Analisi automatizzata di un esame preferenziale di Chemosensory basato sulla popolazione di Nematode

L'obiettivo generale di questa configurazione e protocollo di registrazione del comportamento è quantificare la preferenza chemiosensoriale basata sulla popolazione di C Elegans per i composti solubili utilizzando un sistema di acquisizione video multi-camera, seguito da un'analisi video automatizzata. Questo metodo può facilitare la ricerca neurobiologica di C Elegans consentendo un'analisi comportamentale più rapida e standardizzata dei mutanti genetici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che più repliche possono essere analizzate simultaneamente in condizioni identiche, monitorando al contempo le dinamiche temporali della risposta della popolazione di nematodi ai segnali solubili.

A dimostrare l'assemblaggio della camera comportamentale sarà Christopher Cronin, uno scienziato dello staff di questo laboratorio. Per iniziare, preparare le coperture in tessuto, le barre di montaggio della telecamera, le staffe angolari, le barre di estrusione e il gruppo di montaggio della telecamera come descritto nel protocollo di testo allegato. Iniziando con le barre terminali attaccate alla barra centrale, fissare il supporto della fotocamera e le fondine al gruppo di montaggio della fotocamera.

Quindi, assemblate il telaio della camera di comportamento. Inizia attaccando quattro barre di alluminio estruso con un piede a un foglio quadrato di poliestere. Far scorrere una barra sui due dadi a T dell'omni del foglio di tessuto, centrando la barra lungo la larghezza del tessuto.

Stringere i dispositivi di fissaggio per fissare il foglio di tessuto a ciascuna barra. Stendere il foglio quadrato di poliestere sul piano di lavoro con le quattro barre di alluminio attaccate sulla parte superiore. Quindi, infilare otto staffe angolari sulle superfici superiori delle quattro barre di alluminio, una a ciascuna estremità di ciascuna barra.

Posizionare le staffe angolari sulle barre con le gambe verticali della staffa a filo con l'estremità delle barre e fissarle in posizione serrando le viti nei dadi a T. Ad ogni angolo, posizionare un montante in estrusione di alluminio con un piede, facendo scivolare l'estrusione sui dadi a T sulle due gambe della staffa angolare. Quindi, fissare la barra verticale alle barre orizzontali serrando i dispositivi di fissaggio, unendo così le due barre orizzontali adiacenti.

Infilare i dadi a T allentati del gruppo di montaggio della fotocamera a forma di H nei montanti del telaio. Lascia che la H scivoli fino in fondo per appoggiarla sopra le staffe angolari ad ogni angolo del telaio. Fissare il gruppo di montaggio della telecamera in posizione, serrando le quattro viti della staffa angolare.

Quindi, usa le ultime quattro barre di alluminio estruso da un piede per assemblare lo strato inferiore della camera. Posizionare le staffe angolari con le gambe delle staffe a filo con l'estremità della barra e serrare le viti per fissarle in posizione. Quindi, infilare le barre tra i montanti del telaio con i dadi a T allentati nei canali dei montanti.

Posizionare la barra in modo che i bordi superiori delle staffe angolari siano un pollice sotto l'estremità aperta dei montanti e fissarla in posizione serrando le viti della staffa angolare. Quindi, far scorrere i dadi a T dei quattro fogli rettangolari di poliestere verso il basso nei canali delle barre di estrusione verticali per coprire i lati della camera e serrare i dispositivi di fissaggio per fissarli in posizione. Selezionare un lato che sia una porta per accedere all'interno della camera e rimuovere le due viti e i dadi a T nello strato inferiore della camera.

Posiziona un tappo di plastica all'estremità superiore di ogni angolo che funga da piedini per il telaio completato. Capovolgere il telaio con il lato destro rivolto verso l'alto e inserire due supporti per pannello per diapositiva all'interno dello strato di spazio del telaio, quindi ruotarli per fissarli in posizione. Quindi, posizionare un pezzo di acrilico trasparente da 12 x 12 pollici sopra i supporti del pannello per fornire un tavolino per le piastre di analisi.

Infine, posizionare la telecamera e il modello di tavolino come descritto nel protocollo di testo allegato. Il giorno prima dell'esperimento, posiziona 28 piastre vuote da 35 millimetri in pile di cinque o meno su una superficie piana. Riempire ogni piastra di analisi con cinque millilitri di agar per terreni di crescita di nematodi e lasciare asciugare le piastre di analisi in posizione verticale senza coperchio, per una notte a temperatura ambiente.

Il giorno dell'esperimento, accendi la retroilluminazione, avvia il computer e avvia il software di acquisizione video della fotocamera del microscopio. Collega la fotocamera del microscopio al computer e fai clic sulla miniatura numerata della fotocamera nella parte superiore della finestra del software per visualizzare il feed live della fotocamera. Per regolare le impostazioni di registrazione video, apri il menu del formato video nell'angolo in alto a sinistra del feed della fotocamera e seleziona MJPG 1280x1024.

