Name: Peptidi e proteine quantificazione utilizzando Automated Immuno-MALDI (iMALDI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Impara a quantificare peptidi e proteine in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia iMALDI automatizzata. Questo metodo sensibile e accurato facilita la diagnosi precoce delle malattie e il monitoraggio della risposta al trattamento.

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Ringraziamo il sostegno finanziario dal Genome Canada e Colombia britannica del genoma per operazioni (204PRO) e lo sviluppo della tecnologia (214PRO) attraverso la rete di innovazioni genoma (GIN). Ringraziamo la piattaforma di Drug Discovery presso l'Istituto di ricerca del McGill University Health Center per l'utilizzo dello strumento MALDI-TOF per le riprese. H.L. è grato per il sostegno da una borsa di studio post-dottorato dal National Science and Engineering Research Consiglio del Canada (NSERC). C.H.B è grato per il sostegno da Leading Edge Endowment Fund (LEEF). C.H.B. è grato per il sostegno della presidenza di McGill Segal in oncologia molecolare presso la McGill University (Montreal, Quebec, Canada). M.X.C. e C.H.B. sono grato per il sostegno del Warren Y. Soper Charitable Trust e la Fondazione di famiglia di Alvin Segal per l'ospedale generale ebreo (Montreal, Quebec, Canada).

