Name: Scansione retrovirale: Mappatura dei siti di integrazione MLV per definire regioni regolatori specifiche per le cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Impara a mappare i siti di integrazione di vettori retrovirali derivati da MLV nelle cellule umane per identificare regioni regolatorie specifiche. Questo metodo supporta studi di terapia genica e regolazione genica.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio europeo della ricerca (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), Ministero italiano dell&#39;istruzione, delle università e della ricerca (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), il Ministero della Salute italiano (Giovani ricercatori Chiamata 2011 GR-2011-02352026) e la Fondazione Imagine Institute (Parigi, Francia).

1. MLV Trasduzione di cellule umane <ol><li> Isolare le cellule bersaglio e trasportarle con un vettore retrovirale derivato da mlV che ospita il gene del reporter eGFP e pseudotipizzato con vescicolare Stomatite Virus G (VSV-G) o la glicoproteina dell&#39;amfotropo 16 . <ol><li> Tenere le cellule mock transduced come un controllo negativo per le analisi seguenti. Poiché i vettori retrovirali basati su mLV possono trasducere cellule divide in modo efficiente, coltivare la popolazione delle cellule bersaglio in condizioni che stimolano la divisione cellulare. Le condizioni di trasduzione devono essere specificamente ottimizzate per ciascun tipo di cellule in studio. Le condizioni di crescita cellulare e di trasduzione per i progenitori ematopoietici umani, le cellule T e le cellule epidermiche sono descritte nei riferimenti 7, 14, 15 e 17. </li></ol></li><li> 48 h dopo la trasduzione, risospendere 100.000 cellule in 300 μL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) contenente 2% di siero fetale fetale e misurare l&#39;espressione eGFP per fBassa analisi citometrica (laser di eccitazione 488 nm). Utilizzare le cellule mock transduced come controllo negativo. Per ottimizzare il recupero di siti di integrazione, purificare le cellule GFP + mediante Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). </li><li> Raccogliere da 0,5 a 5 milioni di cellule per la preparazione del DNA genomico. È preferibile un periodo di coltura più lungo (&gt; 7 giorni) per diluire il provirio non integrato e necessario analizzando la progenie a lungo termine delle cellule staminali bona fide (cfr . Sezione Discussione e riferimento 15 ). Le pellicole cellulari possono essere congelate e conservate a -80 ° C fino all&#39;uso. </li></ol> 2. Amplificazione dei siti di integrazione di mLV tramite PCR mediati da linker (LM-PCR) <ol><li> Preparazione del DNA genomico (gDNA) <ol><li> Estrarre il gDNA utilizzando un kit di estrazione del DNA basato sulla colonna e seguire il protocollo per le cellule colte, secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Enzima di restrizione digestisopra <ol><li> Impostare 4 digestioni di enzimi di restrizione per campione in tubi da 1,5 ml. Digest 0.1 - 1 μg gDNA in ogni tubo aggiungendo 1 μL di Tru9I (10U) e 1 μL di Tampone M in un volume finale di 10 μL. Incubare le reazioni a 65 ° C per 6 ore o durante la notte. </li><li> Aggiungere ad ogni reazione 1 μl di PstI (10U), 1 μl di Tampone H e 8 μl di acqua. Incubare le reazioni a 37 ° C per 6 ore o durante la notte. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all&#39;uso. </li></ol></li><li> Ligation del linker <ol><li> Preparare una soluzione di base di linker Tru9I da 100 μM in un tubo da 1,5 mL mescolando il linker più filo e linker minus strand oligonucleotidi a una concentrazione di 100 μM. Mettere il tubo in un set di acqua a 100 ° C e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. La soluzione di titanio Tru9I può essere conservata a -20 ° C fino all&#39;uso. </li><li> Impostare 8 reazioni di legatura del linker in tubi da 1,5 ml. Per ogni reazione, aggiungere il seguente componenteS fino a 10 μL di digestione enzimatica di restrizione: 1,4 μL di 10X T4 DNA Ligase Reaction buffer, 1 μl di 10 μM di linker Tru9I, 1 μL (2.000U) di T4 DNA ligasi e 0.6 μL di acqua. Incubare a 16 ° C per 3 a 6 h. