Name: Analisi automatizzata di un esame preferenziale di Chemosensory basato sulla popolazione di Nematode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri l'analisi automatizzata delle preferenze chemosensoriali in Caenorhabditis elegans usando un sistema multi-camera. Questo metodo facilita la ricerca neurobiologica con valutazioni comportamentali standardizzate e replicabili.

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Alcuni ceppi sono stati forniti dal Centro di Genetica di Caenorhabditis (CGC), finanziato da NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Questo lavoro è sostenuto dal Howard Hughes Medical Institute, con il quale PWS è un investigatore.

<ol><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).</li>
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<li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+TRPV+channel+proteins+defines+their+sensory+functions+and+subcellular+localization+in+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons.</a> Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un passo critico nel protocollo è garantire che le lastre di dosaggio abbiano un livello di asciugatura uniforme in diversi giorni sperimentali. Diversi livelli di secchezza provocheranno differenti velocità di diffusione della soluzione nell&#39;agar e, di conseguenza, variazioni nell&#39;esito comportamentale. Quindi le piastre di dosaggio dovrebbero essere sempre fresche nel pomeriggio prima di esperimenti. Il numero di worm testati per ogni analisi dovrebbe essere regolato anche per facilitare il confronto tra i trattamenti. Per riferimento, un worm di tipo selvatico mette in media 4-10 uova / h che producono&gt; 360 worm per ogni analisi se il protocollo di sincronizzazione worm è seguito 17 . Se alcuni ceppi mutanti sono difettosi di uovo, scelgono più verme adulte gravide per l&#39;uovo per raggiungere il numero di progenie. Un altro passo importante del protocollo è quello di gestire delicatamente i worm durante il processo di lavaggio e il collocamento di worm. I vermi sono sensibili agli stimoli meccanici, che suscitano risposte di stress<html> S inversioni e inibizione dell&#39;ovaio 18 . Inoltre, occorre prestare attenzione a definire con precisione il ROI e determinare il valore costante di soglia ottimale per condizioni specifiche di illuminazione prima di procedere all&#39;analisi video. Si consiglia inoltre di ripetere i processi di calibrazione e di soglia se è trascorso un lungo periodo dall&#39;ultimo esperimento. Una limitazione di questo metodo è che non è adatta per analizzare piccole popolazioni di vermi. Tuttavia, se vengono eseguiti i comandi appropriati per determinare l&#39;influenza della presenza di cibo sul comportamento sensoriale, è possibile anche utilizzare l&#39;alimento per limitare la localizzazione esplorativa spaziale dei vermi come nel dosaggio di ritenzione. Inoltre, questo metodo non è destinato a studiare la navigazione a gradiente dello stimolo a causa della vicinanza e delle piccole quantità delle gocce di controllo e di sperimentazione utilizzate. E_content &quot;&gt; In futuro, il software di programmazione che consente il tracciamento multi-worm e l&#39;estrazione funzionale di singolo worm può essere integrato in questo sistema 19 , 20. La registrazione di parametri di comportamento sottile di singoli comportamenti di worm, quali velocità di inversione e ampiezza delle curve del corpo, Un quadro più dettagliato del comportamento chemosensoriale di un singolo worm nel contesto di un dosaggio basato sulla popolazione.Il saggio può essere modificato anche per studiare l&#39;abitudine mediante fori di foratura attraverso il ROI usando aghi siringa con la dimensione del misuratore appropriato e riempendo i fori con agar infuso Con il composto sperimentale o il tampone di controllo, in modo da garantire una concentrazione superficiale più consistente del composto per un periodo di tempo più lungo di registrazione, come è necessario durante gli studi di abitudinazione.Un&#39;altra potenziale applicazione di questo metodo è condurre studi comportamentali comparativi su diverse specie di nematodi. Inoltre, la camera di comportamentoPuò essere modificato in più modi per studiare le risposte comportamentali a stimoli multimodali. Per applicazioni optogenetiche, array di LED ad alta intensità possono essere fissati accanto al supporto della fotocamera per attivare selettivamente i neuroni di interesse durante il test. Gli elementi di riscaldamento, i sistemi di raffreddamento e sensori di temperatura possono anche essere aggiunti alla configurazione per studiare gli effetti della temperatura sui comportamenti sensoriali. Inoltre, i sistemi di erogazione dell&#39;odore possono essere installati all&#39;interno della camera per studiare le interazioni tra modalità odorsensoria e chemosensoria.

