測して希釈する。この制限を克服するための1つの可能な戦略は、肺にカニューレを挿入し、同時に肺静脈を結紮することによって静脈流出液を排除することである。しかしながら、この方法は、肺動脈および静脈のカニューレ挿入および結紮に伴う困難に直面し、静脈流出液の心臓滲出液への潜在的な漏出を引き起こす。逆心モデルを使用するという概念は、隔離された灌流された心臓を逆さまにし、心外膜表面に薄いラテックスキャップを置き、静脈流出物の汚染なしに連続的にCTをサンプリングするKammermeierのグループによって初めて導入された8,9 。この手順を使用して、CTは、心臓9から放出された代謝産物の非常に敏感な尺度を提供することが示されたが、脂肪酸8 、およびウイルス粒子10の毛細管移動を含む。 より最近では、局所免疫応答を調節し、心血管新生を増大させるパラクリン因子が、心臓病の幹細胞に基づく治療の有益な効果に関与している。逆心臓におけるCTの分析は、これらの個々のパラクリン因子を化学的に同定するのに役立ち得る。さらに、CTは、心臓における免疫細胞のインビボ活性化に関与する因子を同定するのに役立ち得る。 本明細書で提供される、心臓表面からのCT収集の詳細な説明は、免疫細胞、線維芽細胞、内皮細胞および心筋細胞の全体的な心機能との相互作用を研究する研究者にとって実験的に有用である。上述したように、間質液は、心臓内の細胞間通信のための情報を運び、whCTの収集によって簡便に評価することができる。逆心臓からCTを収集する方法のビデオプロトコルを含む詳細な技術的説明は、この独特な技術の将来の適用を容易にするはずである。

<table><tbody><tr><td>ラテックス溶液</td><td>ProChemie</td><td>Z-ラテックスLA-TZ</td><td>http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz</td></tr><tr><td>アルミ金型</td><td>自家製</td><td>-</td><td>リバースハートモデル</td></tr><tr><td>ユニバーサルオーブンメン</td><td>メルト</td><td>UNB 400</td>リバース<td>ハートモデル</td></tr><tr><td>ラテックスバルーン</td>ヒュー<td>ゴサックス</td><td>サイズ4</td>リバース<td>ハートモデル</td></tr><tr><td>フライス盤</td><td>Proxxon</td><td>MF70</td><td>逆心臓モデル</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>SZBD0810V</td><td>化学薬品</td></tr><tr><td>炭酸水素</td>ナトリウム <td>Roth</td><td>68852</td><td>化学薬品</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>メルク</td><td>49361</td><td>化学薬品</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム 七水和物</td><td>メルク</td><td>58861</td><td>化学薬品</td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>メルク</td><td>48731</td><td>化学薬品</td></tr><tr><td>D(+)-グルコース無水メル</td><td>ク</td><td>83371</td><td>化学薬品</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Fluka</td><td>21097</td><td>化学</td></tr><tr><td>薬品バランス</td><td>VWR</td><td>SE 1202</td><td>計量化学薬品</td></tr><tr><td>二重蒸留水</td><td>ミルポア</td><td></td> <td>- 溶解薬品</td></tr><tr><td>医療圧力トランスデューサ</td><td>ゴールド</td><td>-</td><td>ランゲンドルフ装置</td></tr><tr><td>医療用フロープローブ</td><td>遷音速</td><td>3PXN</td><td>ランゲンドルフ装置</td></tr><tr><td>暖房循環バス</td><td>Haake&nbsp;</td><td>B3 ;DC1</td><td>ランゲンドルフ装置</td></tr><tr><td>実験室および真空チューブ</td><td>タイゴン</td><td>R-3603</td><td>ランゲンドルフ装置</td></tr><tr><td>動物研究 流量計</td><td>トランソニック</td><td>T206</td><td>ランゲンドルフ装置</td></tr><tr><td>PowerLab データ収集装置</td><td>AD機器</td><td>チャート 7.1</td><td>ランゲンドルフ装置</td></tr><tr><td>LabChart データ収集ソフトウェア</td><td>AD機器</td><td>チャート7.1</td><td>ランゲンドルフ装置</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>グリゾン</td><td>MINIPULS 3</td><td>ランゲンドルフ装置</td></tr><tr><td>ガラス ウォーターカラム</td><td>自家製</td><td>-</td><td>ランゲンドルフ装置</td></tr><tr><td>ウォーターバス保護剤</td><td>VWR</td><td>462-7000</td><td>ランゲンドルフ装置</td></tr><tr><td>滅菌済み使い捨てフィルター (0.2 & micro;m)</td><td>Thermo Scientific</td><td>595-4520</td><td>ランゲンドルフ装置</td></tr><tr><td>血液ガス分析装置</td><td>放射計</td><td>ABL90 FLEX PLUS</td><td>ガス分析器</td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td></td><td>VWR UN1170</td><td>洗浄&nbsp; チューブ</td></tr><tr><td>100% エタノール</td><td>メルク</td><td>64-17-5</td><td>洗浄チューブ</td></tr><tr><td>Wistar Rats</td><td>Janvier-Animals</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ステンレスハサミ</td><td>AESCULAP</td><td>BC702R</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>ステンレスハサミ</td><td>AESCULAP</td><td>BC257R</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>大型鉗子</td><td>AESCULAP</td><td>-</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>8m/m ステンレス鉗子</td><td>F.S.T</td><td>11052-10</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>超微細 (10/0) エメリーペーパー</td><td>3M</td><td>051111-11694</td><td>リバースハートモデル</td></tr></tbody></table>