gli importi dei reagenti descritti di seguito si basano sulla misurazione di 20 campioni di plasma paziente. Il protocollo presentato di seguito segue le linee guida dell'Università di Victoria &#39; Comitato etico ricerca umana di s.
 1. generazione di Ang I nel Plasma umano <ol><li>scongelare i campioni di plasma (&#8805; 200 µ l) in una stanza temperatura dell'acqua del bagno per 5 min e poi mettere i campioni su ghiaccio fino a quando completamente sciolto.</li>
	<li>Trasferire 200 µ l di ogni campione di plasma manualmente per separare pozzetti di una piastra di profondo-pozzo (piatto del campione), di 1,1 mL e centrifugare la piastra in una centrifuga per 10 min a 2 ° C e 1278 x g.</li>
	<li>Utilizzare un liquido automatizzato sistema di movimentazione in serie diluire una soluzione standard di 500 fmol / µ l Ang I NAT per preparare sei calibratore soluzioni con l'albumina del bianco d'uovo di pollo (0,1, 0,2, 0,6, 1,9, 5.7, 17,2 fmol / µ l).</li>
	<li>Pipetta 200 µ l di ciascun calibratore a un bene e 125 µ l di generazione buffer per piastra campione. 
	Nota: Il CIPRACCA in fosfato tampone soluzione salina tamponata (PBS) deve essere preparata il giorno dell'esperimento.</li>
	<li>Usa un liquido automatizzato sistema di movimentazione, in una nuova piastra mescolare 125 µ l di plasma surnatante o 125 µ l di CIPRACCA in PBS con 25 µ l di Ang I buffer di generazione, che contiene 1 M Tris, acido etilendiamminotetracetico 0,2 mM (ed) e 1 mM fluoruro di phenylmethylsulfonyl (PMSF). 
	Nota: Preparare il Ang I buffer di generazione mescolando un tampone acquoso 1m Tris/0,2 mM EDTA (regolare a pH 5.5 utilizzando acido acetico) e una soluzione PMSF (100 mM in metanolo). Entrambe le soluzioni possono essere conservate fino a 1 mese a soluzioni di mescolare i due 4 ° C. il giorno dell'esperimento.</li>
	<li>Trasferire automaticamente le soluzioni in una piastra a 96 pozzetti, 3 ripetizioni per soluzione, 34 µ l per pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 3 h.</li>
</ol> 2. Immuno-arricchimento di Ang ho perline rivestite con anticorpo usando <ol><li>coniugazione dell'anticorpo su biglie magnetiche di proteina G Nota: coniugazione dell'anticorpo con le perline viene eseguita manualmente durante i 3 h Ang I periodo di generazione sul giorno dell'esperimento. Per altri analiti, i branelli coniugati potrebbero essere in grado di essere memorizzati nel buffer di PBS contenente 0.015% CHAPS (PBSC) a 4 ° C per tre mesi o più, a seconda della proprietà e la stabilità dell'anticorpo.
	<ol><li>Trasferimento 110 µ l di liquami perlina (sufficiente per 20 campioni di misura e facendo una curva standard di 6 punti) in una provetta da 1,5 mL. Lavare le perle sette volte con 1 mL di acetonitrile/PBSC 25% e tre volte con 1 mL di PBSC. Utilizzare un supporto magnetico per appallottolare le perline tra ogni fase di lavaggio. Rimuovere il tampone di lavaggio dopo l'ultimo nello stato di Washington 
		Nota: Lavaggio 7 volte con 25% acetonitrile/PBSC è critico per la rimozione degli additivi di MS-incompatibile nel liquame tallone, come Tween-20. Se non esistono nessun tali additivi nelle perle selezionate, questa fase di lavaggio estesa potrebbe non essere necessaria.</li>
		<li>Risospendere le sfere in 110 µ l di PBSC e 110 µ l di anti-Ang ho anticorpo (concentrazione finale: 100 µ g/mL). Miscelare la soluzione e perline pipettando e poi li Incubare a temperatura ambiente per 1 h, rotante a 8 giri/min.</li>
		<li>Lavare le perle 3 volte con 1 mL di PBSC e risospendere in 1100 µ l di PBSC. 
		Nota: Se qualsiasi soluzione perlina ha fluito nel tappo del tubo durante l'incubazione, girare giù la soluzione utilizzando una centrifuga da banco a 2680 x g.</li>
		<li>Trasferire la soluzione perlina manualmente in una piastra a 96 pozzetti (piastra standard con nervature). Utilizzare il liquido automatizzato sistema ad aliquota di movimentazione le perline per la stessa piastra a 96 pozzetti, 120 µ l per pozzetto.</li></ol></li> <li>Immuno-arricchimento sui branelli <ol><li>dopo la h 3 Ang periodo di generazione, metto la piastra di incubazione su ghiaccio per 10 min terminare la generazione di I. Ang</li>
		<li>Automaticamente diluire la soluzione di riserva del peptide SIS (10 pmol/μL) 100 volte con PBS buffer e in seguito automaticamente aliquota alla diluizione standard peptide yannick2k stabile una piastra PCR a 96 pozzetti. Trasferire 1,5 µ l di una soluzione di peptide standard (SIS) di isotopo stabile (contenente 100 fmol) in ciascun pozzetto della piastra incubazione e mescolare con i campioni di plasma o CIPRACCA nei buffer di PBS.</li>
		<li>Automaticamente trasferire il contenuto della piastra incubazione alla soluzione perlina, 10ml per bene, mescolare.</li>
		<li>Incubare la piastra a 4 ° C per 1 h durante la rotazione a 8 giri/min.</li>
		<li>Lavare le perle tre volte automaticamente con soluzione di bicarbonato di ammonio (AmBic) 5 mM, 100 µ l per pozzetto a lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le sfere in 7 µ l di 5mm AmBic soluzione in ciascun pozzetto. Utilizzare un magnete per tirare i talloni verso il basso dopo l'ultimo nello stato di Washington</li>
	</ol></li></ol> 3. Trasferimento di perline su una piastra MALDI e aggiunta di soluzione di Matrix <ol><li>Transfer 7 µ l del liquame perlina automaticamente su un piatto di destinazione MALDI con un formato di punto di 2.600 µm. Lasciate asciugare i branelli. 
	Nota: Un piccolo ventilatore alimentato USB può essere utilizzato per accelerare il tallone processo di secchezza.</li>
	<li>Automaticamente aggiungere 2 µ l di acido α-ciano-4-idrossicinnamico (HCCA)-soluzione a matrice (che contiene 3 mg/mL HCCA, citrato di ammonio di 1,8 mg/mL, acetonitrile 70% e 0,1% di acido trifluoroacetico) dalla matrice bene su ogni campione posto sulla piastra di destinazione .</li>
</ol> 4. Acquisizione di un MALDI-TOF-MS e analisi dei dati del segnale <ol><li>analizza il campione macchie con uno strumento di MALDI-TOF utilizzando la modalità di reflector positivo. Eseguire la calibrazione interna, dati levigante e sottrazione della linea di base automaticamente con software specifici del fornitore. 
	Nota: La modalità (positivo/negativo, lineare/riflettore) selezionata per misurazione di MALDI-TOF dipende la destinazione peptidi o proteine.</li>
	<li>Calcolare il rapporto di risposta relativa (rapporto di intensità di Nat/SIS) e confrontarlo con la curva standard per determinare del Ang ho concentrazione in ciascun campione. Calcolare PRA tramite l'equazione (1), dove Δt Ang ho generazione rappresenta il tempo utilizzato per la generazione di I. Ang 
	PRA = [Ang ho] / Δt Ang ho generazione (1)</li></ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li>
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<li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li>
<li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li>
<li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li>
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<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+EGFR+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li>
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<li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+%28iMALDI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li>
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<li>Weiß, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li>
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<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS%3A+PCSK9+as+an+example+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li>
</ol>