Gli animali foraggiati devono integrare gli ingressi da molteplici modalità sensoriali e selezionare le appropriate strategie comportamentali per navigare con successo nell&#39;ambiente. La comprensione di come gli input sensoriali esterni vengono ricevuti e trasfusi in informazioni neurali per guidare la selezione delle azioni è un obiettivo centrale nel campo della neurobiologia. Il nematode genetico tractable, C. elegans , è un attraente modello organizzativo in cui studiare i meccanismi neurali alla base della biologia sensoriale e dell&#39;integrazione multimodale. Anche se C. elegans ha solo 302 neuroni, può rilevare e discriminare tra una grande varietà di stimoli ambientali, compresi composti solubili, odori volatili e temperatura ambiente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . IlNematode C. elegans si basa fortemente sull&#39;apparecchio chemiosensorio per localizzare le fonti alimentari e per avvisare le potenziali minacce. Pertanto, i test comportamentali progettati per esaminare le risposte di C. elegans di tipo selvatico e mutato a stimoli chimici svolgono un ruolo cruciale nella dissezione dei meccanismi genetici, cellulari e neurali sottostanti le notevoli capacità sensoriali di C. elegans . Per analizzare la risposta a composti solubili sono stati descritti tre tipi di saggi: il test a goccia, il dosaggio della chemotaxis e il saggio di ritenzione. Nel test a goccia viene posizionata una piccola goccia del composto alla coda di un verme in movimento e la decisione del verme di invertire o spostarsi in avanti una volta che il liquido raggiunge l&#39;apparato sensoriale anteriore viene valutato 4 . Il test di goccia richiede una piccola preparazione sperimentale ed è utile quando la dimensione del campione dei worm è minore, come nel caso dei worm a laser. Tuttavia, come solo un wormPuò essere analizzato alla volta e lo sperimentatore deve essere presente per tutta la durata del test, il test di caduta può richiedere molto tempo. Il test di goccia è anche vulnerabile a variazioni nella distribuzione di goccia tra ogni worm all&#39;interno di un campione, che può influenzare i risultati complessivi del dosaggio. Un&#39;altra limitazione del test di caduta è che può essere utilizzato solo per analizzare la risposta del verme ai composti avversi in quanto non è possibile discriminare tra un effetto attraente o neutro del composto dal movimento del verme in avanti. Il dosaggio di chemotaxis per composti solubili comporta generalmente la suddivisione di una piastra agar in quattro quadranti, con la soluzione sperimentale mescolata all&#39;agar di due quadranti opposti e la soluzione di controllo mescolata agli altri due quadranti 8 , 9 . All&#39;inizio del test, una goccia di tampone contenente worm è posta al centro della piastra e il numero di worm in<html> Ogni quadrante viene segnato in diversi punti temporali. Il dosaggio della chemotaxis fornisce una maggiore potenza statistica rispetto al test di caduta, in quanto vengono testati in un determinato dosaggio un gran numero di vermi. Tuttavia, una limitazione di questo metodo è che la preparazione delle piastre di dosaggio della chimotaxis richiede grandi quantità di composto sperimentale. Ciò renderà difficile eseguire schermi di comportamento su larga scala se è necessario un processo di purificazione complicato con rese limitate per ottenere il composto di interesse, come nel caso delle molecole di segnalazione ascaroside 10 . Inoltre, il conteggio manuale dei worm durante il test è suscettibile di errori e la perturbazione delle piastre durante il processo di conteggio potrebbe influenzare i risultati. A differenza dei due metodi di cui sopra, il saggio di ritenzione utilizza la visione della macchina, che minimizza l&#39;errore durante il processo di punteggio e riduce l&#39;interferenza del sperimentatore durante il saggio<html> &gt; 11. L&#39;analisi computerizzata delle registrazioni video del comportamento dei worm può anche rivelare dinamica comportamentale sottile che si mancherà quando il punteggio viene eseguito solo in alcuni punti di tempo discreti. Nel saggio di ritenzione, due punti di soluzione vengono aggiunti sui lati opposti di una piccola zona circolare di cibo batterica seguito dal posizionamento di un piccolo numero di vermi nel mezzo della patch alimentare. Il comportamento dei worms viene poi registrato, analizzato e un valore di indice di preferenza viene calcolato in base al numero totale di pixel worm in ciascuna regione di soluzione. Sebbene la presenza di una zona attraente di cibo consente di utilizzare più piccole popolazioni di vermi in ogni dosaggio, il cibo è stato precedentemente dimostrato di sensibilizzare i comportamenti di evasione a repellenti solubili 12 . Inoltre, i vermi presentano una risposta fotofobica alla luce a breve corto d&#39;onda e l&#39;uso di sorgenti luminose a microscopio che emettono luce bianca nella configurazione del comportamento di registrazione potrebbero influenzare il comportamentoS = &quot;xref&quot;&gt; 13. Lo scopo del metodo discusso in questo articolo è quello di registrare e analizzare la preferenza di C. elegans per composti solubili usando un saggio basato sulla popolazione. A tal fine, il metodo attuale integra e migliora gli aspetti di tutti e tre i metodi precedentemente discussi. Consente di testare grandi popolazioni di vermi e richiede solo piccole quantità di soluzione sperimentale da utilizzare in ogni dosaggio. Inoltre, il dosaggio viene condotto all&#39;interno di una camera di comportamento recintata personalizzata con retroilluminazione a LED a infrarossi per ridurre al minimo gli effetti della luce a corto raggio d&#39;onda sul comportamento. Ciascuna camera può anche essere dotata di fotocamere a microscopi, che aumenta il throughput sperimentale senza compromettere lo spazio del banco. Infine, il software di analisi video emette il valore dell&#39;indice di preferenza per ciascun video e una trama di occupazione del worm di accompagnamento per visualizzare la dinamica del comportamento della popolazione nel tempo. La configurazione della camera e unaIl protocollo ssay può essere ulteriormente modificato per studiare le risposte a comportamento multimodale come l&#39;effetto degli odoranti o della temperatura sui comportamenti chemiosensoriali. Questo articolo descrive la costruzione della camera di comportamento e il protocollo di analisi. Esso dimostra anche l&#39;utilità di questo metodo nel valutare la risposta di worm di tipo selvatico e mutanti difettosi chemosensori al reintensivo solubile conosciuto, ioni di rame 4 . Infine, il processo di analisi video che utilizza il software fornito è dettagliato.

