Una singola molecola semplice, robusta e alta velocità di trasmissione del flusso Stretching Assay implementazione per studiare il trasporto di molecole lungo DNA

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire un saggio di allungamento del flusso di singole molecole semplice, robusto e ad alto rendimento per studiare il trasporto di molecole lungo il DNA. Ciò si ottiene preparando prima il lambda-DNA marcato con biotina legando un oligo marcato con biotina al lambda-DNA. Il secondo passo consiste nel preparare vetrini coprioggetti funzionalizzati con glicole polietilenico o PEG seguendo un protocollo di reazione in un'unica fase.

Successivamente, viene costruita una cella a flusso ad alta produttività inserendo un nastro biadesivo con canali pretagliati tra un vetrino coprioggetti funzionalizzato PEG e una lastra di polidimetilsilossano o PDMS contenente fori di ingresso e uscita. Il passaggio finale consiste nel tracciare le traiettorie delle singole molecole fluorescenti nel canale di flusso utilizzando l'imaging TIRF o Total Internal Reflection Fluorescence o Time-lapse. Per identificare le traiettorie delle singole molecole che si diffondono lungo il lambda-DNA allungato a flusso, viene utilizzato un software di tracciamento di singole particelle personalizzato affidabile ed efficiente per analizzare le immagini di fluorescenza grezze.

I principali vantaggi di questa configurazione di test rispetto alle alternative sono l'affidabilità della preparazione dei vetrini, la maggiore capacità di produzione, la riduzione del tempo di intervento per la preparazione dei campioni e l'analisi dei dati non supervisionata più snella. A dimostrare la procedura sarà un post-doc nel mio laboratorio, il Dr.Kan Xiong. Prima di iniziare questo test, preparare tutti i reagenti necessari come descritto nel testo del protocollo.

Scaldare 0,5 milligrammi per millilitro di brodo di lambda-DNA a 65 gradi Celsius per 60 secondi e immergerlo subito nel ghiaccio bagnato. Mescolare 100 microlitri della soluzione lambda-DNA con due microlitri di oligo marcato con biotina 10 micromolari all'interno di una provetta per microcentrifuga. Scaldare il composto a 65 gradi Celsius per 60 secondi e poi raffreddare lentamente a temperatura ambiente.

Mettere il composto sul ghiaccio. Aggiungere 11 microlitri di tampone di reazione T4 DNA ligasi e mescolare delicatamente. Quindi due microlitri equivalenti a 800 unità di DNA ligasi T4 e mescolare delicatamente.

Incubare la miscela per due ore a 16 gradi Celsius o per una notte a quattro gradi Celsius. Purificare il prodotto utilizzando provette filtranti centrifughe con un limite di peso molecolare nominale di 100 kilodalton. Sonicare i vetrini coprioggetti numero uno in etanolo al 95% all'interno di un barattolo colorante per 10 minuti e poi risciacquare con acqua ultrapura tre volte.

Riempire il barattolo di colorazione con un idrossido di potassio molare, sonicare di nuovo per 10 minuti, quindi risciacquare tre volte con acqua ultrapura. Ripetere questo ciclo due volte. Asciugare i vetrini coprioggetti sotto un flusso di azoto gassoso pulito e asciutto.

Pulire e asciugare ulteriormente i vetrini coprioggetti eseguendo un trattamento al plasma ad aria a una pressione di 900 millitorr per cinque minuti. Incubare i vetrini coprioggetti con 50 microlitri da 25 milligrammi per millilitro silano-polietilenglicole-biotina disciolti in etanolo al 95% a temperatura ambiente per due ore. Lavare via l'eccesso di polietilenglicole con acqua ultrapura e asciugare i vetrini coprioggetti rivestiti di polietilenglicole sotto un flusso di azoto gassoso pulito e asciutto.

Progetta i canali di flusso utilizzando il software CAD e taglia i canali su un nastro biadesivo utilizzando un taglianastro. Rimuovere i residui di nastro all'interno dei canali. Per realizzare lastre PDMS, mescolare accuratamente 45 grammi di PDMS con cinque grammi di reagente reticolante utilizzando un miscelatore.

Versare il composto in due piastre di Petri da 100 millimetri e lasciare le piastre all'interno di una camera a vuoto per circa 30 minuti fino a quando tutte le bolle d'aria non saranno sparite. Lasciare le stoviglie all'interno di un forno a 80 gradi Celsius per circa due ore fino a quando il PDMS non si solidifica. Ritagliare una lastra PDMS che corrisponda alle dimensioni del nastro biadesivo con canali pretagliati.

Staccare una pellicola protettiva dal nastro biadesivo e farla aderire a un lato piatto della lastra PDMS. Praticare i fori di uscita e di ingresso sulla lastra PDMS utilizzando una perforatrice per biopsia con un ago calibro 23. Staccare l'altra pellicola protettiva dal nastro biadesivo e far aderire alla superficie funzionalizzata del vetrino coprioggetti.

Fissare la cella di flusso assemblata su un inserto del tavolino del microscopio. Caricare tutti i reagenti pre-degassati in serbatoi dotati di un tubo in Tygon collegato a un'elettrovalvola e di un altro tubo collegato a un tubo in PEEK che impedisca il riflusso dei reagenti. Il flusso dei reagenti è controllato da elettrovalvole controllate da un'applicazione di programmazione script.