C.H.B detiene il brevetto sulla tecnologia iMALDI.

Rispetto alla quantificazione di proteine convenzionali basati su MS, iMALDI utilizza anticorpi per arricchire gli analiti e purificarle da campioni complessi, rendendo quindi possibile quantificare le proteine o peptidi a basse concentrazioni. Un passo fondamentale nel protocollo iMALDI è l'immuno-arricchimento dei peptidi destinazione. Per questo scopo, è necessario selezionare anticorpi con alta specificità e affinità. In SISCAPA, è stato segnalato che affinità dell'anticorpo a 10-9 M o meglio sarebbe neces...

Spettrometria di massa è diventato uno strumento indispensabile in proteomica quantitativa. Spettrometria di massa in grado di determinare le masse delle proteine bersaglio o peptidi, quindi i segnali ottenuti analita possono essere altamente specifici rispetto ai test immunologici. Due metodi di ionizzazione electrospray e MALDI, sono più comunemente utilizzati per la rilevazione di proteine e peptidi1,2,3,4. Una sfida importante nella quantificazione della proteina basate su MS si trova nella rilevazione di bassa-abbondanza di proteine in campioni complessi alle concentrazioni ng/mL o pg/mL in presenza di alta-abbondanza di proteine, e molti candidati proteine biomarcatori trovati nel plasma umano sono all'interno di questa gamma5. Questo problema è causato in gran parte dall'intrinsecamente ampio range dinamico e dalla complessità del proteoma umano6.
Per superare queste difficoltà di rilevazione, sono stati sviluppati metodi immuno-MS per arricchire il bersaglio proteine o peptidi da soluzioni campione su una superficie solida, seguita da eluizione degli analiti e MS misura7,8 , 9 , 10. con immuno-arricchimento, gli analiti sono purificati da campioni complessi e pertanto sono ridotti al minimo gli effetti di ioni-soppressione da altre molecole. Tra i vari supporti solidi, biglie magnetiche attualmente sono più ampiamente usati come hanno i vantaggi della capacità di legame dell'anticorpo alta e maneggevolezza. Biglie magnetiche con diverse funzionalizzazioni e dimensioni sono stati sviluppati e commercializzati per esperimenti di immunoprecipitazione. Fin qui, immuno-arricchimento su perline è stato interfacciato con MALDI-MS e ionizzazione electrospray (ESI) per la misurazione della proteina e del peptide. Isotopo stabile standard e la cattura di tecnologia di anticorpi anti-peptide (SISCAPA), proteine nei campioni sono digeriti, seguita da incubazione con anticorpo-rivestite di perline per immuno-arricchimento. In SISCAPA "classica", i peptidi proteotypic catturati sono eluiti dalle perline e misurati da liquido cromatografia-ESI-MS (LC-MS), o infusione diretta ESI multiplo reazione monitoraggio-MS (MRM-ESI-MS)11,12. Immuno-arricchimento migliorata la sensibilità del dosaggio MRM di 3-4 ordini di grandezza, raggiungendo la fascia bassa ng/mL13.
Rispetto a MS di electrospray, MALDI-MS è più veloce e non comporta la pulizia e il riequilibrio delle colonne LC così non ci sono problemi riporto e contaminazione, rendendolo più adatto per studi di alto-rendimento14. Immuno-MALDI tecnologia è stata sviluppata nel nostro laboratorio di combinare immuno-arricchimento con MALDI-MS per quantificazione sensibile e specifica di peptidi e proteine (basate sulla quantificazione dei peptidi proteotypic)15,16 ,17. Dopo immuno-arricchimento, le perle sono depositate su un piatto di destinazione MALDI, la soluzione di matrice viene aggiunta di perline e il piatto è pronto per l'analisi di un MALDI-TOF-MS dopo l'essiccazione. Eluizione dei peptidi dalle perline non viene eseguita come un passaggio separato, ma associato a affinità analiti sono eluiti dalla soluzione MALDI matrice quando viene aggiunto ai punti tallone, quindi semplificare la preparazione del campione e minimizzazione della perdita di campione. La tecnologia iMALDI è stata applicata in una varietà di applicazioni18,19e recentemente è stata automatizzata e utilizzata per la misurazione dell'angiotensina I (Ang ho) per la determinazione della renina del plasma attività (PRA)20. Questo protocollo sarà dimostrare la procedura utilizzata per eseguire un test automatizzato iMALDI. Prendendo il test PRA come esempio, Inter-giorno CVs di meno del 10% sono stati raggiunti grazie all'automazione, con la capacità di misurare 744 campioni al giorno20.
Il dosaggio PRA iMALDI ha dimostrato in questo manoscritto non richiede la digestione di proteine, come la molecola bersaglio (Ang ho) è un peptide con un peso molecolare di 1295.7 Da. In altri saggi cui digestione delle proteine è necessaria e un peptide è utilizzato come surrogato per la proteina intatta, il peptide selezionato per iMALDI deve essere univoco e specifico per la proteina dell'obiettivo, con una massa oltre 800 Da così che esso può essere facilmente distinto dal c hemical rumore dalla soluzione matrice MALDI. Gli anticorpi anti-peptide sono necessari per l'immuno-arricchimento dei peptidi. Il protocollo per un dosaggio di iMALDI PRA di misura è costituito da quattro fasi: 1) generazione di Ang I nel plasma umano; 2) immuno-arricchimento di Ang che usando le perle di anticorpo-rivestite; 3) trasferimento di perline a una piastra MALDI e aggiungendo soluzione matrix; e 4) acquisizione del segnale con una di analisi dati e MALDI-TOF-MS20.