<table><tbody><tr><td>Estrusi per intelaiature in alluminio con scanalatura a T</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T101</td><td>Profilo singolo, misura 1", solido</td></tr><tr><td>Staffe</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T236</td><td>1" lungo per estrusi a profilo singolo alto 1"</td></tr><tr><td>Elementi di fissaggio compatti per l'alimentazione finale</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T139</td><td>1" (singolo), confezione da 4</td></tr><tr><td>supporti per pannelli solidi Twist-in</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T251</td> Per tappi terminali in plastica <td>ad alta estrusione da 1</td></tr><tr><td>"</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T91</td><td>Per 1" ad alta estrusione</td></tr><tr><td>Foglio acrilico colato otticamente trasparente</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K211</td><td>3/16" di spessore, 12" x 12"</td></tr> <tr><td>Tessuto in poliestere rivestito in vinile</td><td>McMaster-Carr</td><td>88505K57</td><td>0,027" di spessore, 61" di larghezza,</td></tr><tr><td>gommini</td> <td>in ottone neroMcMaster-Carr</td><td>9604K22</td><td>Misura commerciale 0, diametro esterno 0,545"</td></tr><tr><td>Rondelle in acciaio</td><td>McMaster-Carr</td><td>90107A029</td><td>Vite da 1/4"</td></tr><tr><td>Viti a testa arrotondata</td><td>McMaster-Carr</td><td>90272A546</td><td>Filettatura da 1/4" - 20, lunga 1 - 1/2"</td></tr><tr><td>Retroilluminazione operativa standard</td><td>Luci Smart Vision</td><td>Vedi fornitore locale</td><td>8" x 8", infrarossi 850 nm</td></tr><tr><td>IVP-C1 </td><td>Luci Smart Vision</td> con pentola a controllo variabile <td>Vedi il fornitore</td><td></td>locale</tr><tr><td>Alimentatore T1</td><td>Luci Smart Vision</td><td>Vedi il fornitore</td><td></td>locale</tr><tr><td>Dino lite Pro AM4113T</td><td>Microscopio digitale Dino-Lite</td><td>Vedi il fornitore</td><td></td>locale</tr><tr><td>MS09B supporto per microscopio</td><td>Microscopio digitale Dino-Lite</td><td>Vedi il fornitore locale</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi automatizzata di un esame preferenziale di chemosensory basato sulla popolazione di nematode

