Name: Immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) nelle linee di cellule T delle cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Impara la tecnica ChIP nelle linee cellulari T murine per studiare le modificazioni istoniche e la regolazione della cromatina durante l'attivazione cellulare. Questo protocollo offre elevata riproducibilità.

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Siamo grati a P. Käse e T. Schmidt-Wöll per un&#39;ottima assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio collaborativa TRR81 e dal programma Heisenberg (BO 1639 / 5-1) della DFG (la Fondazione di ricerca tedesca), della Max Planck Society e della EXC 294 di Friburgo e del Cluster di eccellenza per il sistema cardio-polmonare (ECCPS) a Giessen alla TB

NOTA: Tutti i buffer e il mezzo utilizzato in questo protocollo sono elencati nella tabella 1 . Giorni 1 e 2 1. Incrociare le cellule <ol><li> Trasferire le cellule T da topo da una piastra a 6 pozzetti a un tubo da 50 mL e centrifugare per 5 min a 4 ° C e ~ 271 x g. Resuspendere il pellet cellulare in 30 ml di terreno di coltura cellulare IMDM e contare le cellule utilizzando una camera Neubauer. </li><li> Raccogliere aliquote di 20 x 10 6 cellule in nuovi tubi da 50 ml. </li><li> Aggiungere la formaldeide (FMA) ad una concentrazione finale del 1% direttamente al mezzo di coltura cellulare e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Attenzione: la FMA è tossica se inalato, quindi lavorare sotto una cappa di fumo e indossare attrezzature di protezione adeguate. Inoltre, si prega di gestire i rifiuti FMA secondo le regole dell&#39;istituto ospitante. </li><li> Aggiungere un volume di 1/8 di glicina 1 M, pH 7,0 e incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Pellet le cellule per centrifugazione per 5Min a 4 ° C e ~ 271 xg e lavare con 10 ml di soluzione salina fosfata-tamponata (PBS). </li><li> Lavare il pellet cellulare con 1 ml di PBS e trasferire in tubi da 1,5 ml. </li></ol> 2. Lysis cellulare e cricatura di cromatina <ol><li> Resuspendere il pellet cellulare in 1 ml di tampone di lisi SDS e incubare su ghiaccio per 10 min. </li><li> Trasferire ogni campione in un tubo di sonicazione e eseguire la tranciatura utilizzando un ultrasonicator focalizzato in base alle impostazioni indicate nella tabella 2. </li><li> Dopo il taglio, trasferire i campioni su tubi da 1,5 ml e centrifugare per 10 minuti a 4 ° C e ~ 18,000 x g. </li><li> Trasferire il surnatante ai nuovi tubi. </li><li> Raccogliere 50 μl per determinare l&#39;efficienza di taglio secondo la fase 3 e congelare il lattato tagliato in azoto liquido. Conservare il lisato in aliquote monouso a -80 ° C. </li></ol> 3. Determinazione dell&#39;efficienza di taglio <ol><li> Aggiungere 50 μl di tampone di eluizione al 50 &amp;181 L di ogni lisato tritato e incubare a 65 ° C per una notte, con agitazione. </li><li> Aggiungere 100 μl di tampone TE e 4 μL di 10 mg / mL RNasi A (0,2 μg / μL di concentrazione finale). Mescolare e incubare per 2 ore a 37 ° C, con agitazione. </li><li> Aggiungere 2 μL di 20 mg / mL proteinasi K (0,2 μg / μl di concentrazione finale) ad ogni campione e incubare per 2 ore a 55 ° C, agitando. </li><li> Trasferire ogni campione in un tubo di gel idoneo all&#39;estrazione di fenolo / cloroformio / isoamilico; Maneggiare secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Aggiungere 200 μl di fenolo / cloroformio / isoamilico alcool (25: 24: 1) e scuotere i tubi. Centrifugare per 5 min a 24 ° C e ~ 16.000 xg e trasferire la fase superiore a nuovi tubi. Attenzione: Il fenolo, il cloroformio e l&#39;isoamilico sono tossici se inalizzati e corrosivi; Lavorare sotto un cappuccio e utilizzare adeguate attrezzature di protezione individuale. Inoltre, trattare i residui di fenolo, cloroformio e isoamil acSecondo le regole dell&#39;istituzione ospitante. <ol><li> Ripetere una volta. </li></ol></li><li> Purificare il DNA utilizzando colonne di purificazione secondo l&#39;istruzione del produttore, con le seguenti modifiche: <ol><li> Lavare due volte la membrana. Dopo l&#39;ultimo lavaggio lasciare il tubo aperto per 2 minuti a temperatura ambiente per evaporare l&#39;etanolo residuo. </li><li> Per l&#39;eluizione, aggiungere 50 μl di H 2 O, incubare a temperatura ambiente per 1 min, spin il tubo per 1 s per bagnare correttamente la membrana e incubare a temperatura ambiente per 1 min prima di eluire il DNA per centrifugazione per 1 min 24 ° C e ~ 17.900 x g. </li></ol></li><li> Quantificare il DNA purificato su un fluorometro utilizzando un kit di alta sensibilità secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Analizzare circa 500 ng del DNA purificato su un agarosio di 1,8% e circa 1 ng su un sistema di elettroforesi usando un kit di alta sensibilità. NOTA: il siz attesoE dei frammenti di DNA è compresa tra 200 e 500 bp. </li></ol> Giorni 3 e 4 4. Immunoprecipitazione <ol><li> Diluire 1 volume di lisato tagliato con 5 volumi di tampone di diluizione. </li><li> Preclear con 30 μL / mL di agarosio A di proteina A (preparato in conformità all&#39;Appendice A ) per 30 minuti mentre ruota nella stanza fredda. </li><li> Centrifugare a 4 ° C per 5 minuti a ~ 750 x g. </li><li> Raccogliere il 10% dell&#39;input e conservarlo a 4 ° C. </li><li> Aliquota la quantità desiderata di lisato nei nuovi tubi (per ulteriori dettagli vedere la Tabella 3 ). Aggiungere gli anticorpi desiderati a ciascun tubo (vedere la tabella 3 per i dettagli) e ruotare per una notte a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 40 μL di proteine ​​A e incubare per 1 h a 4 ° C durante la rotazione. </li><li> Lavare le perle con 1 ml di tampone di sale basso, tampone ad alto sale, LiCl buffer e tampone TE (per ogni lavaggio, incubare per 5 minuti a 4 ° C durante la rotazione e centrifugarePer 3 minuti a 4 ° C e ~ 950 xg). Vedere la Tabella 3 per i dettagli. </li><li> Aggiungere 110 μl di tampone di eluizione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, vorticando ogni 2 min. </li><li> Centrifugare per 3 min a 4 ° C e ~ 950 xg e trasferire 100 μL di supernatante in un nuovo tubo da 1,5 ml. </li><li> Ripetere i passaggi 4.7-4.8 con 100 μl di tampone di eluizione e combinare gli eluati. Aggiungere un buffer di eluizione fino a 200 μL per immettere i campioni. </li><li> Incubare tutti i campioni durante la notte a 65 ° C, con agitazione. </li></ol> Giorno 5 5. Purificazione del DNA <ol><li> Aggiungere 200 μl di tampone TE ad ogni eluato e 8 μL di 10 mg / mL RNasi A (0,2 μg / μL di concentrazione finale). Mescolare e incubare per 2 ore a 37 ° C, con agitazione. </li><li> Aggiungere 4 μl di 20 mg / mL proteinasi K (0,2 μg / μL di concentrazione finale) ad ogni eluato e incubare per 2 ore a 55 ° C, con agitazione. </li><li> Trasferire ogni campione in un gelTubo adatto all&#39;estrazione di fenolo / cloroformio / isoamilico; Maneggiare secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Aggiungere 400 μl di fenolo / cloroformio / isoamilico alcool (25: 24: 1) e scuotere i tubi. Centrifugare per 5 min a 24 ° C e ~ 16.000 x g. Trasferire la fase superiore ai nuovi tubi. Attenzione: Il fenolo, il cloroformio e l&#39;isoamilico sono tossici se inalizzati e corrosivi; Lavorare sotto un cappuccio e utilizzare adeguate attrezzature di protezione individuale. Inoltre, trattare i rifiuti di fenolo, cloroformio e alcol di isoamilico secondo le regole dell&#39;istituto ospitante. <ol><li> Ripetere una volta. </li></ol></li><li> Purificare il DNA utilizzando colonne di purificazione secondo le istruzioni del produttore, con le seguenti modifiche: </li><li> Lavare due volte la membrana. Dopo l&#39;ultimo lavaggio lasciare i tubi aperti per 2 minuti a temperatura ambiente per evaporare l&#39;etanolo residuo. </li><li> Per l&#39;eluizione, aggiungere 50 μl di H 2 O, incubare a temperatura ambientePer 1 min, spin i tubi per 1 s per bagnare la membrana in modo adeguato e incubare a temperatura ambiente per 1 min prima di eluire il DNA mediante centrifugazione per 1 min a 24 ° C e ~ 17.900 x g. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