<table><tbody><tr><td>Controllo sano del plasma umano</td><td>Biorecupero</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di ammonio bibasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (>=98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da albume d'uovo di gallina (>98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Acido alfa-ciano-4-idrossicinnamico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetanosulfonilfluoruro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>grado LC-MS</td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>Acqua di grado LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Fluka</td><td>39253</td> Acido acetico <td>di grado LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Fluka</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)amminometano</td><td>di grado LC-MS Roche Diagnostics</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G sfere magnetiche</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>2.8 &mu; m, 30 mg/mL</td></tr><tr><td>anti-Ang I anticorpo policlonale di capra</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat e SIS Ang I</td><td>sintetizzati presso l'Università di Victoria-Genome BC Proteomics Centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema automatizzato di manipolazione dei liquidi</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>Agilent Bravo stazione di lavoro robotica</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Invitrogen DynaMag-2</td></tr><tr><td>magnete rotatore per tubi</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Labquake Tubo rotatore</td></tr><tr><td>magnetico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 magnete con gonna laterale</td></tr><tr><td>Magnete</td><td>VP Scientific</td><td>771RM-1</td><td>utilizzato per tirare le perline sul fondo del pozzo</td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Bruker Microflex LRF strumento</td></tr></tbody></table>

peptidi e proteine quantificazione utilizzando automated immuno-maldi (imaldi)

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Spettrometria di massa (MS) è una delle tecnologie più comunemente utilizzate per la quantificazione di proteine in campioni complessi, con eccellente specificità come risultato la rilevazione diretta del rapporto massa / carica di ogni molecola target. Tuttavia, proteomica basata su MS-, come la maggior parte delle altre tecniche analitiche, ha una polarizzazione verso analiti alta-abbondanza di misura, quindi è difficile da raggiungere limiti di rilevazione di bassa ng/mL o pg/mL in campioni complessi e questo è l'intervallo di concentrazione per molti malattia-relative proteine in biofluidi quali plasma umano. Per aiutare nella rilevazione di analiti di basso-abbondanza, immuno-arricchimento è stato integrato il saggio a concentrarsi e purificare l'analita prima misurazione MS, migliorando significativamente la sensibilità del test. In questo lavoro, la tecnologia di immuno - Assisted Laser Desorption/Ionization (iMALDI) è presentato per la quantificazione delle proteine e dei peptidi in biofluidi, basato su immuno-arricchimento su perline, seguito dalla misura di MALDI-MS senza previa eluizione. Gli anticorpi anti-peptide sono funzionalizzati su biglie magnetiche e incubati con campioni. Dopo il lavaggio, le perle vengono trasferite direttamente su una lastra di destinazione MALDI e i segnali sono stati misurati da un MALDI-tempo di volo (MALDI-TOF) strumento dopo la soluzione di matrice è stata applicata ai talloni. La procedura di preparazione del campione è semplificata rispetto ad altri saggi immuno-MS, e la misurazione di MALDI è veloce. La preparazione del campione intero è automatizzata con un liquido sistema, manipolazione con riproducibilità del migliorato e un throughput più elevato. In questo articolo, l'analisi di iMALDI è usata per determinare l'angiotensina peptide ho (Ang ho) concentrazione nel plasma, che è usato clinicamente come lettura di attività della renina plasmatica per lo screening di aldosteronismo primario (PA).