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all&#39;uso. </li></ol></li><li> Primo PCR <ol><li> Impostare 48 reazioni PCR (6 reazioni da ogni tubo di legatura) in 0,2 mL tubi. Per ogni PCR, aggiungete i seguenti reagenti a 2 μL di reazione di legame: 5 μL di tampone PCR 10X, 2 μL di 50 mM di solfato di magnesio, 1 μl di 10 mM deoxynucleotide (dNTP) Mix, 1 μl di primer di collegamento 10 μM, 1 ΜL di 10 μM mLV-3 &#39;LTR primer, 0,3 μL (1,5U) di Taq DNA Polimerasi e 37,7 μl di acqua. Le sequenze di primer sono fornite nella tabella 1. </li><li> Eseguire la reazione PCR in un cycler termico con coperchio riscaldato, come segue: 95 ° C per 2 min; 25 cicli di 95 ° C per 15 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 1 min; 72 °; C per 5 min; Tenere a 4 ° C. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all&#39;uso. </li></ol></li><li> Secondo PCR <ol><li> Impostare 48 reazioni PCR (1 da ogni tubo &quot;primo PCR&quot;) in tubi da 0,2 mL. Per ogni PCR, aggiungere i seguenti componenti a 2 μL della prima reazione PCR: 5 μL di tampone PCR 10X, 2 μL di 50 mM di solfato di magnesio, 1 μL di 10 mM dNTP Mix, 1 μl di primer nidificato 10 μM, 1 ΜL di primer nidificato 10 μM mLV-3 &#39;LTR, 0,3 μl di Taq DNA Polymerase (1,5 U) e 37,7 μL di acqua. Utilizzare primer nidificati progettati per la specifica strategia di sequenza massiccia scelto: (i) primer nidificato con linker e primer nidificato con mLV-3 &#39;LTR compatibile con la piattaforma Illumina; (Ii) primer nidificato con linker e primer nidificato mLV-3 &#39;LTR compatibile con la piattaforma Roche. Le sequenze di primer sono elencate nella tabella 1 . </li><li> Eseguire la reazione PCR in un cycler termico con coperchio riscaldato, come segue: 95 ° C per 2 min; 25Cicli di 95 ° C per 15 s, 58 ° C per 30 s, 72 ° C per 1 min; 72 ° C per 5 min; Tenere a 4 ° C. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all&#39;uso. </li><li> Raccogliere le 48 reazioni PCR nidificate in un tubo da 15 mL (volume finale di ~ 2,4 mL). I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all&#39;uso. </li></ol></li><li> Determinare la presenza e la dimensione dei prodotti LM-PCR mediante elettroforesi di agarosio. <ol><li> Aggiungere 4 μl di buffer di caricamento a 20 μL di prodotti LM-PCR e caricare il campione su un gel di agarosio al 1%, insieme ad una scala del DNA a 100 bp. Eseguire il gel a 5 V / cm per 30-60 minuti e visualizzare i prodotti PCR con colorazione di bromuro di etidio. </li><li> Eseguire una reazione LM-PCR dal campione trasfusibile come controllo negativo. </li></ol></li><li> Precipitare gli ampliconi aggiungendo 0,1 volumi di soluzione di acetato di sodio (3 M, pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Mescolare e congelare a -80 ° C per 20 minuti. <ol><li> Spin al fuVelocità in una microcentrifuga standard a 4 ° C per 20 minuti. Scartare il surnatante e lavare il pellet con il 70% di etanolo. Girare a piena velocità in una microcentrifuga standard a 4 ° C per 5 min. </li><li> Scartare il supernatante e asciugare il pellet. Aggiungere 200 μL di acqua di PCR e riposizionare il DNA. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all&#39;uso. </li></ol></li><li> Aggiungere 20 μl di buffer di caricamento a 100 μL dei prodotti LM-PCR e caricare il campione su un gel agarosico del 1%, insieme ad una scala del DNA da 100 bp. <ol><li> Eseguire il gel a 5 V / cm per 30-60 minuti e tagliare la parte del gel contenente ampliamenti da 150 a 500 bp. </li><li> Purificare i prodotti LM-PCR con un kit di estrazione del gel basato sulla colonna e misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro UV. </li></ol></li><li> Utilizzare 1 μL di libreria per valutare la lunghezza dei prodotti LM-PCR utilizzando uno strumento di bioanalizzatore, secondo le istruzioni del produttore. </li><li><sTrong&gt; La clonazione delle riprese di ampliconi <ol><li> Utilizzare 20 ng dei prodotti purificati LM-PCR e clonarli nel vettore pCR2.1-TOPO, secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Eseguire reazioni di sequenza utilizzando il primer universale M13, seguito da mappe genomiche delle sequenze risultanti, per rivelare la presenza delle giunzioni virali-genomiche (incluso il primer annidato mLTR-3 &#39;LTR) in&gt; 50% dei cloni per identificare campioni adatti Per la sequenza massiccia. Esempio di giunzione virale-genoma: <img alt="Giunzione" src="/files/ftp_upload/55919/55919junction.jpg" /> MLR-3 &#39;LTR primer 454 e