Immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) nelle linee di cellule T delle cellule

L'obiettivo generale di questo protocollo è eseguire in modo efficiente l'immunoprecipitazione della cromatina in linee cellulari di linfociti T murini con un'elevata riproducibilità in un tempo ragionevole, al fine di studiare la distribuzione dei marcatori istonici in regioni genomiche specifiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia della cromatina, con particolare attenzione ai linfociti T, come ad esempio in che modo la struttura della cromatina viene regolata durante la divisione o l'attivazione dei linfociti T. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la frammentazione della cromatina è efficiente e altamente riproducibile.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le condizioni di frammentazione della cromatina sono difficili da stabilire, in quanto i passaggi con fenolo-cloroformio-alcol isoamilo possono risultare complessi. La procedura sarà dimostrata da Francesca Ferrante, studentessa di dottorato nel nostro laboratorio. Nel primo giorno, trasferire le cellule T di topo da una piastra a sei pozzetti a un tubo da 50 millilitri.

Quindi centrifugare le cellule per cinque minuti a 24 gradi Celsius a circa 271 ×g. Dopo aver risospeso il pellet cellulare in 30 millilitri di mezzo di coltura cellulare IMDM, contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer. Raccogliere aliquote di 20 milioni di cellule in nuove provette da 50 millilitri. Quindi aggiungere formaldeide fino a una concentrazione finale dell'1% direttamente nel mezzo di coltura cellulare e incubare a temperatura ambiente per dieci minuti.

Successivamente aggiungere un ottavo del volume di glicina uno molare a pH 7,5 e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per cinque minuti a 24 gradi Celsius e circa 271 × g. Quindi lavare le cellule risospendendo il pellet cellulare in 10 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato e ripetendo la centrifugazione. Lavare nuovamente le cellule con un millilitro di PBS.

Trasferire le cellule risospese in provette da 1,5 millilitro prima della centrifugazione. La frammentazione della cromatina è il passaggio più critico poiché dipende dalla quantità di cellule, dalle provette utilizzate per la sonicazione, dal dispositivo, dal buffer di lisi e dai parametri di frammentazione. Dopo il lavaggio, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di buffer di lisi SGS e incubare sul ghiaccio.

Dopo 10 minuti, trasferire ogni campione in una provetta per sonica. Eseguire quindi la frammentazione utilizzando un ultrasonicatore focalizzato secondo le impostazioni indicate nel protocollo testuale. Dopo la frammentazione, trasferire i campioni in provette da 1,5 millilitri.

Centrifugare per 10 minuti a quattro gradi Celsius e circa 18.000 ×g. Trasferire quindi il soprannatante in nuovi tubi. Raccogliere 50 microlitri per la determinazione dell'efficienza di taglio e congelare rapidamente il lisato tagliato in azoto liquido. Conservare il lisato in aliquote monouso a meno 80 gradi Celsius.

Per determinare l'efficienza di rottura, aggiungere prima 50 microlitri di tampone di eluizione ai 50 microlitri di ciascun lisato frammentato. Incubare le miscele a 65 gradi Celsius durante la notte con agitazione. Il secondo giorno, aggiungere 100 microlitri di tampone TE e quattro microlitri di Rnase A 10 milligrammi per millilitro ai campioni.

Mescolare i campioni e incubare per due ore a 37 gradi Celsius con agitazione. Quindi aggiungere due microlitri di proteinasi K a 20 milligrammi per millilitro a ciascun campione, prima di incubare per due ore a 55 gradi Celsius con agitazione. Successivamente, trasferire ciascun campione in una provetta adatta per l'estrazione con fenolo cloroformio alcol isoamilico.

Maneggiare le provette secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 200 microlitri di fenolo cloroformio alcol isoamilico e agitare le provette. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase superiore in nuove provette.

Ripetere questo processo una volta. Purificare il DNA utilizzando colonne di purificazione seguendo le istruzioni del produttore, con l'eccezione di lavare la membrana due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare il tubo aperto per due minuti a temperatura ambiente per far evaporare l'etanolo residuo.

Per l'eluzione, aggiungere 50 microlitri di acqua sulla colonna e incubare a temperatura ambiente per un minuto. Quindi centrifugare il tubo per un secondo per bagnare adeguatamente la membrana. Incubare la membrana a temperatura ambiente per un minuto prima di eluire il DNA mediante centrifugazione.

Quantificare il DNA purificato mediante fluorimetro utilizzando un kit ad alta sensibilità, seguendo le istruzioni del produttore. Infine, analizzare circa 500 nanogrammi di DNA purificato su un gel di agarosio all'1,8%. E circa un nanogrammo di DNA purificato su un sistema di elettroforesi utilizzando un kit ad alta sensibilità.