Una procedura automatizzata iMALDI per la misurazione Ang mi è mostrato nella Figura 1. Peptidi di destinazione (peptidi endogeni o peptidi da proteine digerite) sono arricchite il anti-peptide biglie magnetiche, e quindi le perle vengono trasferite ad una piastra di destinazione per la misura di MALDI. L'intera procedura è semplificata rispetto ad altre tecnologie di immuno-MS che richiedono ulteriori peptide eluizione passaggi. Automazione del dosaggio iMAL...

Un protocollo per la quantificazione della proteina in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia automatizzata immuno-MALDI (iMALDI) è presentato.

Peptidi e proteine quantificazione utilizzando Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

L'obiettivo generale di questo saggio immuno-MALDI automatizzato è quello di quantificare peptidi e proteine integre in fluidi biologici complessi in modo accurato e sensibile. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della proteomica quantitativa, come la quantificazione dei livelli proteici per scopi diagnostici o per il monitoraggio della risposta del paziente al trattamento. Il vantaggio principale di questo metodo è la sua capacità di quantificare i livelli proteici con elevata sensibilità e accuratezza a partire da campioni complessi.Questa tecnica consente la diagnosi di malattie in una fase precoce poiché il passaggio di immunoarricchimento del saggio permette la quantificazione di biomarcatori proteici e peptidici scarsamente abbondanti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'attività della renina plasmatica, può essere applicato anche ad altri studi legati a malattie, come la quantificazione di proteine associate al cancro per la prognosi, la diagnosi e la gestione del trattamento. Per iniziare questa procedura, scongelare i campioni di plasma umano in un bagno d'acqua a temperatura ambiente per cinque minuti.Successivamente, posizionare i campioni sul ghiaccio fino a completo scongelamento. Poi, trasferire manualmente 200 microlitri di ciascun campione di plasma in pozzetti separati di una piastra deep well da 1,1 millilitro. Centrifugare la piastra per 10 minuti a due gradi Celsius e 3.000 rpm.Quindi, utilizzare il Bravo per diluire in serie una soluzione standard di Ang-1 NAT a 500 femtomoli per microlitro per preparare sei soluzioni calibratrici con albumina di albume d'uovo di pollo. Dopo la centrifugazione, trasferire con una pipetta 200 microlitri di ciascun calibratore in una pozzetta e 125 microlitri di tampone di generazione nella piastra campione. Utilizzando un sistema automatizzato di gestione dei liquidi, mescolare 125 microlitri di surnatante plasmatico oppure 125 microlitri della soluzione di albumina di albume d'uovo di pollo con 25 microlitri di tampone di generazione dell'angiotensina I in una nuova piastra a pozzette profonde da 1,1 millilitro.Ora, trasferire automaticamente le soluzioni in una piastra a 96 pozzetti con tre replicati per soluzione e 34 microlitri di soluzione per pozzetto. Successivamente, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore. Per la coniugazione dell'anticorpo con le perle di proteina G, trasferire innanzitutto 78 microlitri di sospensione di perle precedentemente preparata in un tubo da 1,5 millilitri.Lavare le perle sette volte con un millilitro di acetonitrile al 25% in PBSC e tre volte con un millilitro di PBSC, utilizzando un supporto magnetico per formare il pellet delle perle tra ogni lavaggio. Dopo il lavaggio, risospendere le perle in 110 microlitri di PBSC e aggiungere 110 microlitri di anticorpo anti-angiotensina I. Mescolare le perle e la soluzione mediante pipettaggio.Quindi, incubare le perle a temperatura ambiente per un'ora, ruotando a otto giri al minuto. Successivamente, lavare le perle tre volte con un millilitro di PBSC. Poi, risospendere le perle in 1.100 microlitri di PBSC.Ora, trasferire manualmente la soluzione di perle in una piastra a 96 pozzetti. Successivamente, utilizzare il Bravo per aliquotare le perle nella stessa piastra a 96 pozzetti. Dopo il periodo di generazione dell'angiotensina I di tre ore, posizionare la piastra di incubazione sul ghiaccio per 10 minuti per interrompere la generazione dell'angiotensina I. Diluire