Name: Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Impara a caratterizzare rapidamente il ripiegamento e le interazioni di legame biomolecolari mediante calorimetria differenziale a scansione con ligandi termolabili. Questo metodo consente di estrarre parametri termodinamici in sole due prove sperimentali.

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R. W. H. V era sostenuta dalla McGill scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) programma di formazione in Bionanomachines. A. K. M. e P. E. J. sono stati sostenuti da borse di studio NSERC 327028-09 (A. K. M) e 238562 (E. J.).

1. preparazione del campione
<ol><li>Purificare la biomolecola desiderato13. Nota: Questo protocollo usi acquistati cocaina-associazione DNA aptamer MN4 dopo lo scambio contro 2 M NaCl, tre volte seguito da tre turni di acqua deionizzata utilizzando un filtro centrifugo con una membrana di cut-off di peso molecolare 3 kDa.</li>
	<li>Sintetizzare e purificare, oppure acquistare il ligando termolabile desiderato13. Nota: MN4 associa la cocaina ligando termolabili. MN4 si lega anche la chinina, che viene utilizzato come controllo negativo per thermolability di ligando a queste temperature sperimentale.</li>
	<li>Preparare buffer per dialisi di biomolecole purificata e dissoluzione di ligandi (buffer di NaCl di fosfato di sodio e 140 mM 20 mM, pH 7.4, per MN4 e i leganti utilizzati qui).</li>
	<li>Dializzare biomolecola contro almeno 2 L di buffer utilizzando tubi di dialisi con 0,5 - 1,0 kDa cut-off.</li>
	<li>Filtrare il buffer finale (denominato buffer di lavoro) attraverso un filtro da 0,2 µm che è stato accuratamente equilibrato con buffer.</li>
	<li>Pesare le masse desiderate dei ligandi e scioglierli in buffer di lavoro filtrata. Se le concentrazioni di ligando desiderato richiedono masse che sono troppo piccole per pesare con precisione, fare una soluzione di riserva di ligando concentrato (10x per esempio). Nota: È fondamentale che tutti gli esperimenti di DSC utilizzano lo stesso buffer di lavoro per l'esempio e ligando, vale a dire, mai eseguire un esperimento dove il ligando è dissolto in un batch diverso di buffer di lavoro rispetto la biomolecola ciò causerebbe buffer artefatti di mancata corrispondenza dei dati.</li>
	<li>Filtrare la soluzione di riserva di biomolecola attraverso un filtro da 0,2 µm che è stato accuratamente equilibrato con buffer di lavoro.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di biomolecole mediante misure di assorbanza (260 nm per gli acidi nucleici come MN4 e 280 nm per le proteine).</li>
	<li>Conservare il preparato biomolecola e ligando in frigorifero 4 ° C (adatto per MN4 e i leganti utilizzati qui), o -20 o -80 ° C se la biomolecola e ligandi tollerano congelamento e a lungo termine di deposito è richiesto. Degas le soluzioni tampone, biomolecole e ligando in una table top Degassatore (Vedi Tabella materiali) prima del caricamento nel DSC. Nota: Degasaggio aiuta a prevenire la formazione di bolle nel DSC a temperature più elevate. Bolle di causano artefatti di segnale che oscurano la DSC picco forme e linee di base.</li>
</ol>2. preparazione DSC
<ol><li>Svitare la maniglia di pressione dal DSC (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Eseguire il tubo in silicone da buffer di lavoro e associarlo a flangia anteriore (metallo apertura) del capillare di riferimento.</li>
	<li>Creare un ponte tra i capillari di riferimento e campione collegando la flangia posteriore riferimento alla flangia anteriore del campione.</li>
	<li>Applicare un pezzo di tubo in silicone al bordo posteriore del campione che corre a una boccetta dei rifiuti con una linea del vuoto collegata.</li>
	<li>Girare sulla linea del vuoto per svuotare il DSC con 200 mL di buffer di lavoro.</li>
