Name: La morfologia dei capelli di radice di semenzali di Arabidopsis in una piattaforma di Microfluidic di due-strato di imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri un metodo microfluidico per coltivare Arabidopsis thaliana e analizzare la morfologia delle radici in tempo reale. La piattaforma confina le radici in un unico piano ottico per imaging ad alta risoluzione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo manoscritto è stato autore di UT-Battelle, LLC sotto contratto no. DE-AC05-00OR22725 con l'US Department of Energy. Mantiene il governo degli Stati Uniti e l'editore, accettando l'articolo per la pubblicazione, riconosce che il governo degli Stati Uniti mantiene una licenza non esclusiva, liberata, irrevocabile, mondiale per pubblicare o riprodurre il modulo pubblicato di Questo manoscritto, o consentire ad altri di farlo, per scopi di governo degli Stati Uniti. Il dipartimento dell'energia fornirà accesso del pubblico a questi risultati di ricerca sponsorizzato dal governo federale conformemente al piano di accesso pubblico DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Questo lavoro è stato supportato in parte dalla genomica Science Program, US Department of Energy, Office of Science, biologiche e ricerca ambientale, nell'ambito dell'impianto microbo interfacce scientifica Focus Area (http://pmi.ornl.gov). La fabbricazione delle piattaforme microfluidiche è stata effettuata nel laboratorio di ricerca di nanofabbricazione al centro per Nanophase Materials Sciences, che è un DOE Office of Science utente Facility. JAA è supportato da una borsa di ricerca laureato NSF DGE-1452154

1. due-strato piattaforma Fabrication
<ol>
	<li>Fabbricazione dei maestri multistrati
	<ol>
		<li>Spin cappotto photoresist negativo a base epossidica (~63.45% solidi, 1.250 cSt) secondo le specifiche del produttore (2.000 giri/min per 45 s) su un wafer di silicio del diametro di 4 pollici per ottenere l'altezza desiderata di 20 µm per il primo strato di design.</li>
		<li>Soft-cuocere le cialde di resistere rivestito per 4 min a 95 ° C. Consentire la cialda raffreddare per 5 min. esporre la cialda ai raggi UV per 15 s (~ 150 mJ/cm2 a 365 nm) attraverso un photomask in un UV contatto Allineatore per definire la geometria dello strato inferiore.</li>
		<li>Post-esposizione cuocere la cialda per 5 min a 95 ° C. Senza sviluppo, torna il wafer alla spalmatrice di spin e spin su un secondo strato di photoresist negativo a base epossidica (~76.75% solidi, 80.000 cSt) a 3.000 giri/min per raggiungere un secondo strato di altezza di 150-200 µm.</li>
		<li>Consentire la cialda riposare per 5 minuti prima di trasferire in una piastra di 95 ° C per 45 min. Dopo la cottura sulla piastra riscaldante, rimuovere la cialda e consentire il resistere a raffreddare e indurire a temperatura ambiente per un altro 5 minuti su una superficie piana. Allineare ed esporre la cialda per il secondo strato fotomaschere per 30 s in un allineatore contatto UV (dose di circa 300 mJ/cm2).</li>
		<li>Eseguire un post-esposizione cuocere mettendo la cialda su una piastra per 15 min a 95 ° C e quindi consentire la cialda a raffreddare su una superficie piana per 5 min prima di sviluppare.</li>
		<li>Sviluppare contemporaneamente entrambi gli strati resistere mettendo la cialda in un piatto di plastica e sommergendo la cialda in sviluppatore appropriato (Vedi Materiali tavolo). Scuotere delicatamente il piatto occasionalmente per lavare sviluppatore fresco sopra la cialda.</li>
		<li>Dopo 17 min, sciacquare la cialda con isopropanolo (IPA). Se viene visualizzata la finestra di una patina bianca, continuino ad iterare tra risciacquo la cialda con sviluppatore e IPA, fino a quando il film scomparirà. Asciugare il wafer di silicio a motivi con azoto.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polydimethylsiloxane Soft-Litografia