automaticamente una soluzione madre di peptidi standard con isotopi stabili di 100 volte con tampone PBS.Inoltre, aliquotare automaticamente la diluizione del peptide standard con isotopo stabile in una piastra PCR a 96 pozzetti. Trasferire 10 microlitri della soluzione peptidica diluita in ciascun pozzetto della piastra di incubazione. Mescolare la soluzione peptidica diluita con i campioni di plasma o con la soluzione di albumina d'uovo di pollo.Aggiungere automaticamente le soluzioni campione o standard alle soluzioni di perline nella piastra di incubazione e mescolare. Dopo un'ora di incubazione, lavare automaticamente le perline tre volte con soluzione di bicarbonato di ammonio 5 millimolare. Utilizzare un magnete per far aderire le perline sul fondo dopo ogni lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 10 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio in ogni pozzetto per risospendere le perle. Trasferire automaticamente sette microlitri della sospensione di perle su una piastra target MALDI con una dimensione del punto di 2.600 micrometri. Una volta che le perle sono asciutte, aggiungere automaticamente due microlitri della soluzione di matrice HCCA precedentemente preparata dal pozzetto della matrice su ciascun punto campione della piastra target.In seguito, analizzare i punti campione con uno strumento MALDI-TOF utilizzando la modalità riflettore positiva. Eseguire la calibrazione interna, la levigatura dei dati e la sottrazione della linea di base mediante il software specifico del produttore. La procedura iMALDI automatizzata per la misurazione dell'angiotensina I consente un'analisi ad alto rendimento di un elevato numero di campioni con un coefficiente di variazione intragiornaliero inferiore al 10%. Qui vengono mostrati spettri rappresentativi ottenuti misurando l'angiotensina I in campioni di plasma umano.Qui è mostrata la correlazione tra i valori di PRA ottenuti da 188 campioni di pazienti mediante il saggio iMALDI automatizzato e i valori di PRA ottenuti utilizzando un metodo clinico basato su LC-MS/MS. I due metodi presentano un coefficiente di correlazione pari a 0,98, e la differenza tra le pendenze potrebbe essere attribuita all'uso di standard interni diversi o di anticorpi differenti. Qui vengono mostrati l'intervallo lineare del saggio e la precisione del saggio.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore. Nel tentativo di eseguire questa procedura, ricordarsi di regolare correttamente la punta e la velocità di aspirazione e dispensazione del liquido. Dopo questa procedura, possono essere utilizzati metodi aggiuntivi per confermare l'aldosteronismo primario nei pazienti, tra cui il carico orale di sale o i test di infusione di soluzione fisiologica.La tecnica automatizzata iMALDI consente lo screening quantitativo specifico e preciso ad alto rendimento di campioni biologici, inclusi campioni di pazienti, per la ricerca di proteine o peptidi associati a malattie. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un saggio iMALDI automatizzato per la quantificazione di proteine e peptidi basata sulla spettrometria di massa. Non dimenticare che lavorare con campioni biologici, come il plasma umano, è estremamente pericoloso e le necessarie precauzioni di sicurezza devono essere sempre adottate durante l'esecuzione della procedura.

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Standard di isotopi stabili e cattura da anticorpi anti-peptide (SISCAPA) affinità arricchimento coppie di peptidi con diluizione degli isotopi stabili e spettrometria di massa (MRM-MS) per fornire la misura quantitativa di peptidi come surrogati per le loro rispettive proteine. Qui descriviamo il protocollo utilizzando particelle magnetiche in un formato parzialmente automatizzato.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

Abbiamo sviluppato una tecnologia basata su pellicola sottile di silice mesoporosa per il recupero selettivo di proteine ​​a basso peso molecolare e peptidi da siero umano. Le proprietà fisico-chimiche delle nostre chip mesoporosi stati finemente sintonizzato per fornire il controllo sostanziale arricchimento peptide e di conseguenza il profilo del proteoma siero per scopi diagnostici.