	<li>Caricare il capillare di riferimento del DSC con buffer di lavoro. Allegare all'incirca sezioni di 3-5 cm di tubo in silicone per le flange capillare di riferimento.</li>
	<li>Inserire una punta di pipetta da 1 mL in tubo in silicone di flangia posteriore. 0,8 mL di buffer di lavoro con una pipetta di disegnare e inserire la punta della pipetta con il tampone nel tubo in silicone della flangia di riferimento anteriore.</li>
	<li>Premere delicatamente lo stantuffo della pipetta fino a passare il buffer di lavoro attraverso il tubo in silicone anteriore nel capillare di riferimento e verso la flangia posteriore collegato punta della pipetta. Premere verso il basso lo stantuffo pipetta fino a quando il livello del buffer di lavoro raggiunge appena sopra il tubo in silicone anteriore, quindi rilasciare lo stantuffo pipetta fino a quando il livello del buffer di lavoro raggiunge appena sopra il tubo in silicone posteriore.<ol>
<li>Ripetere passando il buffer di lavoro avanti e indietro per eliminare il volume nel capillare riferimento di bolle. Nota: Solitamente, 10 i passaggi della soluzione avanti e indietro sono sufficienti per eliminare eventuali bolle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tappare la punta della pipetta posteriore con il pollice e tirare delicatamente la punta della pipetta posteriore e anteriore pipetta per rimuoverli dalle flange di riferimento con il tubo in silicone collegato.</li>
	<li>Caricare il capillare di campione con buffer di lavoro come nei passaggi 2.6-2.9. Mettere un tappo di plastica nero sul riferimento posteriore e flange, lasciando le flange anteriori scoperte di esempio.</li>
	<li>Fissare la maniglia di pressione.</li>
	<li>Aprire il software di DSC (Vedi Tabella materiali) e pressurizzare lo strumento facendo clic su freccia nella parte superiore dell'interfaccia rossa una volta che la lettura di potenza si stabilizza; il potere di DSC è indicato in una casella nella parte superiore destra dell'interfaccia insieme alla temperatura dello strumento e la lettura della pressione. Nota: Monitor pressurizza il potere leggere come il DSC. Cambiamenti nel potere di più di ~ 10 µW indicare la formazione di bolle nei vasi capillari, che può causare artefatti nei dati. Le soluzioni devono essere rimossi e degassate ulteriore prima di continuare.</li>
	<li>Equilibrare il DSC con buffer di lavoro eseguendo una scansione in avanti e indietro. Nella scheda "Metodo sperimentale" sul lato sinistro dello schermo, verificare che è selezionata l'opzione "Scansione" per eseguire il DSC in temperatura modalità di scansione. Nota: Parametri sperimentali sono la temperatura gamma, velocità di scansione, tempo di equilibramento di bassa ed alta temperatura e numero di scansioni di scansione.<ol>
<li>Nella rientranza "Parametri di temperatura" sotto la scheda "Metodo sperimentale", fare clic sul pulsante per il "Riscaldamento". Immettere 1 e 100 ° C per le temperature sperimentale inferiore e superiore, 1 ° C/min per la velocità di scansione e 60 s per il periodo di equilibrazione.</li>
		<li>Clicca sul pulsante "Aggiungi serie" sotto il campo di input per il periodo di equilibrazione. Inserire 2 nel campo "Passaggi per aggiungere" nella finestra pop-up (per un riscaldamento e raffreddamento una scansione) e la casella "alternativo riscaldamento/raffreddamento". Fare clic su "OK"; le scansioni aggiunta vengono visualizzati nella parte inferiore dell'interfaccia. Verificare che i parametri per ogni analisi sono come desiderato.</li>
		<li>Iniziare l'esperimento facendo clic sul pulsante "play" verde nella parte superiore dell'interfaccia. Selezionare la cartella desiderata e immettere un nome di file per il salvataggio l'esperimento nella finestra popup. Visualizzare l'avanzamento di esperimento facendo clic sulla scheda "Dati" a destra della scheda "Metodo di sperimentare".</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. raccolta termolabile ligando DSC Datasets
