Peptidi e proteine quantificazione utilizzando Automated Immuno-MALDI (iMALDI)
18 agosto 2017
Un protocollo per la quantificazione della proteina in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia automatizzata immuno-MALDI (iMALDI) è presentato.
L'obiettivo generale di questo test immuno-MALDI automatizzato è quantificare i peptidi e le proteine intatte in fluidi biologici complessi in modo accurato e sensibile. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della proteomica quantitativa, come quantificare i livelli di proteine per la diagnostica o per monitorare la risposta di un paziente al trattamento. Il vantaggio principale di questo metodo è che può quantificare i livelli di proteine in modo molto sensibile e accurato da campioni complessi.
Questa tecnica consente la diagnosi di malattie in una fase precoce perché la fase di immuno-arricchimento del saggio consente la quantificazione di biomarcatori proteici e peptidici a bassa abbondanza. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'attività della renina plasmatica, può essere applicato anche ad altri studi correlati alla malattia, come la quantificazione delle proteine correlate al cancro per la prognosi, la diagnosi e la gestione del trattamento. Per iniziare questa procedura, scongelare i campioni di plasma umano in un bagno d'acqua a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi, posizionare i campioni sul ghiaccio fino a quando non sono completamente scongelati. Successivamente, trasferire manualmente 200 microlitri di ciascun campione di plasma in pozzetti separati di una piastra a pozzetti profonda 1,1 millilitri. Centrifugare la piastra per 10 minuti a due gradi Celsius e 3.000 giri/min.
Quindi, utilizzare Bravo per diluire in serie una soluzione standard di 500 femtomoli per microlitro di Ang-1 NAT per preparare sei soluzioni calibratrici con albumina di albume d'uovo di gallina. Dopo la centrifugazione, pipettare 200 microlitri di ciascun calibratore in un pozzetto e 125 microlitri di tampone di generazione nella piastra del campione. Utilizzando un sistema automatizzato di manipolazione dei liquidi, miscelare 125 microlitri di surnatante plasmatico o 125 microlitri della soluzione di albumina d'uovo di gallina con 25 microlitri di tampone di generazione dell'angiotensina I in una nuova piastra a pozzetti profondi da 1,1 millilitri.
A questo punto, è possibile trasferire automaticamente le soluzioni in una piastra da 96 pozzetti con tre repliche per soluzione e 34 microlitri di soluzione per pozzetto. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore. Per la coniugazione dell'anticorpo con le perle di proteina G, trasferire prima 78 microlitri di liquame di perle precedentemente preparato in una provetta da 1,5 millilitri.
Lavare le perle sette volte con un millilitro di acetonitrile al 25% in PBSC e tre volte con un millilitro di PBSC, utilizzando un supporto magnetico per pellettare le perle tra un lavaggio e l'altro. Dopo aver lavato le perle, risospenderle in 110 microlitri di PBSC e aggiungere 110 microlitri di anticorpo anti-angiotensina I. Mescolare le perle e la soluzione mediante pipettaggio.
Quindi, incubare le perle a temperatura ambiente per un'ora ruotandole a otto giri/min. Successivamente, lavare le perle tre volte con un millilitro di PBSC. Quindi, risospendere le perle in 1, 100 microlitri di PBSC.
A questo punto, trasferire manualmente la soluzione di microsfere in una piastra a 96 pozzetti. Quindi, fai aliquotare le perle al Bravo sulla stessa piastra a 96 pozzetti. Dopo il periodo di generazione dell'angiotensina I di tre ore, posizionare la piastra di incubazione sul ghiaccio per 10 minuti per terminare la generazione dell'angiotensina I.Diluire automaticamente una soluzione madre di peptidi standard isotopici stabili 100 volte con tampone PBS.
Inoltre, aliquotare automaticamente la diluizione del peptide standard dell'isotopo stabile in una piastra PCR a 96 pozzetti. Trasferire 10 microlitri della soluzione peptidica diluita in ciascun pozzetto della piastra di incubazione. Mescolare la soluzione peptidica diluita con i campioni di plasma o la soluzione di albume d'uovo di gallina.