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Il nematode, il sistema nervoso compatto di Caenorhabditis elegans di soli 302 neuroni, si basa su un diverso repertorio di comportamenti. Per facilitare la dissezione dei circuiti neurali sottostanti a questi comportamenti è necessario lo sviluppo di test comportamentali robusti e riproducibili. Precedenti studi di comportamento di C. elegans hanno utilizzato varianti di &quot;test di caduta&quot;, un &quot;dosaggio di chemotaxis&quot; e un &quot;test di ritenzione&quot; per indagare la risposta di C. elegans a composti solubili. Il metodo descritto in questo articolo cerca di combinare i punti di forza complementari dei tre suddetti dosaggi. In breve, un piccolo cerchio al centro di ogni piastra di dosaggio è diviso in quattro quadranti con le soluzioni di controllo e sperimentali alternativamente posizionate. Dopo l&#39;aggiunta dei vermi, le piastre di dosaggio vengono caricate in una camera di comportamento in cui le telecamere a microscopio registrano gli incontri dei vermi con le regioni trattate. L&#39;analisi video automatica viene quindi eseguita aNd viene generato un valore di indice di preferenza (PI) per ogni video. L&#39;acquisizione video e le funzioni di analisi automatizzate di questo metodo riducono al minimo il coinvolgimento dello sperimentatore e gli eventuali errori associati. Inoltre, vengono impiegate piccole quantità del composto sperimentale per dosaggio e la configurazione multi-telecamera della camera di comportamento aumenta il throughput sperimentale. Questo metodo è particolarmente utile per condurre schermi comportamentali di mutanti genetici e nuovi composti chimici. Tuttavia, questo metodo non è appropriato per studiare la navigazione a gradiente dello stimolo a causa della stretta vicinanza delle regioni di controllo e di sperimentazione. Non dovrebbe inoltre essere utilizzato quando è disponibile solo una piccola popolazione di vermi. Mentre è idoneo per analizzare le risposte solo a composti solubili nella sua forma attuale, questo metodo può essere facilmente modificato per soddisfare l&#39;interazione sensoriale multimodale e gli studi ottogenetici. Questo metodo può anche essere adattato per analizzare le risposte chemosensoriali di altre specie di nematodi. </p&gt;