ChIP è una tecnica valida per indagare se le proteine ​​oi loro PTM sono arricchite in regioni genomiche specifiche. I risultati del test di ChIP sono spesso impegnativi per interpretare a causa di motivi biologici o tecnici. Le ragioni biologiche sono molteplici e includono il legame debole o indiretto delle proteine ​​al DNA. Ci sono anche limitazioni tecniche, come la limitata specificità degli anticorpi e la lisi cellulare inefficace o la cricatura di cromatina. Una guida alla risoluzione dei problemi ( Tabella 5 ) può aiutare il lettore a risolvere i problemi che potrebbero verificarsi con i test ChIP. Questo protocollo, facendo uso di un dispositivo ultrasonator focalizzato sul raffreddamento, consente di tagliare in modo efficiente la cromatina di una linea cellulare T cellula matura. La fase principale critica del protocollo è rappresentata dalla tranciatura della cromatina, che deve sempre essere ottimizzata per ciascun tipo di cellula. Si suggerisce di variare il numero di celle e il numero di cicli di sonicazione. Inoltre, lei<html> L&#39;efficienza dell&#39;azione è influenzata negativamente dalla presenza di precipitazioni di SDS nei campioni che possono formarsi durante la lisi delle cellule sul ghiaccio con buffer di lisi SDS. In questo caso, è meglio incubare il campione dopo la lisi a temperatura ambiente per alcuni minuti per ridurre la presenza di precipitazioni SDS. Si raccomanda di ottimizzare il protocollo per ottenere frammenti tagliati tra 200 e 500 bp e valutare sempre la qualità di taglio dei campioni prima di procedere con l&#39;immunoprecipitazione. Inoltre, il tempo di fissazione, la quantità di anticorpo e / o le cellule e le condizioni di lavaggio devono essere ottimizzate per ciascun anticorpo. Un ulteriore passo avanti nella realizzazione di una procedura ChIP è la scelta dell&#39;anticorpo, poiché gli anticorpi a bassa specificità riducono in modo significativo l&#39;efficacia dell&#39;immunoprecipitazione. In precedenza, una procedura di test di qualità unificata ha permesso di valutare la specificità di diversi anticorpi disponibili sul mercato<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. La pipeline di screening è stata basata su macchia dot blot, Western blot e ChIP, fornendo un elenco di reagenti di alta qualità adatti per ChIP 19 . Più recentemente, la specificità di alcuni anticorpi disponibili in commercio è stata valutata usando piattaforme microarray a peptide ad alta densità di istone, consentendo la creazione di un database sulla specificità degli anticorpi 20 . Il lettore può utilizzare questo strumento utile per identificare gli anticorpi più specifici che possono essere utilizzati per gli esperimenti ChIP. Questo protocollo non è stato testato per le cellule T primarie e, in questo caso, il lettore dovrebbe fare riferimento a altri protocolli pubblicati che eseguono con successo ChIP sulle cellule T primarie 3 , 4 , 21 . In particolare, questo protocollo è stato utilizzato con successo per eseguire ChIP su una linea di cellule T progenitor del mouse, così come su una linea cellulare endoteliale. Ove_content &quot;&gt; 5 x 10 6 cellule dovrebbero essere utilizzate per ogni immunoprecipitazione per l&#39;analisi dei segni di istone.Perché questo protocollo può anche essere adatto, con qualche ottimizzazione, per eseguire ChIP su TF o cofattori, è meglio aumentare il numero di cellule Utilizzata per l&#39;immunoprecipitazione in questi casi.Per arrivare al numero di cellule richiesto per ogni esperimento, più aliquote di lutea tagliata possono essere raggruppate insieme prima di diluire la cromatina nel tampone di diluizione. Questo protocollo potrebbe anche essere modificato per eseguire ChIP sulle proteine ​​endogene che non si legano direttamente al DNA. In questo caso, è possibile richiedere la pre-fissazione con crosslinkers proteico-proteico ( ad esempio, dimetiladipimidato, DMA) (vedere l&#39;Appendice B per ulteriori informazioni). La buona prestazione di ChIP sui cofattori è stata precedentemente effettuata mediante sovraespressione di proteine ​​che sono fuse con un tag biotinico. In questo caso, la proteina è stata purificata con streptavidin-conjugaPerline magnetiche, e una pre-fissazione con DMA è stata eseguita 22 .