primer nidificante linker 454 ( Tabella 1 ) sono indicati in grassetto e l&#39;estremità 3&#39; del LTR virale in corsivo. La sequenza genomica umana è evidenziata in rosso (chr10: 6439408-6439509, hg19). </li></ol></li></ol> 3. Sequencing massiccia dei siti di integrazione mLV NOTA: LM-PCR prodPossono essere sequenziati utilizzando piattaforme commerciali (scegliendo la corretta coppia primer nidificata nella seconda reazione PCR, si veda il paragrafo 2.5.1). Per il sequenziamento della piattaforma pirocedente Roche GS-FLX, fare riferimento ai precedenti articoli 7 , 14 e 15 . In questa sezione viene descritto un protocollo di nuova ottimizzazione per la piattaforma di sequenziamento Illumina. <ol><li> Preparazione alla libreria <ol><li> Impostare 1 reazione PCR di indice per campione in tubi da 0,2 mL. Per ogni PCR, aggiungere i seguenti reagenti a 5 μL (150-170 ng) di prodotto purificato di LM-PCR: 5 μL di Primer 1, 5 μL di Primer 2, 25 μL di Master Mix 2X e 10 μL di PCR- Acqua di qualità. Utilizza una combinazione di indice diversa per ogni campione. </li><li> Eseguire reazioni PCR in un cycler termico con coperchio riscaldato, come segue: 95 ° C per 3 min; 8 cicli di 95 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s; 72 ° C per 5 min; Tenere a 4 ° C. </li><li> Purificare i prodotti PCR usando un protocollo di isolamento a spruzzo in fase solida (SPRI): in nuovi tubi da 1,5 ml aggiungere 56 μL di perle a ciascun campione e procedere seguendo le istruzioni del produttore. Eluire in 25 μl di Tris-HCl 10 mM. Le biblioteche possono essere conservate a -20 ° C fino all&#39;uso. </li></ol></li><li> Controllo della libreria <ol><li> Utilizzare 1 μl di campione per valutare la dimensione della libreria utilizzando uno strumento di bioanalizzatore. </li><li> Utilizzare 1 μl di campione per quantificare la molecolarità della biblioteca usando un test PCR real time basato su fluorescenza, secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Diluizione e sequenza della biblioteca <ol><li> Dilute le librerie a 10 nM usando Tris-HCl 10 mM. Per la raccolta di librerie, trasferire 5 μL di ogni libreria diluita in un nuovo tubo da 1,5 ml e quindi diluire la piscina a 4 nM in Tris-HCl 10 mM. </li><li> Mescolare 5 μL di piscina diluita con 5 μL di 0,2 N NaOH in un nuovo 1,5 mL, vorticare brevemente, spin-down e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per denaturare le librerie. </li><li> Mettere i tubi sul ghiaccio e aggiungere 990 μl di tampone di ibridazione pre-refrigerato (HT1). Aliquota 300 μL di piscina denaturata in un nuovo tubo da 1,5 ml e aggiungere 300 μl di HT1 pre-refrigerato per ottenere una piscina di biblioteca finale di 10 μM. </li><li> Parallelamente, mescolare 2 μl di libreria di controllo PhiX (10 nM) con 3 μL di Tris-HCl 10 mM in un tubo da 1,5 mL. Aggiungere 5 μL di NaOH 0,2 N, vorticare brevemente, spin-down e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per denaturare il PhiX diluito. Mettere il tubo sul ghiaccio e aggiungere 990 μl di HT1 pre-refrigerato. </li><li> Aliquota 300 μL di PhiX denaturato in un nuovo tubo da 1,5 ml e aggiungere 300 μl di HT1 pre-refrigerato per ottenere una PhiX finale di 10 μM. </li><li> In un nuovo tubo da 1,5 ml, mescolare 510 μL di pool di biblioteca denaturato con 90 μL di libreria PhiX denaturato, ottenendo così una piscina finale di 10 pM con il 15% di controllo PhiX. </li><li> Pipettate questi 600 μL di campioneVolume nel serbatoio del campione di carica della cartuccia del reagente di sequenza scongelato e procedere immediatamente per eseguire una singola lettura a 150 cicli. NOTA: i reagenti critici e le sequenze primer necessarie per questo protocollo sono elencati nella tabella 1 . </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Qui abbiamo descritto un protocollo per la mappatura genomica dei siti di integrazione di mLV, un retrovirus che mira alle regioni di cromatina, contrassegnato epigeneticamente come promotori e promotori attivi. I passi critici e / o le limitazioni del protocollo includono: (i) trasduzione mLV della popolazione cellulare target; (Ii) amplificazione di giunzioni virali-host da parte di LM-PCR; (Iii) recupero di un&#39;alta percentuale di siti di integrazione. I vettori retrovirali basati su mLV trasudano in modo efficien...

