Scansione retrovirale: Mappatura dei siti di integrazione MLV per definire regioni regolatori specifiche per le cellule

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mappare i siti di integrazione di vettori retrovirali derivati dal virus della leucemia murina per definire le regioni regolatorie specifiche delle cellule. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella terapia genica e negli studi di regolazione genica, come ad esempio dove il vettore si integra nel genoma umano e quale elemento regolatorio può utilizzare attivamente attraverso un particolare sottotipo. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta osservando che negli studi di terapia genica, i vettori MLV si integrano in promotori e potenziatori sub specifici attivi.

Iniziare trasducendo le cellule bersaglio con un vettore retrovirale derivato da MLV che ospita il gene reporter EGFP e pseudotipizzato con VSV-G o la glicoproteina dell'involucro antropotopico. Le cellule trasdotte simulate vengono utilizzate come controllo negativo. 48 ore dopo la trasduzione, centrifugare i campioni e quindi risospendere 100.000 cellule in 300 microlitri di PBS contenente il due percento di siero fetale bovino.

Quindi, misurare l'espressione di EGFP mediante analisi metrica del sito di flusso. Raccogliere altri 0,5-5 milioni di cellule trasdotte per la preparazione del DNA genomico e la successiva digestione dell'enzima di restrizione. Impostare quattro digestioni enzimatiche di restrizione per campione in provette da 1,5 millilitri.

Digerire da 0,1 a un microgrammo di G-DNA in ciascuna provetta. Aggiungendo 10 unità di TRU91 e un microlitro di tampone M per campione in un volume finale di 10 microlitri. Erogare due microlitri della miscela nelle provette di digestione.

E poi incubare le reazioni a 65 gradi Celsius per sei ore o durante la notte. Dopo l'incubazione, aggiungere 40 microlitri di acqua in una provetta da 1,5 millilitri. Nella stessa provetta, aggiungere 10 unità di PST1 e un microlitro di tampone H per campione.

Erogare 10 microlitri della miscela di reazione digestiva nelle provette di digestione. Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per sei ore o durante la notte. Il giorno successivo, impostare otto reazioni di legatura del linker in provette da 1,5 millilitri.

Per ogni reazione, aggiungere la miscela di reazione della ligasi a 10 microlitri di DNA genomico della digestione. Incubare a 16 gradi Celsius per tre-sei ore. Per la PCR al primo turno, impostare 48 reazioni PCR in provette da 0,2 millilitri.

Per ogni PCR, aggiungere la miscela di reazione contenente il primer linker e il primer MLV3 prime LTR a due microlitri della reazione di legatura. Posizionare i campioni in un termociclatore con coperchio riscaldante. Impostare i parametri del ciclo ed eseguire il primo ciclo di reazione PCR.

Per il secondo ciclo di PCR, impostare la miscela di reazione che include il primer nidificato linker e il primer nidificato MLV3 prime LTR. Quindi, aggiungere due microlitri del prodotto PCR del primo ciclo di PCR come modello. Quindi, eseguire la reazione PCR del secondo ciclo per generare i prodotti finali della LN PCR.

Dopo il secondo ciclo di PCR, estrarre le 48 reazioni LM PCR nidificate in una provetta da 15 millilitri. Quindi aggiungere 20 microlitri di tampone di carico a 100 microlitri del prodotto LM PCR raggruppato e precipitato. E caricare il campione su un gel di agarosio all'uno per cento insieme alla scala del DNA da 100 coppie di basi.

Far scorrere il gel a cinque volt per centimetro per 30-60 minuti una volta risolte le bande, tagliare la proporzione del gel contenente da 500 a 150 paia di basi lunghe ampliconi. Dopo aver purificato il prodotto LM PCR con un kit di estrazione su gel basato su colonna, misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro UV prima di procedere alla preparazione della libreria. Inoltre, valutare la lunghezza dei prodotti LM PCR utilizzando uno strumento bioanalizzatore secondo le istruzioni del produttore.

Preparare la libreria impostando una PCR di indicizzazione. Per ogni PCR, utilizzare da 150 a 170 nanogrammi di prodotto LM PCR purificato, in una diversa combinazione di indici per ciascun campione. Eseguire la PCR in un termociclatore con coperchio riscaldato come indicato.

Dopo la PCR, diluire la libreria purificata a 10 nanomolari con 10 millimolari tris HCL. Quindi, mescola cinque microlitri di piscina diluita con cinque microlitri di idrossido di sodio da 0,2 newton in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Vorticare brevemente, centrifugare e poi incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per denaturare le librerie.

Posizionare i tubi di piscina denaturata su ghiaccio e 990 microlitri di tampone di ibridazione HT1 pre-raffreddato. Quindi aliquotare 300 microlitri di pool denaturato in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. E aggiungere 300 microlitri di HT1 pre-raffreddato per ottenere una pool di libreria finale di dieci picomolari.

In parallelo, mescolare 10 nanomolari di libreria a controllo fisso in un volume di due microlitri con 3 microlitri di tris HCl da 10 millimolari in una provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere cinque microlitri di idrossido di sodio da 0,2 newton e agitare brevemente. Dopo la centrifuga, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per denaturare il fix diluito.

Dopo l'incubazione, posizionare la provetta sul ghiaccio e aggiungere 990 microlitri di HT1 pre-raffreddato. Ora, aliquotare 100 microlitri di fix denaturato in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e aggiungere 300 microlitri di HT1 pre-raffreddato per ottenere una concentrazione finale di fix di 10 picomolari. Infine, in una nuova provetta da 1,5 millilitri, miscelare 510 microlitri di pool di libreria denaturata con 90 microlitri di libreria fissa denaturata, ottenendo così un pool finale di 10 picomolari con il 15% di controllo fisso da sequenziare.

Questa immagine mostra l'analisi di 3498, 2989 e 4103 cluster di siti di integrazione MLV ricorrenti rispettivamente in cellule progenitrici staminali ematopoietiche, progenitori eritroidi e progenitori mieloidi. In ogni popolazione cellulare, oltre il 95% dei cluster di MLV si sovrapponeva a potenziatori e promotori epigeneticamente definiti. Le regioni bersaglio di MLV specifiche per le cellule erano altamente acetilate e associate all'espressione specifica per le cellule del gene bersaglio.

Esempi sono il promotore del gene SPINK2 specifico per HSP. La regione di controllo del locus contiene potenti potenziatori dei geni della globina beta-simile specifici per eritroidi. Enhancer localizzati a monte del gene LYZ specifico della NPP.

I saggi reporter della luciferasi hanno convalidato il sottogruppo di potenziatori mirati a MLV specifici per cellule in EPP e MPP. Le regioni bersaglio della MLV specifiche per eritroidi avevano un'attività più elevata nell'EPP rispetto alla MPP e viceversa, confermando che la MLV identifica potenziatori specifici per le cellule che possibilmente controllano l'espressione dei geni vicini. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di massimizzare la frequenza delle cellule trasdotte per un recupero ottimale del sito di integrazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come mappare i siti di integrazione virale regolando prima il DNA genomico, quindi legando i frammenti genomici con un linker di DNA, quindi amplificando la giunzione virale del genoma dell'ospite tramite LM PCR e infine sequenziando in profondità la libreria di ampliconi.