Lo sviluppo, la differenziazione e l&#39;omeostasi dipendono da specifici programmi di espressione genica che vengono stabiliti mediante segnalazione di eventi che modulano la struttura della cromatina e pertanto determinano se un determinato gene viene attivato o represso in maniera cellulare e temporale. Durante lo sviluppo di cellule T, devono essere stabiliti programmi specifici di espressione genica per determinare correttamente la maturazione dei precursori delle cellule T dal doppio negativo (DN) allo stato singolo-positivo (SP), passando attraverso diverse fasi intermedie 1 . Come il programma di espressione genica è dinamicamente regolato durante lo sviluppo di cellule T è stato ampiamente studiato negli anni precedenti da diversi laboratori 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Con modificazioni post-traduzionali (PTMs) di istoni, lo scambio diIsonici canonici con varianti istone, sfratto nucleosomi e metilazione del DNA regolano l&#39;interruttore ON / OFF dei geni. Diversi gruppi hanno esaminato la distribuzione genoma di PTM e varianti istone per determinare marcature associate a diversi stati di cromatina sia nelle regioni regolatori prossimali che distali 7 , 8 , 9 , 10 . Le cascate di segnalazione orchestrano la regolazione dinamica della cromatina mediante lo scambio di enzimi positivi e negativi che modificano cromatina (noti anche come modificatori di cromatina) ad elementi specifici di potenziamento. Questi modificatori di cromatina regolano la struttura della cromatina e quindi la produzione trascrizionale con, ad esempio, la metilazione dinamica dell&#39;istone e l&#39;acetilazione. Questo è il caso nel percorso di segnalazione Notch 11 , 12 , 13 ,14. Dinamico istone PTMs; Scambi con varianti istone; E l&#39;occupazione dinamica degli istoni, dei fattori di trascrizione e dei cofattori può essere studiata mediante saggi di cromatin immunoprecipitazione (ChIP). Gli anticorpi altamente specifici vengono usati per purificare specifici complessi proteici del DNA e il DNA purificato viene analizzato mediante PCR quantitativo (qPCR); Sequenza profonda (ChIP-Seq); O, meno frequentemente, l&#39;ibridazione a microarray (ChIP-ChIP). I test di ChIP sono talvolta impegnativi a causa di complicanze con la lisi delle cellule, taglio della cromatina e / o bassa specificità degli anticorpi. Sono state adottate diverse strategie per migliorare il protocollo, come avviene per NEXSON 15 . L&#39;uso di sonicatori a bagno d&#39;acqua raffreddato evita il riscaldamento del campione che potrebbe danneggiare gli epitopi presenti sulla proteina in esame, ma l&#39;energia necessaria per la tranciatura dei campioni viene disperdita nell&#39;acqua.Un altro miglioramento è stato fatto con lo sviluppo di dispositivi a ultrasuoni focalizzati che impediscono la dispersione dell&#39;energia. Pertanto, i dispositivi a ultrasuoni focalizzati consentono di migliorare la lisi cellulare e la cricatura, eliminando le variazioni indotte dall&#39;operatore e aumentando notevolmente la riproducibilità. Questo lavoro descrive un protocollo (riepilogo schematico in Figura 1 ) per eseguire in modo efficiente il ChIP delle proteine ​​dell&#39;istone in una linea di cellule T di topi chiamata E2-10HA 16 , 17 . Le cellule T sono di solito difficili da lire e la loro cromatina è stata rivelata inefficiente. In questo protocollo, che utilizza un ultrasonicator raffreddato a raffreddamento, il numero di cellule, il buffer di lisi e l&#39;impostazione di taglio sono stati ottimizzati per la linea di cellule T2 mouse da mouse E2-10HA. Questo protocollo consente di eseguire ChIP con un&#39;elevata riproducibilità e in un tempo ragionevole. In effetti, richiedeCirca due giorni per tagliare la cromatina e valutare la qualità della tranciatura e tre giorni per eseguire l&#39;immunoprecipitazione, invertire il reticolato e purificare il DNA.