L&#39;identità cellulare è determinata dall&#39;espressione di set specifici di geni. Il ruolo degli elementi cis-regolatori, come promotori e promotori, è fondamentale per l&#39;attivazione di programmi transcrizionali specifici di tipo cellulare. Queste regioni regolatrici sono caratterizzate da caratteristiche specifiche di cromatina, quali modificazioni peculiari dell&#39;istone, fattori di trascrizione e co-fattori legati e accessibilità cromatica, che sono stati ampiamente utilizzati per la loro identificazione a livello genomico in diversi tipi di cellule 1 , 2 , 3 . In particolare, il profilo genomico di acetilazione della istina H3 lisin 27 (H3K27ac) è comunemente usato per definire promotori attivi, enhancer e super-enhancer 4 , 5 , 6 . Moloney virus della leucemia murina (MLV) è un retrovirus gamma che è ampiamente usato per il geneTrasferimento in cellule di mammiferi. Dopo l&#39;infezione di una cellula bersaglio, il genoma RNA retrovirale viene retro-trascritto in una molecola del DNA a doppio filamento che lega le proteine ​​virali e cellulari per assemblare il complesso di pre-integrazione (PIC). Il PIC entra nel nucleo e lega la cromatina della cellula ospite. Qui, l&#39;integasi virale, un componente chiave del PIC, media l&#39;integrazione del DNA provirale nel genoma delle cellule ospite. MLV nel DNA genomico non è casuale, ma si verifica in elementi cis-regolatori attivi, quali promotori e promotori, in un modo specifico per le cellule 7 , 8 , 9 , 10 . Questo particolare profilo di integrazione è mediato da un&#39;interazione diretta tra l&#39;integrasi di mLV e le proteine ​​cellulodiche del bromodomano e del dominio extraterminale (BET) 11 , 12 , 13 . BET proteine ​​(BRD2, BRD3 eBRD4) agiscono come un ponte tra la cromatina dell&#39;ospite e il mLV PIC: attraverso i loro bromodomi riconoscono regioni cis-regolatori altamente acetilizzate, mentre il dominio extraterminale interagisce con la mLV integrase 11 , 12 , 13 . Qui descriviamo la scansione retrovirale, un nuovo strumento per mappare regioni attive di cis-regolazione in base alle proprietà di integrazione di mLV. In breve, le cellule sono trasdotte con il vettore retrovirale derivato da mLV che esprime il gene reporter del proteine ​​verde fluorescente (eGFP). Dopo l&#39;estrazione genomica del DNA, le giunzioni tra il 3 &#39;lungo ripetizione terminale (LTR) del vettore mLV e il DNA genomico vengono amplificate mediante PCR linker-mediata (LM-PCR) e sequenzialmente massicciamente. MLV sono mappati al genoma umano e le regioni genomiche altamente mirate da mlV sono definite come cluster di siti di integrazione mLV. Scansione retroviraleNing è stato utilizzato per definire elementi regolatori attivi specifici per le cellule in diverse cellule primarie umane 14 , 15 . MlV co-mappati con promotori e valorificatori epigeneticamente definiti, la maggior parte dei quali conteneva segni attivi di istone, come H3K27ac, e erano specifiche per le cellule. La scansione retrovirale permette l&#39;identificazione genetica degli elementi regolatori del DNA nelle popolazioni cellulari prospetticamente purificate 7 , 14 , nonché nelle popolazioni cellulari definite retrospettivamente, come le cellule staminali di cheratinociti, che non dispongono di marcatori efficaci per l&#39;isolamento prospettico15.

