Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

L'obiettivo di questa procedura è isolare e identificare linee cellulari knockout clonali generate da due tipi di editing genomico mediato da CRIPSR/Cas9. Un metodo rileva il knockout proteico causato dall'unione di estremità non omologhe, mentre l'altro rileva le perturbazioni genomiche generate dalla riparazione diretta dall'omologia. Questo metodo è particolarmente utile nel campo della biologia molecolare, dove la generazione di linee cellulari con perturbazioni genetiche è uno strumento importante per sezionare la funzione genica.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo rapido e relativamente ad alto rendimento che può essere facilmente eseguito utilizzando tecniche di biologia molecolare di base. L'unione delle estremità non omologhe introduce piccole delezioni o inserzioni e viene valutata mediante un immunoblot a punti, mentre la riparazione diretta dall'omologia consente perturbazioni più grandi e più precise e viene valutata mediante PCR a colonia. Questo esperimento utilizza cellule T-REx-293 coltivate in terreni DMEM, integrate con il 10% di FBS a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica.

Prima della trasvezione, disporre le cellule su piastre a sei pozzetti e includere un pozzetto per un controllo non trasvecato. Far crescere le cellule a circa il 70% di confluenza. Traspetta le cellule con 2,5 microgrammi di plasmide totale utilizzando un protocollo di trasvezione commerciale.

Per la trasvezione di cellule senza selezione, utilizzare 2,5 microgrammi di plasmide Cas9-sgRNA. Per la trasvezione di cellule con selezione, utilizzare 0,75 microgrammi di Cas9-sgRNA1, 0,75 microgrammi di Cas9-sgRNA2 e un microgrammo di modello di ricombinazione omologa. Incubare le cellule trasvecate e il controllo non trasvecato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 48 ore.

Per le cellule trasvecate con selezione, iniziare la selezione del farmaco trattando le cellule con il farmaco appropriato, che in questo caso è la neomicina. Rimettere la piastra a sei pozzetti nell'incubatore. Osservare le cellule trattate una volta al giorno per verificare i tassi di morte cellulare, fino a quando tutte le cellule del controllo non trasvecato muoiono.

Per isolare le popolazioni clonali, prima far crescere le cellule fino al 100% di confluenza nel pozzetto originale dopo la selezione. Successivamente, effettuare diluizioni seriali delle cellule e contare le cellule. Poiché la corretta generazione di colonie monoclonali è la chiave per ottenere un knockout completo, è necessario prestare attenzione a determinare la diluizione corretta per posizionare le cellule alla densità desiderata.

Una volta determinata la diluizione corretta, inserire le cellule in piastre da 96 pozzetti a una densità di 0,33 celle per pozzetto. Posizionare tre piastre da 96=pozzetti è un buon punto di partenza per garantire l'isolamento di più di un clone corretto. Per un periodo da due a quattro settimane, osserva le colonie fino a quando le colonie non sono visibili all'occhio.

Queste immagini rappresentative mostrano colonie in diversi stadi di crescita. Una singola cella al posto a sedere, celle al quinto giorno e una colonia ben consolidata al giorno 10. Utilizzando un puntale per pipetta sterile, prelevare le colonie visibili con cura e precisione e riposizionarle in nuovi pozzetti per incoraggiare la crescita del monostrato.

Continuare a far crescere le celle a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. I candidati knockout senza selezione vengono sottoposti a screening mediante immunoblot a punti per valutare il prodotto proteico in modo ad alto rendimento. Dopo aver coltivato i singoli cloni fino a una confluenza compresa tra il 50 e il 100%, rimuovere il monostrato di cellule mediante pipettaggio all'interno del pozzetto.

Aliquotare 90 microlitri dei 100 microlitri di volume totale da ciascun pozzetto in una provetta da microcentrifuga pulita. Ai fini di questo video, verranno elaborati solo due campioni. Centrifugare a 6.000 giri/min per cinque minuti, rimuovere il supporto e lisare il pallet di celle in 10 microlitri di tampone di caricamento 1X SDS.

Aggiungere 90 microlitri di nuovo terreno al resto delle cellule nel pozzetto e rimettere la piastra nell'incubatore per continuare la propagazione delle cellule. Pipettare un microlitro di lisato cellulare su una membrana di nitrocellulosa asciutta per formare un punto. Tamponare ogni campione due volte su due membrane separate, creando due modelli identici di campioni.

Bloccare le membrane nel latte al 5% in TBST a temperatura ambiente, con oscillazione, per un'ora. Dopo un'ora, tamponare le membrane con anticorpi primari alla diluizione raccomandata degli anticorpi primari e TBST più il 5% di latte. Su una membrana utilizzare l'anticorpo primario contro la proteina bersaglio, ELAVL1 in questo esperimento.

Sull'altra membrana, utilizzare l'anticorpo primario per una proteina di controllo che non dovrebbe cambiare, qui viene utilizzato PUM2. Incubare a temperatura ambiente per un'ora. Rimuovere la soluzione di anticorpi primari da ogni blot, aggiungere TBST e incubare per cinque minuti.