La Figura 3A mostra i valori di indice di preferenza ottenuti per accoppiamenti diversi di genotipi e di trattamento. Un valore di indice di preferenza di 1 indica una forte attrazione verso la soluzione collocata nel ROI sperimentale mentre un valore di indice di preferenza di -1 indica una forte repulsione. Un indice di preferenza di 0,02 è stato ottenuto quando la soluzione tampone M13 è stata collocata sia nei controlli ROI che nei controlli sperimentali, dimostrando che non vi è alcuna propensione spaziale verso il ROI. I vermi N2 hanno evitato fortemente gli ioni di rame che hanno portato ad un indice di preferenza di -0.67, che conferma i risultati precedenti che gli ioni di rame sono un forte repellente ( Movie Supplementary 1 ) 4 . Mutanti osm-3 , che non hanno una corretta formazione dei segmenti distali di ciglia sensoriali, hanno mostrato una riduzione significativamente ridotta degli ioni di rame (PI = -0,19) 15 . Mutanti ocr-2 , che sono de<html> In molte risposte nociceptive mediate da ASH, tra cui l&#39;evasione di rame, presentano anche una diminuzione significativa di evitamenti e anche una lieve attrazione verso gli ioni di rame (PI = 0,19) ( Supplementary Movie 2 ) 16 . La Figura 3B riporta i diagrammi rappresentativi di occupazione del worm, che indicano nel tempo la densità dei worm nel controllo rispetto ai ROI sperimentali. Più scuro è il colore dell&#39;area di disegno, maggiore è il numero di pixel di worm nel ROI. La trama di occupazione dei worm N2 trattati con il controllo tampone M13 mostra che il numero di worm in entrambi i ROI rimane simile per tutto il saggio. Tuttavia, la trama di occupazione dei vermi N2 trattati con ioni di rame indica che i worm bloccano fortemente e costantemente il ROI sperimentale durante tutto il test. Gimg &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Rappresentazione fotografica e schematica del comportamento della camera. ( A ) Vista frontale della configurazione della camera di comportamento (a sinistra) e corrispondente rappresentazione schematica del telaio della camera (a destra). I fogli di poliestere opaco racchiudono la camera su tutte le facce, tranne la faccia inferiore, che consente la luce attraverso il pannello a infrarossi. I numeri 1, 2 e 3 corrispondono agli strati di estrusione in (B). ( B ) Schema della vista superiore degli strati di estrusione comprendente il telaio della camera di comportamento. Questo include lo strato superiore (1), lo strato di montaggio della telecamera centrale (2) e lo strato inferiore (3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig2.jpg"/&gt; Figura 2: Modelli di posizionamento e di allineamento delle piastre. ( A ) Il modello di posizionamento della soluzione ha quattro quadranti e marcatori di allineamento numerico. La soluzione di controllo è posizionata nei quadranti destra destra e sinistra, mentre la soluzione sperimentale è posizionata nei quadranti in alto a destra e in basso a sinistra. ( B ) Il modello di allineamento delle piastre ha solo marcatori di allineamento numerico per ridurre al minimo l&#39;occlusione dei vermi nel campo visivo durante la registrazione e l&#39;analisi video. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig3.jpg" /> Figura 3: dati di esempio raccolti utilizzando questo test. ( A ) i valori di indice di preferenza (PI) per il tipo selvatico N2 e il mutante C. elegans </e<html> m&gt; in risposta al buffer M13 e 10 mM CuCl 2. I vermi N2 non hanno mostrato preferenze tra i controlli e le ROI sperimentali quando la soluzione di controllo M13 è stata collocata in entrambi i ROI ma ha fortemente evitato il ROI sperimentale quando sono stati inseriti ioni di rame (PI = 0,02 e -0,67 rispettivamente). I mutanti osm-3 (p802) e gli ocr-2 (ak47) mutanti hanno mostrato una diminuzione significativamente ridotta degli ioni di rame rispetto a N2 (PI = -0,1 e 0,2 rispettivamente). N = 6 assaggi per ogni accoppiamento di trattamento genotipo,&gt; 360 worm per assay, barre di errore indicano ± 1 SEM, *** p &lt;0,001, ANOVA a senso unico seguita da test Tukey onestamente significativa differenza (HSD) post-hoc. ( B ) Per i worm N2 con buffer M13 in entrambi i ROI (top) e N2 worm con buffer M13 nel ROI di controllo e ioni di rame nel ROI sperimentale (bottom). La scala di colore sotto ogni trama di occupazione rappresenta il numero di pixel di worm.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Film supplementare 1: risposta comportamentale dei worm N2 a 10 mM di rame cloruro. I vermi vengono attratti dai quadranti di controllo con il buffer M13 (in alto a sinistra e in basso a destra) ma evitare fortemente i quadranti contenenti ioni di rame disciolti nel buffer M13 (in alto a destra e in basso a sinistra). Il video è stato registrato a 1 fotogramma al secondo e aumentato di 15 volte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_Video_1.mp4">Clicca qui per scaricare questo file.</a> Film aggiuntivo 2: Responsabilità comportamentale di ocr-2 (ak47) Worms a 10 mM Cloruro di rame. I worms vagano in misura uguale in entrambi i quadranti di controllo con buffer M13 (in alto a sinistra e in basso a destra) e il quadranteContenenti ioni di rame disciolti nel buffer M13 (in alto a destra e in basso a sinistra) durante la durata della registrazione. I mutanti presentano una leggera preferenza per i quadranti contenenti ioni di rame all&#39;inizio della registrazione. Il video è stato registrato a 1 fotogramma al secondo e aumentato di 15 volte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_video_2.mp4">Clicca qui per scaricare questo file.</a> File aggiuntivo: Modelli di soluzioni e modelli di allineamento delle piastre. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/JoVE_template.pptx">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Presentiamo una configurazione e un protocollo di registrazione del comportamento che consente l&#39;analisi automatizzata del nematodo, la preferenza di Caenorhabditis elegans per composti solubili in un dosaggio basato sulla popolazione. Questo articolo descrive la costruzione di una camera di comportamento, il protocollo di analisi comportamentale e l&#39;utilizzo del software di analisi video.