Nota: La procedura minima consiste di cinque esperimenti: esperimenti di riferimento con e senza ligando del buffer (utilizzato per la sottrazione della linea di base, Vedi discussione), campione esperimenti con la biomolecola gratis, biomolecole-ligando e la -ligando biomolecola con un periodo più lungo di equilibratura ad alta temperatura.
<ol><li>Eseguire esperimenti di riferimento per la sottrazione della linea di base di dati di esempio. Ricaricare il DSC con buffer di lavoro in entrambi i capillari e raccogliere più scansioni di avanti e indietro su un range di temperatura adatta a 1 ° C min-1 (alta temperatura) alla tomaia con tempo di equilibramento di 120 s.<ol>
<li>Elimina le scansioni di equilibrazione buffer precedente dalla parte inferiore dell'interfaccia evidenziando ognuna singolarmente e facendo clic sulla X rossa per la metà destra dell'interfaccia. Aggiungere le nuove scansioni facendo clic sul pulsante "Aggiungi serie", immettendo 20 nel campo per la "Procedura per aggiungere" e selezionando la casella "alternativo riscaldamento/raffreddamento". Fare clic su OK ed eseguire l'esperimento facendo clic sul pulsante verde play come sopra.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 3.1 - esperimenti di 3.1.1 con buffer di lavoro contenente la concentrazione del ligando in entrambi capillari per ottenere il riferimento per il ligando (raccogliere due esperimenti separati utilizzando 120 s e 600 s ad alta temperatura equilibrazione volte rispettivamente, da utilizzarsi nell'acquisire la costante di velocità per la conversione di ligando termolabile). Nota: La frequenza di scansione utilizzata qui assicura che la biomolecola negli esperimenti successivi all'equilibrio termico nelle scansioni e inversione (Vedi discussione). Scansione tariffe < 0,1-0,2 ° C min-1 portare a termogrammi rumorosi e non sono applicabili in esperimenti di DSC. Le temperature dovrebbero estendere da ben di sotto della temperatura di fusione della biomolecola gratis per ben di sopra della temperatura di fusione di biomolecola ligando-saturi (~ 20-80 ° C per MN4). Verificare la riproducibilità delle scansioni (per esempio, 10 in avanti e inversione 10 scansioni per 20 totale è sufficiente).</li>
		<li>Se utilizzando ligandi più (come la cocaina e chinino), lavare il DSC con 200 mL di buffer di lavoro (ripetere da passo 2.5) tra le esecuzioni al fine di rimuovere ligando dai capillari e prevenire la contaminazione incrociata. Nota: È utile eseguire un esperimento di replicare su biomolecole libera dopo una corsa-ligando al fine di verificare se il ligando precedente assorbe fortemente per le pareti dei capillari e non viene adeguatamente rimosso con tampone di lavaggio. Se i termogrammi per la biomolecola libero sembrano essere spostato a un ordine di grandezza maggiore e la più alta temperatura di denaturazione dopo il ligando esperimento, è probabile che il ligando precedente è ancora presente nel calorimetro dopo il lavaggio. Rimuovere il ligando adsorbito incubando i capillari con 20% Contrad-70 per 1 h a 60 ° C con i tappi di plastica e la maniglia di pressione fuori. Nel software DSC, cambiare la modalità sperimentale a "Isotermico" sotto la scheda scegliere 3.600 s di metodo sperimentale per la durata e i 60 ° C per la temperatura isotermica, con zero entrata per la volta di equilibrazione. Cliccare su "Aggiungi al metodo sperimentale". L'esperimento isotermico viene visualizzata nella parte inferiore dello schermo. Dopo il completamento, sciacquare lo strumento con acqua 2L deionizzata e ripetere dal passo 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire esperimenti campione utilizzando lo stesso DSC caricamento procedure e parametri sperimentali come il riferimento le scansioni. Per il set di dati gratuito biomolecola, assicurarsi che il capillare di riferimento contiene il buffer di lavoro mentre il capillare di esempio contiene la biomolecola gratuito alla concentrazione desiderata nel buffer di lavoro.<ol>