<table><tbody><tr><td>Reagenti Agilent D5000 ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent D5000 ad alta sensibilità ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>sistema Covaris S220 AFA</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimetiladipimidato (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fetale siero bovino (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di insulina umana&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Terreno essenziale minimo amminoacidi non essenziali (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProteina A Sefarosio 4 Flusso rapido</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peptone primatone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gel ad aggancio di fase pesante 2&nbsp; mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo/cloroformio/alcol isoamilico (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di proteinasi K (20 mg/mL), RNA grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorimetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Provette per test Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Kit per test Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Senza RNasi A, DNasi e proteasi (10&nbsp; mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Provetta AFA Fibra & Cap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprecipitazione cromatinica (chip) nelle linee di cellule t delle cellule

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

I percorsi di segnalazione regolano i programmi di espressione genica attraverso la modulazione della struttura della cromatina a diversi livelli, ad esempio mediante modificazioni post-traslazionali (PTM) delle code di istone, lo scambio di istoni canonici con varianti istone e lo sfratto nucleosomico. Tale regolazione richiede il legame dei fattori di trascrizione sensibili al segnale (TFs) che reclutano gli enzimi che modificano cromatina agli elementi regolatori definiti come potenziatori. Comprendere come le cascate di segnalazione regolino l&#39;attività di miglioramento richiede un&#39;analisi completa del legame delle TF, degli enzimi che modificano cromatina e l&#39;occupazione di marchi specifici di istone e di varianti istone. I campioni di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) utilizzano anticorpi altamente specifici per immunoprecipitazioni di complessi proteici / DNA specifici. La successiva analisi del DNA purificato consente di identificare la regione occupata dalla proteina riconosciuta dall&#39;anticorpo. Questo lavoro descrive un protocollo in modo efficiente peRform ChIP di proteine ​​di istone in una linea cellulare T-cellule matura. Il protocollo presentato consente di eseguire i test ChIP in un tempo ragionevole e con un&#39;elevata riproducibilità.