Analisi automatizzata di un esame preferenziale di Chemosensory basato sulla popolazione di Nematode

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

L'obiettivo generale di questa configurazione e di questo protocollo di registrazione comportamentale è quantificare la preferenza chemosensoriale a livello di popolazione di C. elegans per composti solubili, utilizzando un sistema di acquisizione video con più telecamere seguito da un'analisi video automatizzata. Questo metodo può facilitare la ricerca sulla neurobiologia di C. elegans consentendo un'analisi comportamentale più rapida e standardizzata di mutanti genetici. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di analizzare contemporaneamente molteplici repliche in condizioni identiche, monitorando al contempo la dinamica temporale della risposta della popolazione di nematodi a stimoli solubili.La dimostrazione del montaggio della camera comportamentale sarà effettuata da Christopher Cronin, un ricercatore di questo laboratorio. Per iniziare, preparare le coperture in tessuto, le barre di supporto per la telecamera, le staffe angolari, le barre di estrusione e l'insieme di montaggio della telecamera come descritto nel protocollo testuale allegato. Partendo dalle barre terminali collegate alla barra centrale, fissare il supporto per la telecamera e i supporti alla struttura di montaggio della telecamera.Successivamente, assemblare il telaio della camera comportamentale. Iniziare fissando quattro barre in alluminio estruso lunghe un piede a una piastra quadrata in poliestere. Far scivolare una barra sulle due dadi a T dell'omni del foglio di tessuto, centrando la barra lungo la larghezza del tessuto.Serrare i dispositivi di fissaggio per assicurare il foglio di tessuto a ciascuna barra. Stendere il foglio quadrato di poliestere sulla superficie di lavoro con le quattro barre di alluminio attaccate in alto. Quindi, infilare otto staffe d'angolo sulle superfici superiori delle quattro barre di alluminio, una a ciascuna estremità di ogni barra.Posizionare le staffe d'angolo sulle barre con le gambe verticali delle staffe allineate alle estremità delle barre e fissarle stringendo le viti nei dadi a T. In ogni angolo, posizionare verticalmente un profilato in alluminio di un piede, infilandolo sui dadi a T presenti sulle due gambe della staffa d'angolo. Successivamente, fissare il profilato verticale alle barre orizzontali stringendo i dispositivi di fissaggio, unendo così le due barre orizzontali adiacenti.Fare scivolare i dadi a coda liberi del supporto per fotocamera a forma di H all'interno dei montanti verticali del telaio. Lasciare che la struttura a H scivoli completamente verso il basso fino a poggiare sui supporti angolari in corrispondenza di ciascun angolo del telaio. Fissare saldamente il supporto per fotocamera serrando le quattro viti dei supporti angolari.Successivamente, utilizzare le quattro barre in alluminio estruso da un piede per assemblare lo strato inferiore della camera. Posizionare le staffe d'angolo in modo che le alette siano allineate con l'estremità della barra e serrare le viti per fissarle. Quindi, inserire le barre tra i montanti del telaio, facendole scivolare lungo i canali verticali contenenti i dadi a T liberi.Posizionare la barra in modo che i bordi superiori dei supporti ad angolo siano a un pollice sotto l'estremità aperta dei montanti e fissarla stringendo le viti dei supporti ad angolo. Successivamente, far scivolare i dadi a T dei quattro fogli rettangolari in poliestere all'interno dei canali delle barre estruse dei montanti per coprire i lati della camera e serrare i dispositivi di fissaggio per bloccarli in posizione. Selezionare un lato come porta per accedere all'interno della camera e rimuovere le due viti e i dadi a T dello strato inferiore della camera.Posizionare un cappuccio di plastica sull'estremit&agrave; superiore di ogni angolo per fungere da piedini per il telaio finito. Ruotare il telaio nel verso corretto e inserire due supporti per pannelli per ogni diapositiva all'interno dello strato dello spazio del telaio, quindi ruotarli per fissarli in posizione. Successivamente, posizionare un pezzo di acrilico trasparente di 12 per 12 pollici sopra i supporti per pannelli per creare una piattaforma per le piastre del saggio.Infine, posizionare la telecamera e il modello della piastra come descritto nel protocollo testuale allegato. Il giorno prima dell'esperimento, disporre 28 piastre vuote da 35 millimetri in pile di cinque o meno su una superficie piana. Riempire ogni piastra saggio con cinque millilitri di agar per terreno di crescita dei nematodi e lasciare asciugare le piastre saggio in posizione verticale con i coperchi rimossi, durante la notte a temperatura ambiente.Nel giorno dell'esperimento, accendere la retroilluminazione, avviare il computer e lanciare il software di acquisizione video della telecamera del microscopio. Collegare la telecamera del microscopio al computer e fare clic sulla miniatura numerata della telecamera nella parte superiore della finestra del software per visualizzare l'immagine in tempo reale della telecamera. Per regolare le