Al terzo giorno, diluire un volume di lisato tagliato con cinque volumi di tampone di diluizione. Preclearare il lisato diluito con 30 microlitri per millilitro di perle di agarosio proteina A per 30 minuti, ruotando in frigorifero. Centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius per cinque minuti a circa 750 × g. Raccogliere il 10% del lisato clarificato come campioni di input e conservarli a quattro gradi Celsius.

Successivamente, aliquotare la quantità desiderata del lisato chiarificato in nuovi tubi. Quindi aggiungere gli anticorpi scelti a ciascun tubo ed agitare in rotazione durante la notte a quattro gradi Celsius. Al quarto giorno, aggiungere 40 microlitri di perle di proteina A.

Incubare la miscela per un'ora a quattro gradi Celsius sotto agitazione rotatoria. Lavare le perle con un millilitro di tampone a basso contenuto salino incubando per cinque minuti a quattro gradi Celsius sotto agitazione rotatoria. Quindi centrifugare per tre minuti a quattro gradi Celsius e circa 950 ×g. Ripetere il lavaggio con tampone ad alto contenuto salino, tampone al cloruro di litio e tampone TE.

Quindi aggiungere 110 microlitri di tampone di eluizione ai campioni. Incubarli per 15 minuti a temperatura ambiente, vorticosando i campioni ogni due minuti. Dopo una nuova centrifugazione, trasferire 100 microlitri di sopranatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitro.

Ripetere l'eluzione con 100 microlitri di tampone di eluizione e combinare gli eluiti. Nel frattempo, aggiungere tampone di eluizione ai campioni di input raccolti in precedenza per ottenere un volume finale di 200 microlitri. Incubare tutti i campioni durante la notte a 65 gradi Celsius con agitazione.

Al quinto giorno, aggiungere 200 microlitri di tampone TE a ciascun eluato e otto microlitri di Rnase A a 10 milligrammi per millilitro. Mescolare i campioni prima di incubarli per due ore a 37 gradi Celsius con agitazione. Successivamente, aggiungere quattro microlitri di proteinasi K a 20 milligrammi per millilitro a ciascun eluato prima di incubare per due ore a 55 gradi Celsius con agitazione. Trasferire quindi ciascun campione in una provetta adatta per l'estrazione con fenolo cloroformio alcol isoamilo.

Aggiungere 400 microlitri di fenolo cloroformio alcol isoamilico e agitare i tubi. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase superiore in nuovi tubi e ripetere questo processo una volta. Infine, purificare il DNA utilizzando colonne di purificazione come in precedenza.

Questo risultato rappresentativo della frammentazione di linee cellulari di linfociti T murini mostra una frammentazione efficiente della cromatina. Qui viene mostrato un esperimento rappresentativo di immunoprecipitazione della cromatina in linee cellulari di linfociti T murini. Il promotore del gene di mantenimento gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi è fortemente arricchito per la trimetilazione della lisina quattro sull'istone tre.

E acetilazione della lisina 27 sull'istone tre, ma non per la monometilazione della lisina 4 sull'istone tre. Al contrario, l'enhancer del gene inattivo deltex-1 è fortemente arricchito per la monometilazione della lisina 4 sull'istone tre.

Ma scarsamente arricchito per la trimetilazione della lisina quattro dell'istone tre e per l'acetilazione della lisina 27 dell'istone tre. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di risospendere i precipitati SGS prima della frammentazione dei campioni.

L'idea iniziale per questo metodo è nata durante lo studio della regolazione genica nei linfociti T. Abbiamo scelto i linfociti T perché sono estremamente rilevanti per le applicazioni mediche e rappresentano uno dei sistemi modello meglio caratterizzati per lo studio dell'espressione genica nei eucarioti superiori. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia della cromatina per esplorare la regolazione della cromatina in sistemi mammiferi.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie associate ai linfociti T, poiché consentono l'analisi dell'instaurazione e della regolazione dei programmi di espressione genica dei linfociti T. Non bisogna dimenticare che lavorare con formaldeide, fenolo cloroformio e alcol isoamilioco è estremamente pericoloso e che si devono sempre adottare precauzioni come operare sotto cappa aspirante e indossare idonei dispositivi di protezione individuale durante l'esecuzione di questa procedura. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione della cromatina nei linfociti T del mouse, può essere applicato anche ad altri sistemi, come linee cellulari endoteliali e polmonari.