単離されたラット心臓からのインタースティシャル透過性収集のための逆心モデル

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

本プロトコルは、単離された生理食塩水灌流ラット心臓からの心臓通過液（CT）の収集を可能にする独自のアプローチを記載している。 Langendorff技術による心臓の単離および逆行灌流の後、心臓は逆さまの位置に反転され、左心室に挿入されたバルーンカテーテルによって機械的に安定化される。次に、薄いラテックスキャップ（ラットの心臓の平均サイズと一致するように予めキャスト）を心外膜表面に配置する。ラテックスキャップの出口は、シリコンチューブに接続されており、遠位開口部は心臓の基底レベルより10cm下にあり、わずかな吸引力を生じさせる。心外膜表面上で連続的に産生されたCTを、さらなる分析のために氷冷バイアル中に集める。 CT形成速度は、対照および梗塞心臓では17〜147μL/分（n = 14）であり、これは冠動脈静脈流出液灌流液の0.1〜1％に相当する。プロテオーム分析および高PERFO液体クロマトグラフィー（HPLC）は、収集されたCTが広範囲のタンパク質およびプリン代謝産物を含むことを明らかにした。

<html>逆心モデルは、単離された再潅流されたラット心臓（ 図 1A〜C）における心臓間質液透過物の収集を可能にする。 100cmH 2 Oの一定の圧力で灌流すると、間質液形成速度は、17〜147μL/分の範囲であり、孤立した心臓の冠状静脈流出物の0.1〜1％に及んだ。 ビシンコニン酸（BCA）アッセイで測定したCTのタンパク質含量は、1.08±0.40mg / mL（n = 6）であることが判明した。一次元ゲル電気泳動分析（SDS-PAGE）は、心臓の透過液中に存在する広範囲のタンパク質を明らかにした（ 図2A ）。 50分間の虚血/再灌流を受けた心臓からのCTについて、二次元蛍光差異ゲル電気泳動（2D-DIGE）を行った。図に示すように<html>図2Bに示すように、いくつかのタンパク質が虚血心臓のCTにお...

このプロトコルは、単離され、灌流されたラット心臓から心臓間質液を収集する方法を記載している。冠状静脈流出液灌流液から間質液透過液を物理的に分離するために、Langendorff灌流心臓を反転させ、心臓表面上に形成された経液透過液（間質液）を軟質ラテックスキャップを用いて収集する。

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. ...

