Un metodo rapido ed efficiente per sezionare Pupal ali della drosofila adatto per Immunodetections o analisi di PCR

L'obiettivo generale di questa procedura è un metodo rapido ed efficiente per sezionare le ali pupali di Drosophila, adatto per rilevazioni immunologiche o saggi PCR. La procedura qui descritta è stata sviluppata dalla richiesta di trovare un metodo rapido ed efficiente per ottenere campioni di ali di pupa adatti ad eseguire saggi PCR o protocolli di immunorilevazione. Usando un pennello bagnato, rimuovere delicatamente la pupa APF a zero ore dalle fiale di coltura e metterle in nuove fiale per completare il periodo di sviluppo.

Ad esempio, se si utilizza una pupa che è APF di 24 ore, rimarrebbe nella fiala solo 22 ore. A 22 ore, trasferire la pupa sul vetrino del microscopio con il nastro biadesivo aderente. Questo trasferimento potrebbe essere effettuato utilizzando un pennello per evitare di danneggiare la pupa.

La pupa deve essere posizionata formando una fila con i lati dorsali rivolti verso l'alto e le estremità cefaliche rivolte nella stessa direzione. Successivamente, riportare il vetrino del microscopio a una temperatura costante e lasciare che la pupa completi il tempo di sviluppo appropriato. In questo caso, sarebbero 24 ore.

Il vetrino da microscopio con il nastro biadesivo sarà una piattaforma di dissezione transitoria per rimuovere il caso pupale. Durante le due ore sul vetrino del microscopio, la custodia pupale si asciugherà, rendendola facilmente frangibile con una pinza. Il primo passo nella dissezione è rimuovere la pupa dalla carcassa.

Quindi la pupa verrà trasferita su un altro vetrino con del nastro biadesivo aderito. La carcassa verrà lasciata indietro. Questa pupa sarà bloccata con il lato ventrale rivolto verso l'alto, posizionato al centro del nastro.

Prima di eseguire il taglio dell'ala, la pupa deve essere coperta con una soluzione secondo la procedura che utilizza l'immunoistochimica. Questa soluzione sarà afusativa e l'ala sarà liberata dalla cuticola. Usando una pinza, rimuovere delicatamente l'opercolo dalla custodia pupale.

Rompi la custodia con una pinza, facendo una linea lungo il lato della pupa fino all'estremità caudale di essa. Con l'opportuna illuminazione, è possibile visualizzare la forma interna della pupa, creando uno spazio evidente appena sopra la cerniera dell'ala pupale. Questo spazio funge da guida per eseguire l'apertura senza danneggiare la pupa.

Man mano che la custodia viene aperta lateralmente, sarà possibile asportarne delle porzioni, prelevandole dal bordo aperto e portandole sul lato opposto dove il nastro biadesivo le tratterrà. Al termine della dissezione, la pupa sarà quasi nuda. Solo un pezzo di custodia coprirà la punta posteriore.

Con l'aiuto della pinza, spingere delicatamente verso il basso il resto della custodia. Questa mossa solleverà l'estremità interna della pupa, consentendo sia alla testa che al torace di rimanere in una posizione preferenziale per essere attaccati al passaggio successivo. Prendi un nuovo vetrino con del nastro biadesivo e capovolgilo sulla pupa.

Quindi premere leggermente per far aderire la pupa al nastro e far scivolare delicatamente il vetrino per rimuovere la pupa dal resto delle custodie. Capovolgere il vetrino del microscopio. La pupa sarà bloccata sul lato dorsale a livello della testa o dell'area del torace.

Per l'uso immunoistochimico, coprire l'intera pupa nuda con il 4% di paraformaldeide. Dopo 10 minuti di apposta, con l'aiuto delle forbici, praticare una piccola incisione nella regione della cerniera dell'ala o in prossimità di essa. Lasciare che l'afusativo raggiunga l'epitelio dell'ala.

Quindi, dopo cinque minuti, strappare con una pinza dai bordi della cuticola, espandendo il foro e consentendo il rilascio dell'epitelio alare dal sacco cuticolare. Una volta rilasciato il tessuto alare, lasciarlo nella soluzione di paraformaldeide fino al completamento dei 30 minuti di fissazione. Il metodo di dissezione descritto in questo video può essere utilizzato per preparare campioni di alta qualità di ali di pupa di Drosophila provenienti da diversi stadi di sviluppo per molti tipi di tecniche.

Il protocollo potrebbe essere eseguito per sezionare una o più pupe contemporaneamente. Questo aiuta ad accelerare la procedura, rendendo più facile raggiungere un gran numero di ali sezionate. Per rimuovere la pupa nuda dalla custodia aperta, è importante che la punta posteriore sia abbastanza piccola.

Sebbene sia possibile rimuovere una fila di quattro o cinque pupe nude contemporaneamente, non è un punto rilevante, potendo rimuovere quelle rimaste attaccate alla loro custodia in passaggi successivi utilizzando un unico nastro biadesivo. Questa è l'immagine confocale di un'ala APF attiva da 24 a 30 ore. La colorazione mostra l'espressione della proteina patched, il recettore canonico del riccio, i nuclei e i filamenti di actina.

Un processo di dissezione simile potrebbe essere utilizzato per ottenere campioni di ali più grandi per isolare l'mRNA. Questo mRNA può essere utilizzato per sintetizzare il cDNA che può essere utilizzato nelle reazioni di PCR. Qui mostriamo i prodotti ottenuti per rilevare l'espressione di patched e actina.

Il protocollo offre un metodo semplice per ottenere campioni di ali pupali che conservano la morfologia familiare dell'ala. Da queste preparazioni, è possibile ottenere pile di immagini che potrebbero essere proiettate come immagini 2D o 3D per studiare la distribuzione e/o l'arricchimento di proteine durante il differenziamento dell'ala. Un protocollo simile può essere utilizzato per raccogliere un grande campione di ala pupale necessario per sintetizzare il cDNA, una molecola essenziale nelle reazioni di PCR.

Questa procedura fornisce un approccio alternativo e complementare ai metodi già pubblicati per la dissezione dell'ala pupale.