Le cellule T murine mature sono state sottoposte ad analisi ChIP per indagare l&#39;arricchimento della mono-metilazione della lisin 4 sulla istone 3 (H3K4me1), tri-metilazione della lisina 4 sull&#39;istone 3 (H3K4me3) e l&#39;acetilazione della lisina 27 Istone 3 (H3K27ac), così come l&#39;occupazione nucleosomica, come rivelato da panH3 ChIP. La qualità di taglio è stata valutata mediante analisi su un agarosio di 1,8% ( Figura 2A ) e su un sistema di elettroforesi ( Figura 2B ). H3K4me1 e H3K4me3 sono generalmente utilizzati per identificare rispettivamente siti e promotori di miglioramento ( Figura 3A ). Infatti, H3K4me3 è prominente ma non solo arricchito nei promotori 5 , 8 , 14 . Una caratteristica di valorizzatori attivi deve essere altamente arricchita per H3K4me1 e H3K27ac e poco arricchita per H3K4me3 (&lt;(Figura 3A, pannello superiore), mentre gli incrementi inattivi presentano bassi livelli di H3K4me3 e H3K27ac, ma livelli elevati di H3K4me1 ( Figura 3A , pannello inferiore). Come mostrato nella figura 3B , il gene Glyceraldehyde 3-fosfato deidrogenasi ( Gapdh ) è rappresentativo dell&#39;analisi di promotori di gene attivi ( promotore di Gapdh ). Infatti, mostra livelli elevati di H3K4me3 e H3K27ac e bassi livelli di H3K4me1. Nella figura 3B , Deltex1 ( Dtx1 ) è rappresentativo di valorizzatori inattivi ( Dtx1 enhancer ), in quanto è altamente arricchito per H3K4me1 e poco arricchito per H3K4me3 e H3K27ac. Il deserto di Gene è rappresentativo di una regione priva di geni di codifica e di solito è stata citata come un controllo negativo per i segni attivi di cromatina. L&#39;osservazione che H3K4me1, un marchio di miglioramento ben accolto 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , non è arricchito nel deserto del Gene suggerisce che questa regione manca di potenziatori. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> Figura 1: Panoramica schematica del protocollo ChIP presentato. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> Figura 2: Controllo della qualità di taglio della linea di cellule T cellule mature. ( A ) Sono state tagliate due aliquote diverse della linea di cellule T-cellule T210HA del mouse, e circa 500 ng di DNA purificato sono state analizzate su un agarosio di 1,8% per valutare il loro taglioQualità. ( B ) 1 ng di DNA purificato del campione 2 è stato analizzato mediante elettroforesi per valutare la sua qualità di taglio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> Figura 3: segni di cromatina che caratterizzano promotori e promotori. ( A ) I potenziatori attivi (pannello superiore) sono caratterizzati da un elevato livello H3K4me1, basso H3K4me3 e alto H3K27ac, mentre i rialzatori inattivi (pannello inferiore) presentano elevati livelli H3K4me1, basso H3K4me3 e basso H3K27ac. ( B ) I campioni presentati nella Figura 2A sono stati raggruppati e utilizzati per l&#39;analisi di ChIP contro i contrassegni istoni H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac e l&#39;occupazione dell&#39;istone, come rivelato da panH3 ChIP. Questa analisi mostra che thE promotore del gene di mantenimento Glyceraldehyde 3-fosfato deidrogenasi ( promoter Gapdh ) è altamente arricchito per H3K4me3 e H3K27ac e abbastanza arricchito per H3K4me1. D&#39;altra parte, l&#39;enhancer del gene inattivo Deltex1 ( Dtx1 enhancer ) è altamente arricchito per H3K4me1 ma poco arricchito per H3K4me3 e H3K27ac. ChIP utilizzando un anticorpo panH3 è stato utilizzato per indagare l&#39;occupazione dei nucleosomi. Il deserto del gene è stato usato come un controllo negativo. Viene mostrato un esperimento rappresentativo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome del buffer </td><td> Reagente </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td rowspan="5"> Tampone di diluizione </td><td> Sodio dodecIl solfato (SDS) </td><td> 0,01% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1,1% (v / v) </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 16,7 mM </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 167 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Soluzione DMA </td><td> Dimetil adipimidato (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Salina di tampone fosfato (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> Tampone di eluizione </td><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Alta tampone di sale </td><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> EthylenediamiAcido nitrutametico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM medium </td><td> Il mezzo di Dulbecco modificato da Iscove (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Siero del bovino fetale (FBS) </td><td> 2% (v / v) </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Peptone primatone </td><td> 0,3 mg / ml </td></tr><tr><td> Soluzione insulinica umana </td><td> 4,8 mg / ml </td></tr><tr><td> Minimo amminoacidi essenziali non essenziali (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> Tampone di sale di LiCl </td><td> Cloruro di litio (LiCl) </td><td> 0,25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Basso buffer di sale </td><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Tampone di lavaggio dei branchi di proteine ​​A Sepharose </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 0,1% (w / v) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Buffer SDS Lysis </td><td> Sodio dodecilsolfato (SDS) </td><td> 1% (w / v) </td></tr><tr><td> EthylenediAcido aminetraacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HCl pH 8.1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE buffer </td><td> Tris-HCl pH 8,0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) pH 