<li>Per gli esperimenti-ligando, assicurarsi che il ligando è nel buffer di lavoro nel capillare di riferimento, e le biomolecole plus ligando è nel buffer di lavoro nel capillare del campione. Lavare il sistema tra aggiunte di leganti differenti come descritto al punto 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire una ulteriore esperimento con la biomolecola associato al ligando termolabile dove il periodo di equilibratura ad alta temperatura è aumentato a 600 s e tutti gli altri parametri sperimentali sono gli stessi come punto 3.2.1. Nota: La durata del periodo di equilibratura ad alta temperatura per l'esperimento di secondo-ligando è semplicemente scelto per assicurare che il ligando è più rapidamente impoverito che l'esperimento di equilibrazione breve tempo. Se i picchi-ligando dal primo esperimento decadimento lentamente in funzione del numero di analisi (ad esempio, le differenze in maxima picco successivi sono ≤ 0,5 ° C), stima aumenta di 10 - 20 volte in epoca di equilibratura ad alta temperatura al fine di adeguatamente impoveriscono il ligando durante il secondo esperimento. Il calcolo preciso della costante tasso di conversione di ligando richiede che il secondo esperimento ha più rapido svuotamento del ligando rispetto al primo. Le concentrazioni di ligando estratte dall'analisi globale dei due esperimenti sarà simile e quindi inutilizzabile se lo svuotamento di ligando non è sufficientemente accelerato nel secondo esperimento.</li>
</ol>4. elaborazione dei dati
<ol><li>Aperto il DSC sperimentare i file del software di analisi dati di DSC (Vedi Tabella materiali) ed esportare i dati di potenza pura come fogli di calcolo.</li>
	<li>Importare i fogli di calcolo che contiene i dati di potenza pura nel software per i dati di montaggio.</li>
	<li>Linea di base sottrarre i dati di esempio sottraendo i dati di potenza del buffer del gratuito e -ligando biomolecola esperimenti. Nota: Per l'esperimento di ligando termolabile, sta diminuendo la concentrazione del ligando iniziale con ogni scansione. Pertanto, è ideale per sottrarre la scansione di buffer 1 dalla scansione del campione 1 e così via. Abbiamo trovato che le scansioni di buffer con la cocaina non cambia sensibilmente come procede la conversione di ligando e quindi una scansione di buffer di ligando termolabile singolo può essere utilizzata per sottrarre tutti i dati-ligando termolabili.</li>
	<li>Consente di convertire i dati di potenza del campione basale-sottratto capacità termica. Nota: La conversione richiede volume specifico parziale di biomolecole, che può essere stimato14,15,16. L'equazione per la conversione di potenza a capacità termica è stato descritto in precedenza17.</li>
</ol>5. analisi dei dati
<ol><li>A livello globale adatta l'equilibrazione breve tempo termolabile-ligando calore capacità dataset con un singolo set di baseline, concentrazione del ligando, pieghevole e ligando associazione di parametri come descritto in precedenza4.</li>
	<li>Ripetere la che misura globale per il dataset di equilibrazione lungo tempo al fine di calcolare la costante di velocità per la conversione di ligando termolabili come descritto in precedenza4.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi
I dettagli dell'analisi raccordo globale utilizzato nella Figura 1 e Figura 2 sono stati descritti in precedenza4. Qui, descriviamo gli aspetti pratici dell'esecuzione e l'analisi di esperimenti di binding DSC con ligandi termolabili. Si noti che una previsione di DSC ottenuta per il ligando termolabile da solo viene sottratto dal ligando + biomolecola ...

