Indagando von Willebrand fattore patofisiologia utilizzando un modello di flusso di camera di von Willebrand Factor-PIASTRINOGENESI. String

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare e quantificare il fattore di von Willebrand o la formazione di stringhe piastriniche VWF in risposta ai secretagoghi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dei fattori di Von Willebrand e nella fisiopatologia corporea wavo-palliativa. Ci aiuta anche a rispondere alle domande sulle mutazioni che compromettono il rilascio del fattore di von Willebrand e la funzione di legame piastrinico.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che ricapitola le interazioni in vivo tra collagene sub-endoteliale, cellule endoetaliali VWF e piastrine in un sistema visivo e quantificabile in vitro. Ritengo che la dimostrazione visiva di questo metodo sia vitale. Le fasi di microscopia necessarie per catturare la formazione di stringhe piastriniche VWF in più condizioni simultanee in tempo reale possono essere difficili da padroneggiare con il solo testo.

Inizia caricando 0,5 millilitri di tampone di rivestimento in collagene in una siringa luer lock da 1 millilitro. Ruotare l'estremità della siringa sul serbatoio di un vetrino della camera di flusso e premere lentamente lo stantuffo fino a quando l'intera corsia è rivestita e ogni serbatoio è pieno. Rabboccare i serbatoi per assicurarsi che ognuno di essi sia pieno.

Quando tutte le corsie sono state caricate, incubare la camera a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per rimuovere il tampone di rivestimento del collagene. Quindi risciacquare ogni corsia con HBSS, aspirando la soluzione salina con una pipetta da 200 microlitri.

Dopo che il terzo ciclo di HBSS è stato scartato, aggiungere circa tre volte 10 al 6° Cellule endoteliali di crescita del sangue per millilitro in 100 microlitri di terreno di crescita, integrato con il 10% di FBS in ciascuna corsia della camera di flusso. Quindi rimetti la camera nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 24 ore, cambiando il mezzo ogni 8-12 ore. Per assemblare l'apparato di flusso, collegare prima un connettore luer a gomito maschio a un'estremità di ciascuno dei tre pezzi da 70 centimetri di tubo sterile in silicone.

E collegare un adattatore luer lock femmina all'altra estremità di ciascun tubo. Collegare gli adattatori luer lock femmina alle singole siringhe da 20 millilitri e programmare la pompa a siringa. Caricare le siringhe sulla pompa e fissare saldamente le staffe attorno alle siringhe e agli stantuffi.

Quindi, collegare i singoli luer a gomito maschio a entrambe le estremità di tre diversi pezzi da 20 centimetri di tubo in silicone sterile e collegare un ago smussato calibro 18 a uno dei tre luer a gomito. Successivamente, su un microscopio a disco rotante dotato di un tavolino completamente automatizzato, selezionare l'obiettivo 20x e impostare le impostazioni del canale appropriate. Per ottenere l'intera gamma di dati dinamici, impostare il dispositivo accoppiato di carica moltiplicatrice di elettroni su un guadagno di moltiplicazione di elettroni di 150 con un tempo di esposizione di 200 millisecondi.

Regolare la potenza del laser a 491 nanometri al 20% e utilizzare il software del microscopio per contrassegnare il centro di tutte e tre le corsie. Impostare l'intervallo Z su 1,0 micrometri e la dimensione del passo su 0,5 micrometri. Infine, seleziona la durata e l'intervallo per acquisire un'immagine ogni 10 secondi a 60 punti temporali per diapositiva.

Per indurre la formazione di stringhe piastriniche VWF, sostituire il terreno di coltura da tre corsie della camera di flusso, con il solo terreno privo di siero come controllo, quindi lo stimolante di interesse diluito in 100 microlitri di terreno privo di siero alle corsie aggiuntive. Quindi incubare la camera per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine del periodo di stimolazione, lavare tutte e tre le corsie con 100-200 microlitri di PBS e utilizzare clip vascolari per mappare la camera di flusso su un supporto per vetrini.

Collegare un connettore luer maschio dall'estremità di un pezzo di tubo di 70 centimetri a ciascun serbatoio della camera di flusso. E avviare la pompa a siringa per rimuovere il lavaggio PBS. Pipettare ulteriore PBS nel serbatoio della camera di flusso opposto per assicurarsi che le corsie non si asciughino.

Una volta confermato il flusso equivalente, mettere in pausa la pompa a siringa. Collegare una siringa da 5 millilitri con un accoppiatore luer lock femmina al primo connettore luer maschio libero. E immergere l'ago smussato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente una soluzione piastrinica lavata etichettata in modo fluorescente.

Lentamente, aspirare la soluzione piastrinica attraverso il tubo per assicurarsi che non vi siano bolle d'aria all'interno del sistema. Collegare il luer maschio al serbatoio aperto della camera di flusso e caricare le altre due corsie con soluzione piastrinica, come appena dimostrato. Controllare la configurazione del sistema di flusso per assicurarsi che tutte le connessioni siano sicure.

Riavviare la pompa a siringa e visualizzare il flusso piastrinico per 10 minuti al buio. Quindi scollegare il luer dal tubo di aspirazione sul serbatoio della camera di flusso. E riempi il serbatoio con PBS per mantenere un flusso salino delicato sul monostrato di cellule endoteliali.

Per quantificare la formazione di stringhe piastriniche VWF, acquisire 10 immagini per vetrino da ciascuna corsia senza sovrapposizioni dal centro del vetrino. Quando tutte le immagini sono state ottenute, aprire il software di elaborazione delle immagini e fare clic su immagine, regolazione e contrasto luminosità. Per regolare la luminosità della prima immagine, trascinare la barra di scorrimento fino a quando le piastrine aderenti possono essere visualizzate abbastanza bene per la quantificazione.

Quindi, registrare una stringa di piastrine VWF quando si osservano tre o più piastrine allineate e contare tutte le stringhe nell'immagine. Dopo l'inizio delle condizioni di flusso, le cellule non trattate mostrano pochissime stringhe piastriniche VWF rispetto alle cellule trattate con istamina o PMA. Che presentano una media di due o tre stringhe per campo visivo.

Inoltre, gli istoni, che attivano le piastrine e le cellule endoteliali, inducono la produzione di più stringhe piastriniche VWF rispetto ai controlli non trattati, o stimolati con istamina o PMA. Durante il tentativo di questa procedura, mantenere le piastrine quiescenti fino all'esperimento di flusso scartando la prima provetta di raccolta del prelievo di sangue, mantenendo tutti i reagenti a temperatura ambiente e utilizzando una tecnica di pipettaggio delicata. È possibile apportare modifiche a questa procedura per valutare la formazione di stringhe piastriniche VWF in presenza di leucociti, agenti attivanti piastrinici o dissoluzione di stringhe da parte dell'atomo dell'enzima di scissione TS13.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la formazione di stringhe piastriniche VWF indotta dal secretogogo e il modello di camera di flusso in vitro.