<table><tbody><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoScientific</td><td>10010031</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ThermoScientific</td><td>16000044</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Provette da 0,2 ml</td><td>fornitore</td><td></td><td></td>di laboratorio generico</tr><tr><td>Provette da 1,5 ml</td> fornitore <td>di laboratorio</td><td></td><td></td>generico</tr><tr><td>QIAGEN QIAmp DNA mini Kit&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>51306</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi Tampone di reazione</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Linker Plus Filamento oligonucleotide</td><td>fornitore</td><td></td> generale <td>di laboratorio 5'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3' &nbsp; (Grado di purificazione: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Linker Minus Strand oligonucleotide</td> fornitore <td></td><td>generale di laboratorio</td><td>5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Grado di purificazione: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Tru9I</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11464825001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer M</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417983001</td><td></td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>10798991001</td><td></td></tr><tr><td>SuRE/Cut Buffer H</td><td>Roche-Sigma-Aldrich</td><td>11417991001</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polimerasi Alta Fedeltà</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>o acqua di</td></tr><tr><td>grado PCR</td> equivalente fornitore <td></td><td></td>di <td>laboratorio generale</td></tr><tr><td>ciclatore termico a 96 pozzetti (con coperchio riscaldato)</td><td>fornitore</td><td></td><td></td>di laboratorio generale</tr><tr><td>primer linker</td> fornitore <td>di laboratorio</td><td></td> generale <td>5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (Grado di purificazione: grado PCR)</td></tr><tr><td>MLV-3' Primer LTR</td> fornitore <td></td><td>di laboratorio generale</td><td>5'-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3' (Grado di purificazione: grado PCR)</td></tr><tr><td>linker nested primer 454</td> fornitore <td></td><td>di laboratorio generale</td><td>5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Grado di purificazione: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3' LTR nested primer 454</td><td>general lab supplier</td><td></td><td>5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Grado di purificazione: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>linker nested primer Illumina</td><td>general lab supplier</td><td></td><td>5'-TCGTCGGCAGCGTGAGAGAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Grado di purificazione: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>MLV-3' Primer nidificato LTR Illumina</td> fornitore <td></td><td>di laboratorio generale</td><td>5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Grado di purificazione: SDS-PAGE)</td></tr><tr><td>Soluzione di acetato di sodio (3M) pH 5.2</td><td>fornitore</td><td></td><td></td>di laboratorio generale</tr><tr><td>Etanolo (assoluto) per biologia molecolare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Kit di clonaggio Topo TA (con vettore pCR2.1-TOPO)</td><td>Invitrogen</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Bromuro di etidio.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>100 bp DNA ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>6x tampone di carico</td><td>ThermoScientific</td><td>R0611</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001 o FC-131-1002</td><td></td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix&nbsp;</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico dinale per provette da 2 ml</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Kit Agencourt AMPure XP da 60 ml</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl 10 mM, pH 8.5</td><td>fornitore</td><td></td><td></td>di laboratorio generico</tr><tr><td>Agilent 2200 Sistema TapeStation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2964AA</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582</td><td>o</td></tr><tr><td>reagenti D1000</td> equivalenti <td>Agilent Technologies</td><td>5067-5583</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Kit di quantificazione della libreria KAPA per piattaforme Illumina (ABI Prism)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4835</td><td></td></tr><tr><td>ABI Prism 7900HT Sistema di PCR in tempo reale veloce</td><td></td><td>Biosystems applicato 4329003</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 1.0 N, molecolare </td> fornitore <td></td><td></td><td>di laboratorio generale</td> di livello biologico</tr><tr><td>HT1 (tampone di ibridazione)</td><td>Illumina&nbsp;</td>Fornito nel kit <td></td><td>di reagenti MiSeq</td></tr><tr><td>Kit di reagenti MiSeq v3 (150 cicli)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>Sistema MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