impostazioni di registrazione video, aprire il menu del formato video nell'angolo in alto a sinistra dell'immagine della telecamera e selezionare MJPG 1280x1024.Successivamente, aprire il menu della cartella accanto al menu del formato video e selezionare una cartella in cui salvare i file video. Fare clic sull'icona dell'esposizione automatica nell'angolo in alto a destra del flusso video della telecamera e disattivare l'esposizione automatica. Quindi, fare clic sull'icona LED immediatamente a destra dell'icona dell'esposizione automatica per spegnere i LED integrati della telecamera del microscopio.Fare clic sull'icona delle impostazioni adiacente e selezionare monocromatico. Massimizzare il contrasto e regolare la luminosità. Allineare un modello di posizionamento della soluzione sopra il modello di allineamento della piastra della scena e fare clic sull'icona di registrazione del video in time-lapse sul lato sinistro del flusso video della telecamera.Inserire cinque secondi come durata e un secondo come intervallo per registrare un video di calibrazione di cinque secondi a un fotogramma al secondo. Utilizzare una pipetta di vetro da cinque millilitri per aggiungere 1,2 millilitri di tampone per il terreno di coltura dei nematodi in una piastra contenente vermi sincronizzati e agitare delicatamente la piastra per spostare i vermi nel tampone. Aspirare il tampone dalla piastra e trasferire i vermi nel tampone in un tubo microcentrifuga pulito.Lasciare in riposo i tubi per uno o due minuti, in modo che i vermi si depositino sul fondo. Quindi, utilizzare la punta di una pipetta di plastica per rimuovere la maggior quantità possibile di tampone di lavaggio, senza disturbare il pellet di vermi aggregati sul fondo dei tubi. Riempire nuovamente il tubo con un millilitro di tampone fresco per la crescita dei nematodi e ripetere la procedura di lavaggio altre due volte.Successivamente, fissare con del nastro un modello per il posizionamento della soluzione sulla piastra del microscopio stereoscopico. Poi, posizionare una striscia di nastro adesivo doppio su ciascun lato di un modello per l'allineamento della piastra. Allineare il perimetro della piastra del saggio con il cerchio presente sul modello per l'allineamento e premere verso il basso finché il modello non aderisce al fondo della piastra.Quindi, allineare i marcatori del modello della piastra del saggio con i marcatori del modello di posizionamento della soluzione sul microscopio stereoscopico. Successivamente, utilizzare una pipetta P2 per aggiungere un microlitro di tampone M13 in ciascuno dei quadranti uno e quattro. Utilizzare una punta nuova per aggiungere un microlitro di soluzione di CuCl2 10 millimolare in ciascuno dei quadranti due e tre.Utilizzare una pipetta di Pasteur in vetro per trasferire i vermi lavati sulle piastre per il saggio una volta che le gocce di soluzione sono state completamente assorbite nell'agar. Posizionare una goccia di vermi sulle aree sopra e sotto le regioni circolari trattate. Piegare il tessuto in quattro e utilizzare il bordo smussato per assorbire il tampone di lavaggio in eccesso sulle piastre per il saggio.Disporre immediatamente le piastre per il saggio sotto le telecamere del microscopio nella camera comportamentale allineando i numeri sugli angoli del modello. Attendere due o tre minuti per consentire ai vermi di abituarsi alle piastre del saggio. Quindi, fare clic sull'icona di registrazione del video time-lapse situata sul lato sinistro del flusso video della telecamera e inserire 10 minuti come durata e un secondo come intervallo per registrare un video di 10 minuti con un fotogramma al secondo.Infine, fare clic su "start" per iniziare la registrazione video. Per ogni fotogramma video, la funzione di indice di preferenza conta il numero di pixel del verme in ciascuna regione di interesse e calcola la percentuale di un pixel rispetto al numero totale di pixel nella regione di interesse. I valori dell'indice di preferenza ottenuti per diverse combinazioni di genotipo e trattamento sono mostrati qui.Un valore positivo dell'indice di preferenza indica un'attrazione verso il trattamento, mentre un valore negativo dell'indice di preferenza indica una repulsione. Un indice di preferenza pari a 0,02 si ottiene quando la soluzione tampone M13 è posta sia nella regione di controllo che in quella sperimentale di interesse, dimostrando l'assenza di un bias spaziale. Questo grafico mostra inoltre che i vermi N2 hanno evitato fortemente gli ioni rameici, ottenendo un indice di preferenza di 0,67.Inoltre, gli osm-3, che presentano difetti nella formazione delle ciglia sensoriali, e i mutanti ocr-2, difettivi nelle risposte nocicettive mediate da ASH, mostrano una ridotta evitamento e persino una lieve attrazione verso gli ioni rameici. Durante l'esecuzione di questo protocollo, è importante lavorare rapidamente ma anche con delicatezza e costanza. La configurazione dell'apparato di registrazione e il protocollo del saggio possono essere facilmente adattati per caratterizzare le risposte comportamentali di popolazione derivanti dalle interazioni tra diverse varietà sensoriali di C. elegans.