この倒立心臓モデルの全体的な目的は、摘出したラット心臓から心腔間質浸出液を回収することです。拍動する心臓内では、個々の心臓細胞がパラクリン因子を放出し、それらは周囲の間質液空間へと放出されます。間質液空間は、心臓細胞間のコミュニケーションのための情報を運ぶため、極めて重要です。そして、これは梗塞した心筋の炎症および再生条件下において特に重要です。このビデオでは、共同研究者のDing博士とTan博士が、当研究室で行っている、単離灌流ラット心臓の表面から間質液を回収する手法について解説します。ラテックス製の心臓カバー（キャップ）を作成するために、ラットの心臓の平均サイズに適合し、超極細エメリーペーパーで研磨されたアルミニウム製の型を用意します。金型のネック部分をフライス機に垂直に固定し、ゆっくりと回転させ始めます。次に、50 mLのガラスビーカーに20 mLの液体ラテックスを注ぎ、回転している金型をラテックスに浸るまでゆっくりと下げます。その後、ゆっくりと金型を引き上げ、ラテックスが凝固するまでさらに15分間回転させ続けます。このムースを作成し、液状ラテックスをモールド表面に均一に塗布するためには、回転させることが不可欠です。したがって、ラテックスからモールドを引き上げる際は、必ずモールドを回転させてください。ラテックスが乾燥したら、ラテックスへの損傷を防ぐためにタルクパウダーを塗布します。回転を停止させ、型を装置からゆっくりと取り外します。型からラテックスを慎重に剥がします。次に、25 centimeterのシリコンチューブをラテックスキャップの出口に取り付けます。このチューブは、心室間浸出液（CT）を回収するために使用します。次に、1 mLの水で満たしたシリンジに接続されたL字型の金属カニューレに、ラット用心室バルーンをしっかりと取り付けます。そして、ラット用心室バルーンに水を満たします。シリンジを用いてバルーンを数回膨張および収縮させ、気密性が確保されていることを確認してください。次に、3方活栓を介してカニューレを圧力トランスデューサーに接続します。最後に、心室圧を測定する際にバルーンが心室腔を満たす位置に、シリンジに印を付けます。心臓の準備に入る前に、テキストのプロトコルに従ってランゲンドルフ心灌流システムを準備してください。次に、300〜350gの雄性Wistarラットを完全に麻酔し、室温の手術台に移します。習熟すれば、心臓のカニュレーションに至る以下の手順は約3分で完了します。ピンセットを用いて胸骨直下の皮膚と筋肉を持ち上げ、太い剪刀で肋骨の下縁に沿って切開します。次に、精密剪刀を用いて、肋骨縁にある横隔膜に小さな切り込みを入れます。続いて、肋骨を尾側に切り開き、腹側胸壁全体をフラップ状にします。ここで、心臓をそっと掴み、心血管が伸び始めるまでゆっくりと持ち上げます。次に、大動脈が完全に露出するまで心臓を切り出し、50 mLの氷冷KHBを含む100 mLビーカーに心臓を移します。そのまま直ちに心臓を灌流装置へ運び、大動脈をドリップカニューレに装着します。心臓に気泡が入らないよう、4-0縫合糸でしっかりと固定してください。次に、一定の灌流圧または灌流流量を適用します。逆向き心臓のセットアップを構築するには、まず大動脈カニューレをゆっくりと回転させ、心臓の後壁が正面に見えるようにします。その後、結合組織を切除して左心房への開口部を露出させます。次に、心臓をそっと掴み、上下を反転させます。バルーンを脱気した状態で、あらかじめ準備した心室バルーンに心臓を装着し、左心室内に挿入します。これにより、バルーンカテーテルアセンブリを支持体として、心臓が直立した状態で機械的に固定されます。プランジャーを充填線まで押し込み、バルーンを膨らませて心室腔全体を満たします。大動脈根へのストレスが最小限になるように心臓を固定してください。この手順には習熟が必要です。次に、バルーンのゲージを確認し、拡張期圧を3から5 mmHgに調整します。圧力が正しく設定されていれば、心外膜上に小さな液滴が形成されます。続いて、ラテックスキャップを心臓に向かってゆっくりと被せます。最も心室側の表面まで完全に覆われるようにしてください。次に進む前に、キャップ内部に気泡がないか確認します。気泡がある場合は、シリンジを用いて緩やかに吸引し、除去してください。次に、滴下チューブの先端を心臓の10 cm下に配置します。滴下したCTを1.5 mLチューブに回収し、氷と塩化ナトリウムを1:1で混合した氷浴に埋めて、チューブを4 °C以下に保ちます。0.15から1.5 mLのCTを回収し、サンプルの重量を測定した後、液体窒素で急速凍結させます。処理するまで-80°Cで保存します。逆転心モデルを100 cmH₂Oの一定圧で逆灌流した際、冠静脈流出液の1/10から1%を回収することができました。CTのタンパク質含有量をBCA法で測定したところ、平均1.1 mg/mLでした。単純なゲル電気泳動により、広範囲のタンパク質が検出されました。2D DIGEを用い、正常サンプルと50分間の虚血再灌流を施した心臓のサンプルを比較しました。その結果、虚血心臓のCTにおいて、いくつかのタンパク質の発現が上昇していることが判明しました。発現上昇したタンパク質についてプロテオーム解析を行った。また、プリン体にも大きな関心があった。プリン体は、特に虚血性傷害後において、心臓の免疫応答、血管運動緊張、および心機能を調節する重要なシグナル伝達分子である。CTのHPLC分析により、損傷した心臓において多くのプリン体の濃度が上昇していることが示されました。この手順を行う際は、摘出心で形成される心臓内血栓が、生体内条件における実際の組成を完全に再現するわけではないことを念頭に置くことが重要です。

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