scansione retrovirale: mappatura dei siti di integrazione mlv per definire regioni regolatori specifiche per le cellule

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

I vettori retrovirali a base virale di leucemia murina Moloney (MLV) si integrano prevalentemente in promotori e promotori acetilati. Per questo motivo, i siti di integrazione di mLV possono essere utilizzati come marcatori funzionali di elementi regolatori attivi. Qui presentiamo uno strumento di scansione retrovirale, che consente la identificazione genica di promotori e promotori specifici delle cellule. In breve, la popolazione di cellule bersaglio viene trasdotta con un vettore derivato da mLV e il DNA genomico viene digerito con un enzima di restrizione a taglio frequente. Dopo la legatura di frammenti genomici con un linker DNA compatibile, la reazione a catena di polimerasi mediata da linker (LM-PCR) consente l&#39;amplificazione dei giunti del genoma del virus-ospite. La sequenza massiccia degli ampliconi viene utilizzata per definire il profilo di integrazione mLV in tutto il genoma. Infine, sono definiti cluster di integrazioni ricorrenti per identificare regioni regolatori specifiche per le cellule, responsabili dell&#39;attivazione di programmi transcrizionali specifici di tipo cellulare. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Lo strumento di scansione retrovirale consente l&#39;individuazione genomica di promotori e promotori specifici di cellule in popolazioni di cellule bersaglio di tipo prospetticamente isolato. In particolare, la scansione retrovirale rappresenta una tecnica strumentale per l&#39;identificazione retrospettiva di rari popolazioni ( ad esempio cellule staminali somatiche) che non dispongono di marcatori robusti per l&#39;isolamento prospettico.

Flusso di lavoro della procedura di scansione retrovirale Il flusso di lavoro della procedura di scansione retrovirale è schematizzato in Figura 1 . La popolazione delle cellule bersaglio viene purificata e trasfusa con un vettore retrovirale derivato da mLV che esprime un gene reporter del eGFP. Il transgene è affiancato dalle due identiche ripetizioni terminali lunghe (5 &#39;e 3&#39; LTR), garante...

Qui descriviamo un protocollo per la mappatura genomica dei siti di integrazione dei vettori retrovirali basati su virus della leucemia murina Moloney nelle cellule umane.

