Una singola molecola semplice, robusta e alta velocità di trasmissione del flusso Stretching Assay implementazione per studiare il trasporto di molecole lungo DNA

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un saggio semplice, robusto e ad alto rendimento per l'allungamento di singole molecole in flusso, utile per lo studio del trasporto di molecole lungo il DNA. Questo viene realizzato innanzitutto preparando il lambda-DNA marcato con biotina, ligando un oligonucleotide marcato con biotina al lambda-DNA. Il secondo passaggio consiste nel preparare coprioggetti funzionalizzati con polietilene glicole (PEG) seguendo un protocollo di reazione in un unico passaggio.

Successivamente, una cella a flusso ad alta produttività viene costruita inserendo un nastro bifacciale con canali pre-tagliati tra un coprioggetto funzionalizzato con PEG e una lastra di polidimetilsilossano o PDMS contenente fori di ingresso e uscita. L'ultimo passaggio consiste nel tracciare le traiettorie di singole molecole fluorescenti nel canale di flusso mediante acquisizione temporizzata di immagini di fluorescenza a riflessione totale interna o TIRF. Per identificare le traiettorie di singole molecole che diffondono lungo il lambda-DNA allungato dal flusso, si utilizza un software personalizzato affidabile ed efficiente per il tracciamento di singole particelle, al fine di analizzare le immagini grezze di fluorescenza.

I principali vantaggi di questa configurazione del saggio rispetto alle alternative sono l'affidabilità della preparazione del coprioggetto, una maggiore capacità di throughput, un ridotto tempo di manipolazione manuale per la preparazione del campione e un'analisi dati non supervisionata più snella. A dimostrare la procedura sarà un ricercatore post-dottorato del mio laboratorio, il dott. Kan Xiong. Prima di iniziare questo saggio, preparare tutti i reagenti necessari come descritto nel testo del protocollo.

Riscaldare la soluzione madre di DNA lambda a 0,5 milligrammi per millilitro a 65 gradi Celsius per 60 secondi e immergere immediatamente in ghiaccio. Mescolare 100 microlitri della soluzione di DNA lambda con due microlitri di oligonucleotide marcato con biotina 10 micromolare in un tubo da microcentrifuga. Riscaldare la miscela a 65 gradi Celsius per 60 secondi, quindi raffreddare lentamente a temperatura ambiente.

Collocare la miscela sul ghiaccio. Aggiungere 11 microlitri di tampone di reazione della T4 DNA ligasi e mescolare delicatamente. Quindi aggiungere due microlitri corrispondenti a 800 unità di T4 DNA ligasi e mescolare delicatamente.

Incubare la miscela per due ore a 16 gradi Celsius oppure durante la notte a quattro gradi Celsius. Purificare il prodotto utilizzando tubi filtranti centrifughi con un limite nominale di peso molecolare di 100 chilodalton. Sonicare il numero uno di coprioggetti in etanolo al 95% all'interno di un barattolo per colorazione per 10 minuti, quindi risciacquare tre volte con acqua ultrapura.

Riempire il barattolo di colorazione con idrossido di potassio uno molare, sottoporre nuovamente a sonificazione per 10 minuti, quindi risciacquare tre volte con acqua ultrapura. Ripetere questo ciclo due volte. Asciugare i coprioggetti sotto un flusso di gas di azoto pulito e secco.

Pulire e asciugare ulteriormente le lamelle eseguendo un trattamento al plasma d'aria a una pressione di 900 millitorr per cinque minuti. Incubare le lamelle con 50 microlitri di silano-polietilene glicole-biotina 25 milligrammi per millilitro disciolto in etanolo al 95% a temperatura ambiente per due ore. Rimuovere il polietilene glicole in eccesso con acqua ultrapura e asciugare le lamelle rivestite con polietilene glicole sotto un flusso di gas azoto pulito e secco.

Progettare i canali di flusso utilizzando un software CAD e tagliare i canali su un nastro adesivo doppia faccia mediante un taglierino per nastri. Rimuovere i residui di nastro all'interno dei canali. Per preparare lastre di PDMS, mescolare accuratamente 45 grammi di PDMS con cinque grammi di reagente incrociante utilizzando un mescolatore.

Versare la miscela in due piastre di Petri da 100 millimetri e lasciare le piastre all'interno di una camera a vuoto per circa 30 minuti, fino a quando tutte le bolle d'aria saranno scomparse. Lasciare le piastre in un forno a 80 gradi Celsius per circa due ore, fino a quando il PDMS si sarà solidificato. Ritagliare una lastra di PDMS delle stesse dimensioni del nastro bifacciale con canali pre-tagliati.

Rimuovere un film protettivo dal nastro biadesivo e applicarlo su un lato piatto del blocco di PDMS. Praticare i fori di uscita e di ingresso sul blocco di PDMS utilizzando un punch per biopsia con un ago da 23 gauge. Rimuovere l'altro film protettivo dal nastro biadesivo e applicarlo sulla superficie funzionalizzata del coprioggetto.

Fissare la cella a flusso assemblata su un inserto del palchetto del microscopio. Caricare tutti i reagenti pre-degassati in serbatoi collegati a un tubo in Tygon, che a sua volta è connesso a una valvola solenoide, e a un altro tubo collegato a un tubo in PEEK che impedirà il reflusso dei reagenti. Il flusso dei reagenti è controllato da valvole solenoidi comandate da un'applicazione software di programmazione.