Calorimetria a scansione differenziale (DSC) è un metodo potente per quantificazione associazione biomolecolari e pieghevole interazioni1,2,3. I punti di forza della DSC includono la capacità di delucidare vincolante e pieghevole meccanismi e per produrre i corrispondenti parametri termodinamici2,3. Inoltre, la DSC può essere eseguita in soluzione in condizioni di quasi-fisiologiche e non richiede etichettatura di biomolecole o legante, ad esempio, con fluorofori, spin-etichette o isotopi nucleari4. Lo strumento esegue la scansione di temperatura, la misurazione della quantità di calore necessaria per denaturare la biomolecola in presenza e in assenza del ligando. I termogrammi risultante vengono utilizzate per estrarre i parametri termodinamici che disciplinano il ligando vincolanti e processi di piegatura. Le informazioni fornite da DSC o altre tecniche termodinamici sono fondamentale per guidare la progettazione di farmaci targeting biomolecole1,5,6,7,8. Tuttavia, la scansione ripetuta ad alte temperature (~ 60-100 ° C) può essere problematico. Ad esempio, molti composti farmacologicamente importanti subiscono riorganizzazione o decomposizione all'esposizione continua a temperature elevate9,10,11, vale a dire, essi sono termolabili. Esame dell'associazione interazioni di DSC in genere richiede più scansioni di avanti e indietro al fine di verificare la riproducibilità del termogramma per analisi termodinamica12. Conversione termica di un ligando iniziale di una forma secondaria con caratteristiche di associazione alterata conduce a pronunciate differenze nella forma e posizione dei termogrammi successivi, poiché la concentrazione del ligando iniziale diminuisce con ogni scansione mentre il conversione termica prodotti si accumulano. Questi set di dati non sono suscettibili di analisi tradizionali.
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di raccordo globale per i DataSet di ligando termolabile DSC che produce il set completo dei parametri termodinamici che disciplinano la piegatura biomolecolari e associazione interazioni da un singolo esperimento-ligando viene fatto riferita per la termogramma necessaria per la biomolecola libero4. L'analisi riduce il tempo sperimentale e il campione richiesto da ~ 10 volte rispetto agli approcci standard DSC. Abbiamo rappresentato per il ligando conversione termica assumendo questo succede durante la parte ad alta temperatura di ogni scansione dove il termogramma non dipende dalla concentrazione del ligando. Di conseguenza, la concentrazione del ligando è una costante all'interno della parte del termogramma che viene utilizzato per estrarre i parametri termodinamici. Abbiamo inoltre dimostrato come la costante di velocità per la conversione termica ligando possa essere ottenuta eseguendo un esperimento supplementare con un periodo più lungo di equilibratura ad alta temperatura. Per sistemi in cui la conversione termica ligando è meno temperatura-dipendente (cioè, che si verificano sensibilmente a tutte le temperature), l'analisi può essere modificato per includere le concentrazioni di ligando variabile. Qui dimostriamo questa procedura per il DNA aptamero MN4 in presenza di cocaina ligando termolabili, che converte rapidamente in benzoilecgonina ad alte temperature (> 60 ° C). Chinina è usata come controllo negativo per thermolability ligando poiché non sottoposti a conversione a queste temperature sperimentale e si lega anche al MN4. Descriviamo l'acquisizione di ligando termolabile DSC DataSet e loro analisi producendo i parametri termodinamici e cinetici del pieghevole, associazione e ligando processi di conversione.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Acqua deioinizzata per biologia molecolare</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0,2 micron filtri sterili per siringhe</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Filtri centrifughi da 3 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per dialisi 0,5-1,0 kDa taglio</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in silicone</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Tappi flangiati DSC in plastica</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore DNA MN4</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Cocaina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Chinino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III microcalorimetro</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr> <tr><td>software DSCRun</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>Software NanoAnalyze</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr> <tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione di profili biomolecolari dsc con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Calorimetria a scansione differenziale (DSC) è una tecnica potente per quantificare i parametri termodinamici che disciplinano biomolecolari pieghevole e interazione di legame. Questa informazione è fondamentale nella progettazione di nuovi composti farmaceutici. Tuttavia, molti ligandi farmacologicamente rilevanti sono chimicamente instabili alle alte temperature utilizzate nelle analisi DSC. Così, associazione di interazioni di misurazione è difficile perché le concentrazioni di ligandi e termicamente convertiti i prodotti sono in continua evoluzione all'interno della cellula del calorimetro. Qui, presentiamo un protocollo utilizzando ligandi termolabile e DSC per rapidamente ottenere informazioni termodinamiche e cinetiche sulla piegatura, l'associazione e ligando processi di conversione. Abbiamo applicato il nostro metodo per il DNA aptamero MN4 che associa la cocaina ligando termolabili. Utilizzando una nuova analisi di raccordo globale che i conti per la conversione di ligando termolabili, il set completo dei parametri di associazione e pieghevole si ottengono da un paio di esperimenti di DSC. Inoltre, ci mostra che la costante di velocità per la conversione di ligando termolabile può essere ottenuta con un solo set di dati supplementari DSC. Le linee guida per l'identificazione e l'analisi dei dati da diversi scenari più complessi è presentata, compreso irreversibile aggregazione della biomolecola, pieghevole lento, lento l'associazione e lo svuotamento rapido del ligando termolabile.