Scansione retrovirale: Mappatura dei siti di integrazione MLV per definire regioni regolatori specifiche per le cellule

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

L'obiettivo generale di questa procedura è mappare i siti di integrazione di vettori retrovirali derivati dal virus della leucemia murina per definire regioni regolatorie specifiche per cellula. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali negli studi di terapia genica e regolazione genica, come ad esempio in quale punto del genoma umano il vettore si integra e quale elemento regolatorio può essere attivamente utilizzato attraverso un particolare sottotipo. Abbiamo concepito per la prima volta questa metodica osservando che negli studi di terapia genica, i vettori MLV si integrano in promotori ed enhancer attivi e specifici per sottotipo.Iniziare trasducendo le cellule bersaglio con un vettore retrovirale derivato da MLV che contiene il gene reporter EGFP e pseudotipizzato con VSV-G o con la glicoproteina dell'involucro amphotropica. Le cellule trasdotte in modo fittizio vengono utilizzate come controllo negativo. 48 ore dopo la trasduzione, centrifugare i campioni e quindi risospendere 100.000 cellule in 300 microlitri di PBS contenente il due percento di siero fetale bovino.Quindi, misurare l'espressione di EGFP mediante analisi citometrica in flusso. Raccogliere da 0,5 a cinque milioni di cellule transdotte per la preparazione del DNA genomico e la successiva digestione con enzimi di restrizione. Impostare quattro digestioni con enzimi di restrizione per ogni campione in provette da 1,5 millilitri.Digerire da 0,1 a un microgrammo di G-DNA in ogni provetta. Aggiungere 10 unità di TRU91 e un microlitro di buffer M per campione in un volume finale di 10 microlitri. Distribuire due microlitri della miscela in provette per la digestione.Quindi incubare le reazioni a 65 gradi Celsius per sei ore o durante la notte. Al termine dell'incubazione, aggiungere 40 microlitri di acqua in un tubo da 1,5 millilitri. Nello stesso tubo, aggiungere 10 unità di PST1 e un microlitro di buffer H per ogni campione.Distribuire 10 microlitri della miscela di reazione di digestione nei tubi per la digestione. Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per sei ore o durante la notte. Il giorno successivo, preparare otto reazioni di ligazione dei linker in tubi da 1,5 millilitro.Per ogni reazione, aggiungere la miscela di reazione della ligasi a 10 microlitri di DNA genomico digerito. Incubare a 16 gradi Celsius per tre-sei ore. Per la PCR del primo ciclo, preparare 48 reazioni di PCR in provette da 0,2 millilitri.Per ogni PCR, aggiungere la miscela di reazione contenente il primer linker e il primer MLV3 prime LTR a due microlitri della reazione di ligazione. Posizionare i campioni in un termociclatore con coperchio riscaldato. Impostare i parametri di ciclizzazione ed eseguire la prima reazione PCR. Per la PCR del secondo ciclo, preparare la miscela di reazione includendo il primer nested del linker e il primer nested del LTR 3' dell'MLV. Quindi, aggiungere due microlitri del prodotto PCR ottenuto dalla PCR del primo ciclo come stampo. Successivamente, eseguire la reazione PCR del secondo ciclo per generare i prodotti finali di PCR LN.Dopo la PCR del secondo ciclo, raccogliere le 48 reazioni di PCR LM nidificate in un tubo da 15 millilitri. Quindi aggiungere 20 microlitri di buffer di caricamento a 100 microlitri del prodotto PCR LM raccolto e precipitato. Caricare il campione su un gel di agarosio all'uno percento insieme al marcatore di DNA da 100 paia di basi.Eseguire l'elettroforesi a cinque volt per centimetro per 30-60 minuti; una volta risolte le bande, ritagliare la porzione di gel contenente ampliconi lunghi da 500 a 150 paia di basi. Dopo aver purificato il prodotto della PCR LM mediante un kit di estrazione su colonna con gel, misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro UV prima di procedere alla preparazione della libreria. Inoltre, valutare la lunghezza dei prodotti della PCR LM utilizzando uno strumento bioanalizzatore seguendo le istruzioni del produttore.Preparare la libreria impostando una PCR di indicizzazione. Per ogni PCR, utilizzare da 150 a 170 nanogrammi di prodotto PCR LM purificato, con combinazioni di indici diverse per ogni campione. Eseguire la PCR in un termociclatore con