Adescare un canale di flusso scorrendo nel buffer vuoto. Inserire altri tre tubi in PEEK nei fori di ingresso. Fare attenzione a non indurre la formazione di bolle d'aria all'interno del canale.

Collegare un tubo Tygon con un tubo corto in PEEK dal foro di uscita a un contenitore di scarto del campione. Versare in una soluzione di streptavidina da 0,2 milligrammi per millilitro e incubare per cinque minuti. Quindi versare in un tampone bianco per lavare via la streptavidina non legata.

Far fluire in un milligrammo per millilitro la soluzione di albumina sierica bovina e incubare per un minuto. Quindi fluire in un tampone bianco per lavare via l'albumina sierica bovina non legata. Fluire in 100 soluzioni di biotina-lambda-DNA picomolare e incubare per 10 minuti.

Quindi fluire in un tampone bianco per lavare via i lambda-DNA non legati. Per verificare la qualità del vetrino coprioggetti funzionalizzato PEG, versare il colorante di colorazione del DNA come il colorante SYTOX Orange e avviare l'imaging a fluorescenza. Se la qualità del vetrino coprioggetti è buona, la densità del flusso di lambda-DNA allungato sarà elevata.

Inoltre, regolare l'angolo TIRF per ottenere il più alto rapporto segnale/rumore delle immagini di lambda-DNA allungati quasi completamente a flusso. Per tracciare le traiettorie delle singole molecole, avviare le incubazioni all'interno di un nuovo canale, quindi fondere molecole marcate con fluorofori subnanomolari a una velocità di flusso sufficientemente elevata utilizzando una pompa a siringa e raccogliere immagini di fluorescenza time-lapse con un frame rate di 100 Hertz. In genere vengono raccolti 10.000 fotogrammi in un campo visivo e vengono raccolti filmati da più campi visivi.

Alla fine, fluire nuovamente nel colorante di colorazione del DNA per confermare che il DNA può ancora essere allungato a flusso. Un software personalizzato di tracciamento di singole particelle verrà utilizzato per identificare le traiettorie delle singole molecole che si diffondono lungo il DNA. Il software determinerà prima le posizioni del baricentro di singole particelle con elevata precisione.

Rimuovere le particelle che sono bloccate sulla superficie del vetrino coprioggetti e quindi collegare le particelle in fotogrammi diversi per formare traiettorie time-lapse. Da queste traiettorie verranno stimate le costanti di diffusione 1D. Per avviare l'analisi dei dati, aprire un'applicazione di programmazione script e accedere alla directory del software di tracciamento delle singole particelle.

Aprire uno script denominato largedataprocess3.m. Un parametro importante da definire è il valore di soglia per il rilevamento di singole particelle. Per determinare il valore di soglia ottimale, eseguire il determine_threshold_value.

m script. Questo script visualizzerà in che modo il valore di soglia influisce sul rilevamento di singole particelle. Dopo aver determinato il valore di soglia ottimale, eseguire largedataprocess3.

m script. Dopo il completamento dell'analisi del tracciamento delle singole particelle, le traiettorie grezze verranno filtrate eseguendo il trajectory_filtering. m script.

Un'interfaccia utente grafica o GUI è costruita per visualizzare la fase di filtraggio. Nel pannello GUI, imposta lo spostamento minimo lungo DNA, MinXDisp, su due pixel. Impostare lo spostamento trasversale massimo al DNA, MaxYDisp, su due pixel.

Impostate il numero minimo di fotogrammi, minFrames, su 10. Impostare il numero minimo di stati della tripletta, minTriplets, su 10. Impostare la costante di diffusione minima lungo il DNA, D_par a zero.

Impostare la costante di diffusione massima stimata trasversalmente al DNA, D_trans, a 10 mega coppie di basi al quadrato al secondo. Imposta il parametro statistico minimo, Chi2 Stat, su meno cinque. Impostare il rapporto minimo tra lo spostamento lungo il DNA e quello trasversale al DNA, MinX/Y, a due.

Tutte le traiettorie grezze che superano questi parametri di filtraggio saranno elencate nella tabella uno e quelle che non lo fanno saranno elencate nella tabella tre. Fare clic su un numero di traiettoria nella tabella uno. La traiettoria verrà visualizzata nei grafici uno e due.

Fare clic sul pulsante di riproduzione per riprodurre le immagini a fluorescenza grezze. Fare clic su aggiungi alla tabella2 se questa traiettoria è una traiettoria di scorrimento di una singola molecola. Alla fine, tutte le traiettorie aggiunte alla tabella2 verranno salvate alla chiusura della GUI.

Le traiettorie che hanno superato tutti i passaggi di filtraggio vengono raggruppate insieme da cui verrà stimata la costante di diffusione media. Per calcolare le costanti di diffusione medie, è sufficiente eseguire lo script calculate_mean_diffusion_constant.m. Questa procedura andrà a beneficio di molte persone che studiano la biofisica in vitro di una singola molecola.