Aggiungere automaticamente il campione o le soluzioni standard alle soluzioni di microsfere nella piastra di incubazione e mescolare. Dopo un'ora di incubazione, lavare automaticamente le perle tre volte con una soluzione di bicarbonato di ammonio da cinque millimolari. Usa un magnete per tirare le perline verso il fondo dopo ogni lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 10 microlitri della soluzione di bicarbonato di ammonio in ogni pozzetto per risospendere le perle. Trasferire automaticamente sette microlitri di impasto liquido su una piastra target MALDI con una dimensione dello spot di 2.600 micrometri. Una volta che le perle si sono asciugate, aggiungere automaticamente due microlitri di soluzione di matrice HCCA precedentemente preparata dal pozzetto della matrice su ciascun punto del campione sulla piastra di destinazione.
Successivamente, analizzare i punti del campione con uno strumento MALDI-TOF utilizzando la modalità riflettore positivo. Esegui la calibrazione interna, il livellamento dei dati e la sottrazione della linea di base con il software specifico del fornitore. La procedura automatizzata iMALDI per la misurazione dell'angiotensina I consente l'analisi ad alto rendimento di un gran numero di campioni con un coefficiente di variazione intraday inferiore al 10%Qui vengono visualizzati spettri rappresentativi ottenuti misurando l'angiotensina I in campioni di plasma umano.
Qui è mostrata la correlazione dei valori di PRA di 188 campioni di pazienti ottenuti con il test automatizzato iMALDI con i valori di PRA ottenuti utilizzando una procedura clinica LC-MS/MS. I due metodi hanno un coefficiente di correlazione di 0,98 e la differenza tra le pendenze può essere dovuta all'uso di diversi standard interni o di diversi anticorpi. Qui vengono visualizzati l'intervallo lineare del test e la precisione del test.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore. Durante il tentativo di questa procedura, ricordarsi di regolare correttamente la testa della punta e la velocità di gestione del liquido. Dopo questa procedura, è possibile utilizzare ulteriori metodi per confermare l'aldosteronismo primario nei pazienti, tra cui il carico orale di sale o i test di infusione salina.
La tecnica automatizzata iMALDI consente lo screening quantitativo specifico e accurato di campioni biologici, compresi i campioni dei pazienti, alla ricerca di proteine o peptidi correlati alla malattia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un saggio iMALDI automatizzato per la quantificazione di proteine e peptidi basata sulla spettrometria di massa. Non dimenticare che lavorare con campioni biologici, come il plasma umano, è estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione della procedura devono essere sempre prese le necessarie precauzioni di sicurezza.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per quantificare peptidi e proteine intatte in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia immuno-MALDI automatizzata (iMALDI). Il metodo è progettato per fornire misurazioni accurate e sensibili, aiutando nella diagnostica e nel monitoraggio del trattamento.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Proteomica
- Saggi biologici
- Diagnostica
Conoscenze di base
- La proteomica quantitativa è essenziale per comprendere i livelli proteici in varie condizioni.
- I biomarcatori proteici e peptidici a bassa abbondanza possono essere difficili da quantificare.
- La diagnosi precoce della malattia può avere un impatto significativo sui risultati del trattamento.
- Le tecniche automatizzate migliorano la sensibilità e l'accuratezza nella quantificazione delle proteine.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo sensibile e accurato per la quantificazione delle proteine.
- Facilitare la diagnosi delle malattie in fase precoce.
- Fornire informazioni sull'attività del renina plasmatica e sulle proteine correlate al cancro.
Metodi utilizzati
- Tecnologia immuno-MALDI automatizzata (iMALDI).
- Passo di immuno-arricchimento per proteine a bassa abbondanza.
- Scongelamento di campioni di plasma umano per l'analisi.
- Quantificazione di proteine e peptidi in fluidi biologici complessi.