Basso Peso Molecolare proteina di arricchimento sul film sottili di silice mesoporosi per la scoperta di biomarcatori

Etichettatura isotopi stabili di peptidi da dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un rapido strategia economica per proteomica accurate di massa a base di spettrometria-quantitativi. Qui mostriamo un metodo efficace per la preparazione e l'analisi di miscele proteiche che utilizzano l'approccio Redi che può essere applicato a quasi qualsiasi tipo di campione.

La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

Questo protocollo descrive come eseguire saggi di quantificazione assoluta di proteine bersaglio all'interno di campioni biologici complessi utilizzando il monitoraggio di reazioni selezionate. È stato utilizzato per quantificare con precisione le proteine della via di segnalazione della chemiotassi dei macrofagi di topo. La selezione dei peptidi target, lo sviluppo del saggio e i saggi qualitativi e quantitativi sono descritti in dettaglio.

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Qui, descriviamo un'analisi cromatografica accoppiata con la separazione di mobilità dello ione dei precursori del peptide seguita dalla ad alta risoluzione (~ 30.000) MS-rilevazione dei frammenti peptidici per la quantificazione degli standard del peptide a spillo in un anticorpo monoclonale digest.

Un saggio di HS-MRM per la quantificazione delle proteine di cellula ospite in biofarmaceutica di proteine mediante spettrometria di massa di liquido cromatografia dello ione mobilità QTOF

Descriviamo l'uso di quantitativi immunoblotting per convalidare l'istologia di immunofluorescenza accoppiato con analisi dell'immagine come mezzo di quantificare una proteina di interesse nei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE). I nostri risultati dimostrano l'utilità dell'istologia di immunofluorescenza per accertare la quantità relativa di proteine biomarcatore nei campioni di biopsia di routine.

Immunoblotting quantitativa delle linee cellulari come Standard per convalidare l'immunofluorescenza per quantificare le proteine biomarcatore nei campioni di tessuto di Routine

Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

Questo flusso di lavoro descrive contemporaneamente le prestazioni dell'arricchimento in termini di tempo ed efficiente in termini di costi di più modifiche post-traslazionali proteiche (PPM) per l'analisi proteomica globale quantitativa. Il protocollo utilizza l'arricchimento PTM a livello di peptide con più anticorpi coniugati, seguito dall'analisi della spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati per ottenere informazioni biologiche sul crosstalk PTM.

Arricchimento simultaneo dell'affinità di due modifiche post-traduzionali per la quantificazione e la localizzazione del sito

L'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT) è una strategia avanzata di multiplexing del campione in grado di aumentare il numero di campioni che possono essere analizzati contemporaneamente ai tag isobarici disponibili. L'incorporazione di una piattaforma robotica ha notevolmente aumentato la produttività sperimentale, la riproducibilità e l'accuratezza quantitativa.

Multiplexing di campioni automatizzato utilizzando l'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT)

Qui, presentiamo un protocollo per la purificazione di complessi peptidici MHC di classe I e classe II da linee cellulari di topi e umani che forniscono dati immunopeptidomici di alta qualità. Il protocollo si concentra sulla preparazione del campione utilizzando anticorpi disponibili in commercio.

Immunopeptidomics: Isolamento di peptidi associati A MHC di classe I e II di topi e umani per l'analisi della spettrometria di massa

Qui, descriviamo un flusso di lavoro proteomico per la caratterizzazione del proteoma della superficie cellulare di vari tipi di cellule. Questo flusso di lavoro include l'arricchimento delle proteine della superficie cellulare, la successiva preparazione del campione, l'analisi utilizzando una piattaforma LC-MS/MS e l'elaborazione dei dati con un software specializzato.

Flusso di lavoro "Cell Surface Capture" per la quantificazione senza marcatura del proteoma della superficie cellulare

Impara a quantificare peptidi e proteine in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia iMALDI automatizzata. Questo metodo sensibile e accurato facilita la diagnosi precoce delle malattie e il monitoraggio della risposta al trattamento.

Peptidi e proteine quantificazione utilizzando Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

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