Prime una canale di flusso facendo passare un tampone vuoto. Inserire altre tre tubazioni in PEEK nei fori di ingresso. Prestare attenzione a non provocare la formazione di bolle d'aria all'interno del canale.

Collegare un tubo Tygon con un breve tubo in PEEK dal foro di uscita a un contenitore per rifiuti del campione. Far fluire una soluzione di Streptavidina a 0,2 milligrammi per millilitro e incubare per cinque minuti. Successivamente, far fluire un tampone privo di analita per rimuovere la Streptavidina non legata.

Far fluire una soluzione di albumina sierica bovina a un milligrammo per millilitro e incubare per un minuto. Successivamente, far fluire tampone privo di analita per rimuovere l'albumina sierica bovina non legata. Far fluire una soluzione di biotina-lambda-DNA a 100 picomolari e incubare per 10 minuti.

Quindi far scorrere tampone vuoto per rimuovere le lambda-DNA non legate. Per verificare la qualità del coprioggetto funzionalizzato con PEG, far scorrere un colorante per la colorazione del DNA, come il colorante SYTOX Orange, e iniziare l'acquisizione di immagini a fluorescenza. Se la qualità del coprioggetto è buona, la densità delle lambda-DNA allungate per flusso sarà elevata.

Inoltre, regolare l'angolo TIRF per ottenere il rapporto segnale-rumore più elevato nelle immagini di DNA lambda quasi completamente stirato dal flusso. Per tracciare le traiettorie di singole molecole, avviare le incubazioni all'interno di un nuovo canale, quindi introdurre molecole fluorofore-etichettate a concentrazione subnanomolare a una velocità di flusso sufficientemente elevata utilizzando una pompa a siringa e acquisire immagini fluorescenti in time-lapse con una frequenza di acquisizione di 100 Hertz. Tipicamente vengono acquisite 10.000 immagini per campo visivo e vengono registrati filmati da più campi visivi.

Alla fine, far scorrere nuovamente il colorante per la colorazione del DNA per confermare che i DNA possano ancora essere allungati mediante flusso. Un software personalizzato per il tracciamento di singole particelle verrà utilizzato per identificare le traiettorie di singole molecole che diffondono lungo il DNA. Il software determinerà innanzitutto le posizioni del baricentro delle singole particelle con elevata precisione.

Rimuovere le particelle attaccate alla superficie del coprioggetto e quindi collegare le particelle in diverse immagini per formare traiettorie in time-lapse. Da queste traiettorie verranno stimati i coefficienti di diffusione 1D. Per iniziare l'analisi dei dati, aprire un'applicazione per la programmazione di script e accedere alla directory del software di tracciamento di singole particelle.

Aprire uno script denominato largedataprocess3.m. Un parametro importante da definire è il valore della soglia per il rilevamento delle singole particelle. Per determinare il valore ottimale della soglia, eseguire determine_threshold_value.

m script. Questo script mostrerà in che modo il valore della soglia influisce sul rilevamento delle singole particelle. Dopo aver determinato il valore ottimale della soglia, eseguire il programma largedataprocess3.

script. Al termine dell'analisi del tracciamento di singole particelle, le traiettorie grezze verranno filtrate eseguendo lo script trajectory_filtering.m.

Un'interfaccia grafica per l'utente, o GUI, viene creata per visualizzare il passaggio di filtraggio. Nel pannello della GUI, impostare lo spostamento minimo lungo il DNA, MinXDisp, a due pixel. Impostare lo spostamento massimo trasversale rispetto al DNA, MaxYDisp, a due pixel.

Impostare il numero minimo di fotogrammi, minFrames, a 10. Impostare il numero minimo di stati del tripletto, minTriplets, a 10. Impostare la costante di diffusione minima lungo il DNA, D_par, pari a zero.

Impostare la costante di diffusione massima stimata trasversale al DNA, D_trans, a 10 mega coppia di basi al quadrato al secondo. Impostare il parametro statistico minimo, Chi2 Stat, a meno cinque. Impostare il rapporto minimo dello spostamento lungo il DNA rispetto a quello trasversale al DNA, MinX/Y, a due.

Tutte le traiettorie grezze che soddisfano questi parametri di filtraggio verranno elencate nella tabella uno, mentre quelle che non li soddisfano verranno elencate nella tabella tre. Fare clic su un numero di traiettoria nella tabella uno. La traiettoria verrà visualizzata nei grafici uno e due.

Fare clic sul pulsante di riproduzione per visualizzare le immagini di fluorescenza grezze. Fare clic su aggiungi alla tabella2 se questa traiettoria è una traiettoria di scorrimento di una singola molecola. Alla fine, tutte le traiettorie aggiunte alla tabella2 verranno salvate alla chiusura dell'interfaccia grafica.

Le traiettorie che hanno superato tutti i passaggi di filtraggio vengono raggruppate insieme, a partire dalle quali verrà stimata la costante media di diffusione. Per calcolare le costanti medie di diffusione, eseguire semplicemente lo script calculate_mean_diffusion_constant.m. Questa procedura sarà vantaggiosa per molte persone che studiano la biofisica di singole molecole in vitro.