Dati rappresentativi per il ligando termolabile DSC sono mostrati nella Figura 1. La posizione e l'altezza del picco-ligando termolabile sposta successivamente verso quella di biomolecole non associata come il ligando termolabile è esaurito con ogni scansione (Figura 1a). Il profilo di denaturazione gratuito è utilizzato come riferimento per l'endpoint di conversione ligando termolabile (Figura 1b). ...

Vi presentiamo un protocollo per la rapida caratterizzazione biomolecolare pieghevole e associazione interazioni con ligandi termolabile mediante calorimetria differenziale a scansione.

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è estrarre i parametri termodinamici che regolano il ripiegamento biomolecolare e le interazioni di legame mediante calorimetria a scansione differenziale, o DSC, utilizzando un ligando termolabile in appena due esperimenti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biocalorimetria e della progettazione di farmaci, come ad esempio quali sono le grandezze relative dei parametri termodinamici che regolano le interazioni tra biomolecole e inibitori con legame stretto? Il principale vantaggio di questa tecnica è che una titolazione completa del ligando viene eseguita in un singolo esperimento, consentendo un'estrazione rapida dei parametri termodinamici tramite analisi globale di fitting.Per iniziare, preparare i tamponi per la dialisi della biomolecola purificata in soluzione di ligandi. Sottoporre la biomolecola a dialisi contro almeno un litro di tampone utilizzando tubi da dialisi con cutoff compreso tra 0,5 e 1,7 chilodalton. Il passaggio più importante per ottenere dati DSC di alta qualità è la dialisi della biomolecola e del ligando contro il tampone desiderato.Questo garantisce che non siano presenti artefatti dovuti a differenze di tampone nei dati DSC. Filtrare il tampone finale, denominato tampone di lavoro, attraverso un filtro da 0,2 micron che sia stato accuratamente equilibrato con il tampone. Pesare le masse desiderate dei ligandi e scioglierle nel tampone di lavoro filtrato.Se le concentrazioni desiderate del ligando richiedono masse troppo piccole per essere pesate con precisione, preparare una soluzione madre concentrata del ligando. Filtrare la soluzione madre del biomolecola attraverso un filtro da 0,2 micron che sia stato accuratamente equilibrato con il tampone di lavoro. Successivamente, determinare la concentrazione del biomolecola mediante misurazioni di assorbanza.Conservare la biomolecola e il ligando preparati in un refrigeratore a quattro gradi Celsius oppure a meno 20 o meno 80 gradi Celsius, se la biomolecola e i ligandi tollerano il congelamento ed è necessaria una conservazione a lungo termine. Depurare il tampone e le soluzioni di biomolecola e ligando dall'aria in un degasatore da banco prima di caricarli nel calorimetro a scansione differenziale, o DSC. Svitare la manopola di pressione dal DSC.Quindi, collegare un tubo di silicone al buffer di lavoro e fissarlo alla flangia anteriore del capillare di riferimento. Creare un ponte tra il capillare di riferimento e quello del campione collegando la flangia posteriore di riferimento alla flangia anteriore semplice. Successivamente, fissare un pezzo di tubo di silicone alla flangia posteriore del campione, che va collegato a un matraccio di scarico dotato di linea sottovuoto.Accendere la linea del vuoto per lavare il DSC con 200 millilitri di tampone di lavoro. Iniziare collegando sezioni di tubo in silicone lunghe circa tre-cinque centimetri ai raccordi capillari di riferimento. Successivamente, inserire una punta da un millilitro nel tubo in silicone del raccordo posteriore.Aspirare 0,8 millilitri di tampone di lavoro con una pipetta e inserire la punta della pipetta contenente il tampone nel tubo di silicone della flangia di riferimento anteriore. Premere delicatamente il pistone della pipetta per far passare il tampone di lavoro attraverso il tubo di silicone anteriore, nel capillare di riferimento e fino nella punta della pipetta collegata alla flangia posteriore. Premere il pistone della pipetta fino a quando il livello del tampone di lavoro raggiunge appena sopra il tubo di silicone anteriore, quindi rilasciare il pistone della pipetta fino a quando il livello del tampone di lavoro raggiunge appena sopra il tubo di silicone posteriore.Continuare a passare avanti e indietro il buffer di lavoro nel capillare di riferimento per eliminare le bolle d'aria dal volume. Successivamente, tappare la punta della pipetta posteriore con un dito e tirare delicatamente verso l'alto la punta della pipetta posteriore e quella anteriore per rimuoverle dai supporti di riferimento con il tubo di silicone ancora attaccato. Caricare il capillare del campione con il buffer di lavoro come in precedenza.Posizionare un cappuccio di plastica nera sui flangi del campione di riferimento posteriore, lasciando scoperti i flangi anteriori. Collegare la manopola della pressione al DSC, quindi aprire il software del DSC e pressurizzare lo strumento facendo clic sulla freccia rossa verso l'alto nella parte superiore dell'interfaccia, una volta che la lettura della potenza si è stabilizzata. La potenza del DSC è indicata in