coperchio riscaldato come indicato.Dopo la PCR, diluire la libreria purificata a 10 nanomolari con tris HCl 10 millimolari. Successivamente, mescolare cinque microlitri del pool diluito con cinque microlitri di idrossido di sodio 0,2 normali in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Vortexare brevemente, centrifugare e quindi incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per denaturare le librerie.Posizionare i tubi del pool denaturato sul ghiaccio e aggiungere 990 microlitri di tampone di ibridazione HT1 preraffreddato. Quindi, aliquotare 300 microlitri di pool denaturato in un nuovo tubo da 1,5 millilitro e aggiungere 300 microlitri di HT1 preraffreddato per ottenere un pool di libreria finale di dieci picomolari.In parallelo, mescolare 10 nanomolar di libreria di controllo fissata in un volume di due microlitri con 3 microlitri di tris HCl 10 millimolare in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere cinque microlitri di idrossido di sodio 0,2 newton e vortexare brevemente. Dopo aver centrifugato, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per denaturare il fissativo diluito.Dopo l'incubazione, posizionare il tubo sul ghiaccio e aggiungere 990 microlitri di HT1 pre-raffreddato. Ora, aliquotare 100 microlitri di fix denaturato in un nuovo tubo da 1,5 millilitro e aggiungere 300 microlitri di HT1 pre-raffreddato per ottenere una concentrazione finale di 10 picomolari di fix. Infine, in un nuovo tubo da 1,5 millilitro, mescolare 510 microlitri del pool di librerie denaturato con 90 microlitri di libreria fissa denaturata, ottenendo così un pool finale di 10 picomolari con il 15% di controllo di fix da sottoporre a sequenziamento.Questa immagine mostra l'analisi di 3498, 2989 e 4103 cluster di siti di integrazione ricorrenti del virus della leucemia murina (MLV) rispettivamente in cellule staminali progenitrici ematopoietiche, progenitori eritroidi e progenitori mieloidi. In ciascuna popolazione cellulare, oltre il 95% dei cluster di MLV si sovrapponeva a enhancer e promotori definiti epigeneticamente. Le regioni bersaglio specifiche per ogni tipo cellulare erano altamente acetilate e associate all'espressione specifica della cellula del gene bersaglio.Esempi sono il promotore del gene SPINK2 specifico per HSP. La regione di controllo del locus contenente potenti enhancer dei geni della globina simile al beta specifici per gli eritroidi. Enhancer localizzati a monte del gene LYZ specifico per NPP.I saggi del reporter luciferasi hanno convalidato il sottoinsieme di enhancer specifici per la cellula e bersagliati dal MLV in EPP e MPP. Le regioni bersagliate dal MLV specifiche per l'eritroide mostravano un'attività maggiore in EPP rispetto a MPP e viceversa, confermando che il MLV identifica enhancer specifici per la cellula che potrebbero controllare l'espressione di geni vicini. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se effettuata correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di massimizzare la frequenza di cellule transdotte per un recupero ottimale dei siti di integrazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come mappare i siti di integrazione virali, partendo dall'adattamento del DNA genomico, seguito dalla ligazione dei frammenti genomici con un linker di DNA, quindi dall'amplificazione della giunzione tra genoma dell'ospite e genoma virale mediante PCR-LM e infine dal sequenziamento in profondità della libreria di ampliconi.

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Microarray identificazione dei singoli HERV Loci Expression: Domanda di Biomarker Discovery in Cancro alla prostata

Linear-amplificazione mediata (LAM)-PCR è un metodo sviluppato per identificare le posizioni esatte di integrare vettori virali nel genoma. La tecnica si è evoluta per essere il metodo superiore per studiare la dinamica clonali nei pazienti di terapia genica, biosicurezza delle tecnologie innovative vettore, la diversità delle cellule T, modelli di cellule staminali del cancro, ecc...

Linear Amplificazione Mediata PCR - Localizzazione di Genetica Elementi e caratterizzazione di Unknown Aggirare DNA

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Scansione retrovirale: Mappatura dei siti di integrazione MLV per definire regioni regolatori specifiche per le cellule

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