8,0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Elenco dei buffer e del mezzo utilizzato in questo protocollo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> SOPRA </td><td> OFF </td></tr><tr><td> Picco di potenza </td><td> 150.0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Fattore di dovere </td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> Cicli / scoppio </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Numero di cicli </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>Tabella 2: Shearing delle impostazioni utilizzate in questo protocollo . Queste condizioni sono state ottimizzate per una linea cellulare T-cellule matura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Anticorpo </td><td> Fornitore </td><td> Quantità di anticorpo / immunoprecipitazione </td><td> Quantità di cellule / immunoprecipitazione </td><td> Condizioni di lavaggio </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una volta in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una volta in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Una volta in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagenode (pAb-174-050) </td><td> 2,5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Oce in tampone di sale basso, due volte nel tampone di sale alto, due volte in tampone di sale LiCl e tre volte in tampone TE </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> Variabile* </td><td> Variabile* </td><td> Variabile* </td></tr><tr><td colspan="5"> * Nel caso del controllo IgG, la quantità di anticorpi e cellule, nonché i passi di lavaggio, devono rispecchiare le condizioni delle altre immunoprecipitazioni. </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Anticorpi e condizioni di lavaggio utilizzate in questo studio. <table border="1" fo:keEp-together.within-page = &quot;1&quot; per: keep-with-next.within-page = &quot;sempre&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gene </td><td> Primer avanti </td><td> Primer inverso </td><td> sonda </td></tr><tr><td> Promotore di Gapdh (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ATTO GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Enhancer Dtx1 (+26 kb) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> Deserto del gene </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: Primer e sonde utilizzate per qPCR in questo studio. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Problema </td><td> Le cause </td><td> Soluzione </td></tr><tr><td rowspan="3"> La cromatina è sotto tosatura e i frammenti sono troppo grandi. </td><td> Sono state utilizzate troppe cellule. </td><td> Ridurre il numero di celle. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Il taglio è troppo basso. </td><td> Aumenta il numero di cicli di taglio. </td></tr><tr><td> Aumenta la potenza di picco di taglio, il fattore di carico e / oi cicli / burst. </td></tr><tr><td rowspan="3"> La cromatina è troppo tesa e i frammenti sono troppo piccoli. </td><td> Sono state utilizzate troppo poche cellule. </td><td> Aumenta il numero di celle. </td></tr><tr><td rowspan="2"> La cesoia è troppo alta. </td><td> Ridurre il numero di cicli di taglio. </td></tr><tr><td> Ridurre la potenza di picco di taglio, il fattore di carico e / oi cicli / burst. </td></tr><tr><td rowspan="11"> Troppo basso di recupero rispetto a meControllo gG e / o controllo negativo (alto sfondo). </td><td> Non è sufficiente cromatina utilizzata per l&#39;esperimento. </td><td> Aumenta la quantità di cromatina. </td></tr><tr><td> Il numero di anticorpi è troppo basso. </td><td> Aumenta la quantità di anticorpo. </td></tr><tr><td> Il numero di anticorpi è troppo elevato. </td><td> Ridurre la quantità di anticorpi. </td></tr><tr><td> L&#39;anticorpo ha bassa specificità. </td><td> Cambiare l&#39;anticorpo. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le condizioni di lavaggio sono troppo severe. </td><td> Ridurre il numero di lavaggi. </td></tr><tr><td> Ridurre la rigidità dei tamponi di lavaggio. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le condizioni di lavaggio non sono abbastanza rigorose. </td><td> Aumenta il numero di lavaggi. </td></tr><tr><td> Aumenta la rigidità dei tamponi di lavaggio. </td></tr><tr><td> Troppo DNA è stato pipettato nel qPCR. </td><td> Ridurre la quantità di DNA pipettata nel qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le condizioni qPCR non sono ottimali. </td><td> Ottimizzare le condizioni qPCR. </td></tr><tr><td> Ridurre il numero di cicli. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Nessun prodotto o prodotto è troppo basso nella reazione qPCR del campione di input. </td><td> Non è stato sufficiente un DNA pipettato nel qPCR. </td><td> Aumenta la quantità di DNA pipettata nel qPCR. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le condizioni qPCR non sono ottimali. </td><td> Ottimizzare le condizioni qPCR. </td></tr><tr><td> Aumenta il numero di cicli. </td></tr><tr><td> Non è sufficiente cromatina utilizzata per l&#39;esperimento. </td><td> Aumenta la quantità di cromatina. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Nessun segnale nel controllo positivo e / o PanH3 ChIP. </td><td> Non è sufficiente cromatina utilizzata per l&#39;esperimento. </td><td> Aumenta la quantità di cromatina. </td></tr><tr><td> Il numero di anticorpi è troppo basso. </td><td> Aumenta la quantità di anticorpo. </td></tr><tr><td> L&#39;antiIl corpo ha una bassa specificità. </td><td> Cambiare l&#39;anticorpo. </td></tr><tr><td> L&#39;eluizione è sub-ottimale. </td><td> Assicurarsi di vorticarsi frequentemente i campioni per mantenere le perle in soluzione. </td></tr></tbody></table> Tabella 5: Risoluzione dei problemi.