una casella nell'angolo in alto a destra dell'interfaccia, insieme alla temperatura dello strumento e alla lettura della pressione.Equilibrare il DSC con il tampone di lavoro eseguendo una scansione diretta e inversa nella scheda del metodo sperimentale sul lato sinistro dello schermo. Assicurarsi che l'opzione di scansione sia selezionata per eseguire la scansione termica del DSC e la modalità di scansione della temperatura. Nella finestra dei parametri di temperatura sotto la scheda del metodo sperimentale, fare clic sul pulsante per il riscaldamento.Inserire 1 e 100 gradi Celsius come temperature sperimentali minima e massima, un grado Celsius al minuto come velocità di scansione e 60 secondi come periodo di equilibrazione. Fare clic sul pulsante AddSeries sotto il campo di inserimento per il periodo di equilibrazione. Inserire due nel campo "steps to add" nella finestra popup e selezionare la casella Alternate Heating/Cooling.Fare clic su OK. Le scansioni aggiunte appaiono nella parte inferiore dell'interfaccia. Verificare che i parametri per ciascuna scansione siano quelli desiderati. Avviare l'esperimento facendo clic sul pulsante verde di riproduzione nella parte superiore dell'interfaccia.Passare alla finestra desiderata e inserire un nome file per salvare l'esperimento nella finestra popup. Visualizzare l'avanzamento dell'esperimento facendo clic sulla scheda dati a destra della scheda del metodo sperimentale. Eseguire esperimenti di riferimento per la sottrazione della linea di base dai dati del campione ricaricando il DSC con tampone di lavoro in entrambe le capillari.Raccogliere più scansioni dirette e inverse in un intervallo di temperatura appropriato a un grado Celsius al minuto, con un tempo di equilibrazione in salita di 120 secondi. Eliminare le scansioni di equilibrazione del buffer precedenti dalla parte inferiore dell'interfaccia evidenziandole singolarmente e facendo clic sulla X rossa posta al centro a destra dell'interfaccia. Aggiungere le nuove scansioni facendo clic sul pulsante AddSeries, inserendo 20 nel campo relativo ai passaggi da aggiungere e selezionando la casella Alternate Heating/Cooling.Quindi, fare clic su OK ed eseguire l'esperimento premendo il pulsante verde di riproduzione come in precedenza. Ripetere questi passaggi con il tampone di lavoro contenente la concentrazione desiderata di ligando in entrambe le capillari per ottenere gli esperimenti di riferimento per il ligando. Eseguire due esperimenti separati da utilizzare per determinare la costante di velocità della conversione termolabile.Per il set di dati del biomolecola libera, assicurarsi che la capillare di riferimento contenga il buffer di lavoro mentre la capillare del campione contenga la biomolecola libera alla concentrazione desiderata nel buffer di lavoro. Successivamente, eseguire gli esperimenti del campione utilizzando la stessa procedura di caricamento DSC e gli stessi parametri sperimentali impiegati nelle scansioni di riferimento. Per gli esperimenti con ligando legato, assicurarsi che il ligando sia presente nel buffer di lavoro nella capillare di riferimento e che la biomolecola più il ligando siano nel buffer di lavoro nella capillare del campione.Sciacquare il sistema tra l'aggiunta di ligandi diversi come in precedenza. Eseguire un ulteriore esperimento con la biomolecola legata al ligando termolabile in cui il periodo di equilibrazione ad alta temperatura viene aumentato a 600 secondi e tutti gli altri parametri sperimentali sono gli stessi di prima. Procedere all'elaborazione e all'analisi dei dati come descritto nel protocollo testuale.La posizione e l'altezza del picco del legante termolabile legato si spostano progressivamente verso quelle della molecola non legata man mano che il legante termolabile viene esaurito ad ogni scansione. Il profilo di maturazione 3D viene utilizzato come riferimento per il punto finale della conversione del legante termolabile. Aumentare il periodo di equilibrazione ad alta temperatura determina riduzioni più pronunciate della concentrazione del legante termolabile ad ogni scansione, rispetto al dataset con periodo di equilibrazione breve.Utilizzando i parametri di concentrazione ottenuti dall'analisi globale ottimizzata dei due set di dati, è possibile calcolare la costante di velocità per la conversione del ligando alla temperatura elevata di equilibrio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 72 ore se realizzata correttamente. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di degasare anche il ligando biomolecolare e di eliminare le bolle dalle capillari DSC utilizzando la pipetta di caricamento, al fine di evitare artefatti nei dati.Dopo aver visionato questo video e letto l'articolo, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di DSC su biomolecole, nonché dell'applicazione di analisi di fitting globale per estrarre rapidamente i parametri termodinamici che governano le interazioni di ripiegamento e di legame. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni di legame e ripiegamento in equilibrio, può essere applicato anche ad altri sistemi, come biomolecole che mostrano cinetiche lente di ripiegamento e/o di legame con ligandi.