Quindi, apri il menu della cartella accanto al menu del formato video e seleziona una cartella in cui salvare i file video. Fai clic sull'icona dell'esposizione automatica nell'angolo in alto a destra del feed della fotocamera e disattiva l'esposizione automatica. Quindi, fare clic sull'icona LED immediatamente a destra dell'icona di esposizione automatica per disattivare i LED della fotocamera del microscopio integrata.

Fare clic sull'icona delle impostazioni adiacente e selezionare, monocromatico. Massimizza il contrasto e regola la luminosità. Allinea un modello di posizionamento della soluzione sopra il modello di allineamento della piastra del tavolino e fai clic sull'icona di registrazione video timelapse sul lato sinistro del feed della telecamera.

Immettere cinque secondi per la durata e un secondo per l'intervallo per registrare un video di calibrazione di cinque secondi a un fotogramma al secondo. Utilizzare una pipetta di vetro da cinque millilitri per aggiungere 1,2 millilitri di tampone per terreni di crescita dei nematodi a una piastra di vermi sincronizzati e agitare delicatamente la piastra per spostare i vermi nel tampone. Pipettare il tampone dalla piastra ed erogare i vermi nel tampone in una provetta per microcentrifuga pulita.

Lascia riposare i tubi per uno o due minuti per consentire ai vermi di depositarsi sul fondo. Quindi, utilizzare una punta per pipetta in plastica per rimuovere quanto più tampone di lavaggio possibile dalle provette senza disturbare il pellet di vermi aggregati sul fondo delle provette. Riempire il tubo con un millilitro di tampone per terreno di crescita per nematodi pulito e ripetere la procedura di lavaggio altre due volte.

Quindi, fissare con nastro adesivo un modello di posizionamento della soluzione sopra il tavolino di un microscopio da dissezione. Quindi, posizionare una striscia di nastro biadesivo su entrambi i lati di un modello di allineamento della piastra. Allineare il perimetro della piastra di analisi con il cerchio sulla dima di allineamento della piastra e premere verso il basso finché la dima non aderisce alla parte inferiore della piastra.

Quindi, allineare i marcatori dei membri del modello della piastra di saggio con i marcatori dei membri del modello di posizionamento della soluzione sul microscopio da dissezione. Quindi, utilizzare una pipetta P2 per posizionare un microlitro del tampone M13, ciascuno nei quadranti uno e quattro. Utilizzare una nuova punta per posizionare un microlitro di soluzione di CuCl2 da 10 millimolari ciascuno nei quadranti due e tre.

Utilizzare una pipetta pasteur di vetro per trasferire i vermi lavati sulle piastre di analisi una volta che le gocce di soluzione sono state completamente assorbite nell'agar. Posizionare una goccia di vermi sulle aree sopra e sotto le regioni trattate circolari. Piegare il tessuto quattro volte e utilizzare il bordo smussato per assorbire il tampone di lavaggio in eccesso sulle piastre di analisi.

Disporre immediatamente le piastre di analisi sotto le telecamere del microscopio nella camera comportamentale allineando i numeri degli angoli del modello. Attendere due o tre minuti per consentire ai vermi di acclimatarsi alle piastre di analisi. Quindi, fai clic sull'icona di registrazione video timelapse sul lato sinistro del feed della telecamera e inserisci 10 minuti per la durata e un secondo per l'intervallo per registrare un video di 10 minuti di un fotogramma al secondo.

Infine, fai clic su Avvia, per avviare la registrazione video. Per ogni fotogramma video, la funzione dell'indice delle preferenze conta il numero di pixel worm in ogni area di interesse e calcola la percentuale di un pixel sul numero totale di pixel nell'area di interesse. Di seguito sono riportati i valori dell'indice di preferenza ottenuti per i diversi genotipi e accoppiamenti di trattamento.

Un valore dell'indice di preferenza positivo indica un'attrazione per il trattamento, mentre un valore dell'indice di preferenza negativo indica repulsione. Un indice di preferenza di 0,02 si ottiene quando la soluzione tampone M13 è stata posizionata sia nella regione di controllo che in quella sperimentale di interesse, dimostrando che non vi è alcuna distorsione spaziale. Questo grafico mostra anche che i vermi N2 hanno fortemente evitato gli ioni rame, con un indice di preferenza di 0,67.

Inoltre, osm-3, che sono difettosi nella formazione di cillia sensoriali, e i mutanti ocr-2 che sono difettosi nelle risposte nocicettive mediate da ASH hanno mostrato una diminuzione dell'evitamento e anche una lieve attrazione per gli ioni rame. Durante il tentativo di questo protocollo, è importante lavorare velocemente ma anche in modo fluido e coerente. L'impostazione della registrazione e il protocollo di analisi possono essere facilmente adattati per caratterizzare le risposte comportamentali basate sulla popolazione che derivano dalle interazioni tra diverse varietà sensoriali di C Elegans.