Questo lavoro descrive un protocollo per l&#39;immunoprecipitazione cromatina (ChIP) usando una linea cellulare T-cellula matura. Questo protocollo è idoneo per indagare la distribuzione di marchi specifici di istoni in siti specifici di promozione o nel genoma.

Immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) nelle linee di cellule T delle cellule

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è eseguire in modo efficiente l'immunoprecipitazione della cromatina in linee cellulari di linfociti T murini con un'elevata riproducibilità in un tempo ragionevole, al fine di studiare la distribuzione dei marcatori istonici in regioni genomiche specifiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia della cromatina, con particolare attenzione ai linfociti T, come ad esempio in che modo la struttura della cromatina viene regolata durante la divisione o l'attivazione dei linfociti T. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la frammentazione della cromatina è efficiente e altamente riproducibile.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le condizioni di frammentazione della cromatina sono difficili da stabilire, in quanto i passaggi con fenolo-cloroformio-alcol isoamilo possono risultare complessi. La procedura sarà dimostrata da Francesca Ferrante, studentessa di dottorato nel nostro laboratorio. Nel primo giorno, trasferire le cellule T di topo da una piastra a sei pozzetti a un tubo da 50 millilitri.Quindi centrifugare le cellule per cinque minuti a 24 gradi Celsius a circa 271 ×g. Dopo aver risospeso il pellet cellulare in 30 millilitri di mezzo di coltura cellulare IMDM, contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer. Raccogliere aliquote di 20 milioni di cellule in nuove provette da 50 millilitri. Quindi aggiungere formaldeide fino a una concentrazione finale dell'1% direttamente nel mezzo di coltura cellulare e incubare a temperatura ambiente per dieci minuti.Successivamente aggiungere un ottavo del volume di glicina uno molare a pH 7,5 e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per cinque minuti a 24 gradi Celsius e circa 271 × g. Quindi lavare le cellule risospendendo il pellet cellulare in 10 millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato e ripetendo la centrifugazione. Lavare nuovamente le cellule con un millilitro di PBS.Trasferire le cellule risospese in provette da 1,5 millilitro prima della centrifugazione. La frammentazione della cromatina è il passaggio più critico poiché dipende dalla quantità di cellule, dalle provette utilizzate per la sonicazione, dal dispositivo, dal buffer di lisi e dai parametri di frammentazione. Dopo il lavaggio, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di buffer di lisi SGS e incubare sul ghiaccio.Dopo 10 minuti, trasferire ogni campione in una provetta per sonica. Eseguire quindi la frammentazione utilizzando un ultrasonicatore focalizzato secondo le impostazioni indicate nel protocollo testuale. Dopo la frammentazione, trasferire i campioni in provette da 1,5 millilitri.Centrifugare per 10 minuti a quattro gradi Celsius e circa 18.000 ×g. Trasferire quindi il soprannatante in nuovi tubi. Raccogliere 50 microlitri per la determinazione dell'efficienza di taglio e congelare rapidamente il lisato tagliato in azoto liquido. Conservare il lisato in aliquote monouso a meno 80 gradi Celsius.Per determinare l'efficienza di rottura, aggiungere prima 50 microlitri di tampone di eluizione ai 50 microlitri di ciascun lisato frammentato. Incubare le miscele a 65 gradi Celsius durante la notte con agitazione. Il secondo giorno, aggiungere 100 microlitri di tampone TE e quattro microlitri di Rnase A 10 milligrammi per millilitro ai campioni.Mescolare i campioni e incubare per due ore a 37 gradi Celsius con agitazione. Quindi aggiungere due microlitri di proteinasi K a 20 milligrammi per millilitro a ciascun campione, prima di incubare per due ore a 55 gradi Celsius con agitazione. Successivamente, trasferire ciascun campione in una provetta adatta per l'estrazione con fenolo cloroformio alcol isoamilico.Maneggiare le provette secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 200 microlitri di fenolo cloroformio alcol isoamilico e agitare le provette. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase superiore in nuove provette.Ripetere questo processo una volta. Purificare il DNA utilizzando colonne di purificazione seguendo le istruzioni del produttore, con l'eccezione di lavare la membrana due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare il tubo aperto per due minuti a temperatura ambiente per far evaporare l'etanolo residuo.Per l'eluzione, aggiungere 50 microlitri di acqua sulla colonna e incubare a temperatura ambiente per un minuto. Quindi centrifugare il tubo per un secondo per bagnare adeguatamente la membrana. Incubare la membrana a temperatura ambiente per un minuto prima di eluire il DNA mediante centrifugazione.Quantificare il DNA purificato mediante fluorimetro utilizzando un kit ad alta sensibilità, seguendo le istruzioni del produttore. Infine, analizzare circa 500 nanogrammi di DNA purificato su un gel di agarosio all'1,8%. E circa un nanogrammo di DNA purificato su un sistema di elettroforesi utilizzando un kit ad alta sensibilità.Al terzo giorno, diluire un volume di lisato tagliato con cinque volumi di tampone di diluizione. Preclearare il lisato diluito con 30 microlitri per millilitro di perle di agarosio proteina A per 30 minuti, ruotando in frigorifero. Centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius per cinque minuti a circa 750 × g. Raccogliere il 10% del lisato clarificato come campioni di input e conservarli a quattro gradi Celsius.Successivamente, aliquotare la quantità desiderata del lisato chiarificato in nuovi tubi. Quindi aggiungere gli anticorpi scelti a ciascun tubo ed agitare in rotazione durante la notte a quattro gradi Celsius. Al quarto giorno, aggiungere 40 microlitri di perle di proteina A.Incubare la miscela per un'ora a quattro gradi Celsius sotto agitazione rotatoria. Lavare le perle con un millilitro di tampone a basso contenuto salino incubando per cinque minuti a quattro gradi Celsius sotto agitazione rotatoria. Quindi centrifugare per tre minuti a quattro gradi Celsius e circa 950 ×g. Ripetere il lavaggio con tampone ad alto contenuto salino, tampone al cloruro di litio e tampone TE.Quindi aggiungere 110 microlitri di tampone di eluizione ai campioni. Incubarli per 15 minuti a temperatura ambiente, vorticosando i campioni ogni due minuti. Dopo una nuova centrifugazione, trasferire 100 microlitri di sopranatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitro.Ripetere l'eluzione con 100 microlitri di tampone di eluizione e combinare gli eluiti. Nel frattempo, aggiungere tampone di eluizione ai campioni di input raccolti in precedenza per ottenere un volume finale di 200 microlitri. Incubare tutti i campioni durante la notte a 65 gradi Celsius con agitazione.Al quinto giorno, aggiungere 200 microlitri di tampone TE a ciascun eluato e otto microlitri di Rnase A a 10 milligrammi per millilitro. Mescolare i campioni prima di incubarli per due ore a 37 gradi Celsius con agitazione. Successivamente, aggiungere quattro microlitri di proteinasi K a 20 milligrammi per millilitro a ciascun eluato prima di incubare per due ore a 55 gradi Celsius con agitazione. Trasferire quindi ciascun campione in una provetta adatta per l'estrazione con fenolo cloroformio alcol isoamilo.Aggiungere 400 microlitri di fenolo cloroformio alcol isoamilico e agitare i tubi. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase superiore in nuovi tubi e ripetere questo processo una volta. Infine, purificare il DNA utilizzando colonne di purificazione come in precedenza.Questo risultato rappresentativo della frammentazione di linee cellulari di linfociti T murini mostra una frammentazione efficiente della cromatina. Qui viene mostrato un esperimento rappresentativo di immunoprecipitazione della cromatina in linee cellulari di linfociti T murini. Il promotore del gene di mantenimento gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi è fortemente arricchito per la trimetilazione della lisina quattro sull'istone tre.E acetilazione della lisina 27 sull'istone tre, ma non per la monometilazione della lisina 4 sull'istone tre. Al contrario, l'enhancer del gene inattivo deltex-1 è fortemente arricchito per la monometilazione della lisina 4 sull'istone tre.Ma scarsamente arricchito per la trimetilazione della lisina quattro dell'istone tre e per l'acetilazione della lisina 27 dell'istone tre. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di risospendere i precipitati SGS prima della frammentazione dei campioni.L'idea iniziale per questo metodo è nata durante lo studio della regolazione genica nei linfociti T. Abbiamo scelto i linfociti T perché sono estremamente rilevanti per le applicazioni mediche e rappresentano uno dei sistemi modello meglio caratterizzati per lo studio dell'espressione genica nei eucarioti superiori. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia della cromatina per esplorare la regolazione della cromatina in sistemi mammiferi.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie associate ai linfociti T, poiché consentono l'analisi dell'instaurazione e della regolazione dei programmi di espressione genica dei linfociti T. Non bisogna dimenticare che lavorare con formaldeide, fenolo cloroformio e alcol isoamilioco è estremamente pericoloso e che si devono sempre adottare precauzioni come operare sotto cappa aspirante e indossare idonei dispositivi di protezione individuale durante l'esecuzione di questa procedura. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione della cromatina nei linfociti T del mouse, può essere applicato anche ad altri sistemi, come linee cellulari endoteliali e polmonari.