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JoVE Journal

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Comportamento

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C. elegans Saggio della chemiotassi: un metodo per testare la chemiosensazione nei vermi

I ricercatori possono innescare un movimento su richiesta in C. elegans applicando un campo elettrico che i vermi percepiscono e a cui rispondono. Questo video introduce il comportamento elettrotattico e mostra un protocollo campione che viene eseguito in un dispositivo microfluidico.

Saggio di elettrotassi: un metodo per osservare la locomozione in C. elegans

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Esaminare il comportamento di chemioevitazione nei vermi transgenici utilizzando il saggio di evitamento osmotico

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C. elegans Chemiotassi Assay

I saggi comportamentali forniscono potenti strumenti per comprendere la funzione neuronale. Qui presentiamo diversi protocolli per quantificare il comportamento alimentare predatorio trovato nel nematode modello Pristionchus pacificus e nei suoi parenti. Inoltre, forniamo metodi per analizzare gli adattamenti all'alimentazione predatoria, comprese le strutture della bocca e i denti.

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Qui presentiamo un esame specifico di Caenorhabditis elegans progettato per valutare i cambiamenti nel comportamento avversione di rame e la capacità di individuare una fonte di cibo comune, in quanto l'organismo progredisce da uno stato alimentare ben nutrito e affamato.

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Descriviamo i protocolli per l'utilizzo della piattaforma di tracking del nematode ampio campo di vista (WF-NTP), che consente velocità effettiva elevata caratterizzazione fenotipica di grandi popolazioni di Caenorhabditis elegans. Questi protocolli possono essere utilizzati per caratterizzare i sottili cambiamenti comportamentali in ceppi mutanti o in risposta al trattamento farmacologico in modo altamente scalabile.

Analisi del comportamento di grande c. elegans popolazioni utilizzando un ampio campo di vista Monitoraggio piattaforma automatizzata

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Qui, presentiamo un protocollo per testare l'apprendimento associativo eseguendo il condizionamento classico nell'organismo modello C. elegans. Il paradigma si basa sull'abbinamento della concentrazione di sale nell'ambiente con la presenza o l'assenza di cibo, che altera la loro chemiotassi verso o lontano dal sale.

Misurazione dell'apprendimento associativo nella chemiotassi del nematode Caenorhabditis elegans

Questo protocollo stabilisce metodi per estrarre e quantificare le risposte al feromone sessuale volatile in C. elegans, fornendo strumenti per studiare la comunicazione chimica e la traiettoria di navigazione.

Estrazione di feromoni sessuali volatili e test di chemioattrazione in Caenorhabditis elegans

Scopri l'analisi automatizzata delle preferenze chemosensoriali in Caenorhabditis elegans usando un sistema multi-camera. Questo metodo facilita la ricerca neurobiologica con valutazioni comportamentali standardizzate e replicabili.

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