Risultati principali
- Il metodo consente una quantificazione sensibile delle proteine da campioni complessi.
- Può essere applicato a vari studi correlati alle malattie.
- La diagnosi precoce della malattia è facilitata attraverso una misurazione accurata delle proteine.
- Si possono ottenere informazioni sul monitoraggio del trattamento e sulla risposta del paziente.
Conclusioni
- La tecnologia iMALDI automatizzata è uno strumento prezioso nella proteomica quantitativa.
- Il metodo migliora la capacità di diagnosticare precocemente le malattie.
- Fornisce una struttura per futuri studi sulla quantificazione delle proteine.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Automated immuno-MALDI (iMALDI) addresses the critical challenge of quantifying low-abundance peptide and protein biomarkers in complex biofluids, enabling sensitive detection in the ng/mL to pg/mL range required for clinical applications. By integrating immuno-enrichment with MALDI-TOF mass spectrometry and full automation, the method delivers high-throughput, reproducible quantification with intraday CV below 10%, supporting reliable biomarker measurement for diagnostic and therapeutic monitoring workflows. This capability enhances predictive confidence in target validation and assay development for cardiovascular, endocrine, and oncology indications where low-abundance analytes drive clinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying low-abundance peptides like angiotensin I in plasma, supporting functional validation of disease-relevant targets.
- Operational Value: Provides specific and accurate measurements from complex samples, reducing false negatives in biomarker detection and improving target confidence.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking through precise correlation with clinical readouts such as plasma renin activity, demonstrated by R=0.98 vs LC-MS/MS.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, mass-specific readouts via MALDI-TOF detection, enabling precise comparison of analyte levels across conditions and samples.
- Operational Value: Streamlines sample preparation through automation on liquid handling systems, improving reproducibility and throughput for large-scale screening campaigns.
- Assay Readiness: Eliminates elution steps, simplifying workflow and reducing hands-on time while maintaining sensitivity for low-abundance analytes in biofluids.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports alignment with clinical biomarkers like plasma renin activity, enabling translation from discovery to preclinical validation using disease-relevant concentration ranges.
- Risk-Adjusted Advancement: Delivers quantitative data with defined precision (CV<10%) and linearity, informing go/no-go decisions in lead optimization and preclinical candidate selection.
- Disease-Relevant System: Applicable to human plasma and other complex fluids, ensuring physiological relevance for cardiovascular, renal, and oncology biomarker studies.
Pipeline & Workflow Integration
The iMALDI method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to translational screening, providing quantitative protein and peptide measurements that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling sensitive quantification of signaling peptides and protein biomarkers in native biological matrices.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs with high reproducibility, facilitating reliable compound effect measurement in phenotypic or target-based screens.
- Analytics: Generates mass-resolved, quantitative readouts suitable for statistical comparison and correlation with functional or clinical endpoints.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through biomarker alignment, as demonstrated by angiotensin I quantification correlating with plasma renin activity in patient samples.
- Enterprise Reuse: Automated platform design allows reuse across multiple targets by changing antibody-bead conjugates, supporting scalable implementation in core proteomics laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through sensitive, specific detection of low-abundance analytes in disease-relevant samples.
- Operational Value: Standardization, reproducibility (CV<10%), and scalability via automation, reducing variability and increasing sample throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing reliable biomarker data, reducing late-stage biological attrition and improving capital efficiency.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, translationally aligned measurements that reflect target engagement and pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoassay design, antibody conjugation, and MALDI-TOF operation for successful implementation and troubleshooting.
- Dependent on liquid handling automation, magnetic bead separation systems, and MALDI-TOF instrumentation with reflector mode capability.
- Necessitates standardization across teams for reagent preparation, washing protocols, and matrix application to ensure inter-run consistency.
- Adaptation to new targets requires validation of antibody specificity, bead coupling efficiency, and interference testing in relevant biological matrices.
- Practical limitations include potential ion suppression in complex samples and the need for optimization of washing and elution-free transfer steps for each analyte-matrix pair.