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La differenziazione del Comitato coincide con cellule di tipo specifici cambiamenti nella struttura e nella composizione della cromatina. La rilevazione di questi cambiamenti fornisce preziose informazioni sui meccanismi che definiscono stemcellness e differenziazione cellulare. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) rappresenta un metodo valido per analizzare i meccanismi molecolari alla base della differenziazione delle cellule staminali.

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L'IP-FCM metodo viene presentato, che permette una sensibile, robusto, la valutazione biochimica di natale interazioni proteina-proteina, senza la necessità di ingegneria genetica o di campioni di grandi dimensioni.

IP-FCM: Immunoprecipitazione rilevato mediante citometria di flusso

Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Descriviamo un metodo robusto per immunoprecipitazione della cromatina utilizzando cellule T primarie. Il metodo si basa su approcci standard, ma utilizza uno specifico insieme di condizioni e reagenti che migliorano l'efficienza per una limitata quantità di cellule. Importante, una descrizione dettagliata della fase di analisi dei dati è presentato.

Efficiente immunoprecipitazione della cromatina utilizzando Limitare quantità di biomassa

La combinazione di immunoprecipitazione della cromatina e sequenziamento ultra-high-throughput (ChIP-seq) in grado di identificare e mappare le interazioni proteina-DNA in una determinata linea di tessuti o cellule. Delineato è come generare un modello di chip per la successiva sequenza di alta qualità, utilizzando l'esperienza con il fattore di trascrizione TCF7L2 come esempio.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

Viene presentato un nuovo protocollo per la preparazione della cromatina dal muscolo scheletrico del topo adulto adattato allo studio della regolazione genica nelle fibre muscolari di immunoprecipitazione della cromatina.

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Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l'analisi di modifica dell'istone di genoma di cellula-tipo-specifico.

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Qui descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione efficiente della cromatina (ChIP) seguito da sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) del tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Questo protocollo è adatto sia per mappatura modificazioni istoniche e indagando genoma localizzazione delle proteine non istoniche di interesse in vivo.

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L'immunoprecipitazioni della chromatina (ChIP) è un potente strumento per comprendere i meccanismi molecolari della regolazione genica. Tuttavia, il metodo comporta difficoltà nell'ottenere la frammentazione della cromatina riproducibile mediante tosatura meccanica. Qui, forniamo un protocollo migliorato per un saggio ChIP utilizzando la digestione ezimatica.

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

Questo protocollo si concentra sulla preparazione della cromatina da tessuti congelati a scatto ed è adatto per l'immunoprecipitazione della cromatina reticolante (X-ChIP) seguita da analisi quantitative PCR (X-ChIP-qPCR) o approcci di sequenziamento di nuova generazione (X-ChIP-seq).

Estrazione della cromatina dal tessuto epatico chimerico congelato per l'analisi dell'immunoprecipitazione della cromatina

Impara la tecnica ChIP nelle linee cellulari T murine per studiare le modificazioni istoniche e la regolazione della cromatina durante l'attivazione cellulare. Questo protocollo offre elevata riproducibilità.

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