In questo modo, lavare le macchie tre volte con TBST. Successivamente, aggiungere a ciascuna membrana l'anticorpo secondario coniugato HRP appropriato e tamponare a temperatura ambiente per un'ora. Dopo un'ora, lavare le membrane tre volte con TBST per cinque minuti ogni volta.

Applicare una soluzione di substrato chemiluminescente sulle macchie, seguendo le istruzioni del produttore, e visualizzare le membrane macchiate su un imager digitale a chemiluminescenza. Infine, quantificare le intensità dei punti per le proteine bersaglio e di controllo utilizzando il software appropriato e analizzare i risultati come descritto nel protocollo di testo. I candidati con il marcatore di resistenza selezionabile vengono sottoposti a screening mediante PCR in colonia.

Iniziare questa procedura duplicando le singole colonie in una nuova piastra a 96 pozzetti e facendole crescere al 100% di confluenza per la preparazione dei lisati cellulari. Rimuovere il terreno da una serie di cloni, risospendere le cellule da ciascun pozzetto in 30 microlitri di tampone di estrazione da un kit di preparazione del DNA commerciale e trasferirle in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri. Riscaldare la soluzione a 96 gradi Celsius per 15 minuti, quindi lasciare raffreddare a temperatura ambiente.

Aggiungere 30 microlitri di tampone di stabilizzazione a ciascuna provetta per microcentrifuga e mescolare bene. Per identificare le linee mutanti wild-type e monoalleliche o bialleliche mediante PCR a colonia, progettare due set separati di primer PCR per amplificare le regioni intorno ai bracci di omologia in base all'integrazione riuscita o non riuscita della cassetta di resistenza. Su ciascun lato, utilizzare un primer comune che ricottura all'esterno del braccio di omologia.

Per testare l'allele wild-type, utilizzare il primer comune con il corrispondente primer accoppiato che è complementare alla sequenza endogena che attraversa la regione di omologia. Per verificare la mutazione desiderata, utilizzare il primer comune con un altro primer accoppiato, complementare alla cassetta di resistenza inserita. Per ogni campione da testare, preparare una miscela di reazione contenente quanto segue, 0,5 microlitri di lisato cellulare, 1,25 microlitri di tampone KOD 10X, 0,75 microlitri di solfato di magnesio 25 millimolare, 1,25 microlitri di dNTP millimolari, 0,375 microlitri di primer diretto, 0,375 microlitri di primer inverso, 0,25 microlitri di KOD polimerasi e 7,75 microlitri di acqua.

Eseguire la PCR utilizzando le seguenti condizioni, 95 gradi Celsius per due minuti, seguiti da 25 cicli di 95 gradi Celsius per 20 secondi, temperatura di fusione del primer per 10 secondi e 70 gradi Celsius per 20 secondi per KB. Successivamente, visualizzare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. L'editing del genoma utilizzando l'unione delle estremità non omologhe è stato eseguito per generare linee di knockout ELAVL1 seguite da immunoblot a punti, sondando ELAVL1 e PUM2. I cloni che mostravano poco segnale di controllo sono stati contrassegnati con una X ed esclusi da ulteriori analisi.

I cloni con bassi segnali ELAVL1 sono stati ulteriormente testati mediante western blot. I candidati confermati sono indicati in verde e i candidati invalidati sono indicati in grigio. Questo grafico mostra i rapporti tra ELAVL1 e il segnale proteico in ordine crescente.

Nella maggior parte dei casi, le popolazioni clonali con il segnale ELAVL1 relativo più basso sono state correttamente identificate come knockout. I candidati generati dal metodo di riparazione diretta dall'omologia sono stati sottoposti a screening mediante PCR a colonia e i prodotti PCR sono stati visualizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio. Vengono mostrati i risultati di esempio utilizzando primer che coprono la giunzione di integrazione a monte utilizzando primer interni endogeni e primer interni knockout.

I primer sono stati prima convalidati sia nelle cellule parentali che in cellule selezionate in massa. I risultati di 24 singoli cloni candidati sono mostrati insieme ai pattern di banda attesi per i cloni wild-type, knockout e con delezione monoallelica. Le frecce nere indicano i prodotti di amplificazione corretti, le stelle indicano i cloni knockout biallelici.

Le linee mutanti bialleliche sono state ulteriormente convalidate mediante western blot. L'unione di estremità non omologa utilizza un singolo taglio Cas9 e uno screening indipendente dalla selezione, richiedendo quindi poca preparazione iniziale, e lo screening dei cloni knockout mediante dot blot può determinare rapidamente se una generazione di knockout ha avuto successo. Lo screening basato sulla PCR rileva con precisione i candidati corretti con grandi perturbazioni genomiche generate dalla riparazione diretta dall'omologia.

Queste tecniche consentono ai ricercatori di biologia molecolare di identificare in modo semplice ed efficiente i knockout, consentendo loro di esplorare i processi cellulari normali o disfunzionali utilizzando linee cellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e identificare le linee cellulari knockout clonali generate dall'editing genomico mediato da CRISPR/Cas9