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Un protocollo generale per l'uso di calorimetria isotermica di titolazione per monitorare la termodinamica vincolante per i sistemi biologici con moderata affinità di legame è presentato.

Calorimetria isotermica di titolazione di misura macromolecola-ligando di affinità

Questo video dimostra la calorimetria differenziale a scansione, una tecnica per studiare l'interazione tra una biomolecola e un ligando. Il legame di un aptamero di DNA e di un ligando termolabile viene studiato applicando ripetuti cicli di riscaldamento e raffreddamento al campione e ottenendo scansioni per l'analisi termodinamica.

Calorimetria differenziale a scansione per studiare l'interazione tra aptamero e ligando termolabile del DNA

Thermophoresis microscala (MST) può essere ampiamente usato per la determinazione di affinità di legame senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il protocollo prevede sovraespressione della proteina GFP-fusa, lisi cellulare in condizioni non denaturanti, e la rilevazione di segnale MST in presenza di concentrazioni variabili di ligando.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

La fluorimetria differenziale a scansione è un metodo ampiamente utilizzato per lo screening di librerie di piccole molecole per interazioni con le proteine. Qui, presentiamo un metodo semplice per estendere queste analisi per fornire una stima della costante di dissociazione tra una piccola molecola e il suo partner proteico.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

Calorimetria differenziale a scansione misura la temperatura di transizione termica (s) ed energia termica totale richiesta per denaturare una proteina. I risultati ottenuti sono utilizzati per valutare la stabilità termica di antigeni proteici in formulazioni di vaccino.

Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell&#39;antigene

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione e purificazione di proteine che sono etichettati con isotopi stabili e successiva caratterizzazione delle interazioni proteina-proteina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala Esperimenti di Termoforesi (MST).

Interazioni di proteine globulari e filamentose di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala submicronica (MST) di misura

La termoforesi su microscala ottiene rapidamente costanti di legame a basso costo del materiale. La termoforesi su microscala etichettata o senza etichetta è disponibile in commercio; tuttavia, la termoforesi senza etichette non è in grado di gestire la diversità delle misurazioni di interazione che possono essere eseguite utilizzando etichette fluorescenti. Forniamo un protocollo per le misure di termoforesi etichettate.

Uso della termoforesi su microscala per misurare le interazioni proteina-lipidi

Il monitoraggio delle variazioni della temperatura di fusione di una proteinabersaglio (ad es.saggio di spostamento termico, TSA) è un metodo efficiente per lo screening di librerie di frammenti di poche centinaia di composti. Presentiamo un protocollo TSA che implementa la fluorimetria a scansione nano-differenziale assistita da robotica (nano-DSF) per il monitoraggio della fluorescenza intrinseca del triptofano e la retrodepersione della luce per lo screening dei frammenti.

Fluorimetria a scansione nano-differenziale per lo screening nella scoperta di piombo basata su frammenti

Questo protocollo descrive un metodo unico per rilevare il legame tra composti e molecole proteiche, offrendo i vantaggi di una perdita minima di campioni proteici e di un'elevata precisione dei dati.

Rilevamento dell'interazione proteina-umbelliferone CD40 tramite fluorescenza a scansione differenziale

Qui, presentiamo il saggio di spostamento termico, una tecnica ad alto rendimento basata sulla fluorescenza utilizzata per studiare il legame di piccole molecole alle proteine di interesse.

Utilizzo del saggio di spostamento termico per sondare il legame del substrato alla selenoproteina O

Impara a caratterizzare rapidamente il ripiegamento e le interazioni di legame biomolecolari mediante calorimetria differenziale a scansione con ligandi termolabili. Questo metodo consente di estrarre parametri termodinamici in sole due prove sperimentali.

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni (Video) | JoVE Journal

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

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