	<ol>
		<li>Esporre il wafer di silicio per un plasma ad aria per 30 s in un plasma cleaner impostato su high (Vedi materiali tavolo) per pulire. Silanizzare la cialda con tricloro (1h, 1h, 2H, 2h-perfluoro-n-octil) Silano in una cappa chimica su una piastra sotto il punto di infiammabilità del silano (85 ° C) per 2 h.</li>
		<li>Versare un rapporto 10:1 di polidimetilsilossano (PDMS) per agente indurente sul master di wafer di silicio. Degassare il PDMS misto in una camera a vuoto e poi curare il polimero in forno a 70 ° C per 1 ora o fino a quando il PDMS è completamente guarito.</li>
		<li>Usando un bisturi, tagliare i dispositivi PDMS e sbucciatele da master di wafer di silicio. Utilizzare un punzone di biopsia di 1,5 mm per creare insenature seme e trattamento, l'ingresso di seme ad un angolo di 45° per incoraggiare la crescita delle radici nel canale principale di punzonatura.</li>
		<li>Utilizzare nastro adesivo trasparente per rimuovere i detriti dal dispositivo PDMS e posizionare il lato di progettazione del dispositivo su un vetrino coprioggetti. Autoclave i dispositivi assemblati.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. dispositivi di impianto
<ol>
	<li>Preparazione del seme di Arabidopsis thaliana
	<ol>
		<li>Superficie sterilizzare semi di a. thaliana in un tubo di microfuge con una soluzione di candeggina commercialmente disponibili 30% diluito in detergente di Triton X deionizzata acqua e 0,1% per minimo 7 semi di lavare 4 volte con acqua sterile.</li>
		<li>Stratificare i semi di microfuge tubo di refrigerazione durante la notte o fino ad una settimana a 4 ° C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione del dispositivo
	<ol>
		<li>Posizionare i dispositivi sterilizzati in un vuoto degasaggio camera per eliminare l'aria dal gas permeabile PDMS e fluidici canali per migliorare la facilità di riempimento.</li>
		<li>Rimuovere i dispositivi dalla camera a vuoto e immergere immediatamente i dispositivi in una capsula Petri riempiti di liquido ¼ forza basata vegetale media a pH 5.7.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta, tirare liquido attraverso le insenature per riempire il dispositivo. Assicuratevi che nessun bolle d'aria rimangano all'interno dei canali mediante ispezione visiva.</li>
		<li>Trasferire i singoli dispositivi di nuovo asciutto Petri. Versare o pipetta agar caldo intorno al dispositivo fino a quando il livello di agar è quasi a filo con la parte superiore del dispositivo PDMS. Consentire l'agar solidificare. Nota: I dispositivi sono ora pronti per piantare i semi o possono essere conservati a 4 ° C fino a quando necessario.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Piantare i semi all'interno dei dispositivi
	<ol>
		<li>In un ambiente sterile, trasferire un seme sterilizzato all'ingresso di ogni dispositivo usando una pipetta piccola.</li>
		<li>Copertina di Petri con cera film (Vedi Materiali tavolo) e posto in una camera di crescita in bicicletta di chiaro/scuro o davanzale a temperatura ambiente. Orientare la piastra di Petri in modo che i dispositivi sono verticali e gravità incoraggerà le radici di crescere attraverso il canale.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. trattamento
<ol>
	<li>Trattamenti sperimentali
	<ol>
		<li>Al momento desiderato nello sviluppo del semenzale, aggiungere il trattamento sperimentale al semenzale aggiungendo una quantità prescritta del trattamento per ciascuna delle porte 8 lato tramite pipetta.</li>
		<li>Richiudere la capsula di Petri e tornare alla camera di crescita o davanzale.</li>
		<li>Procedere con imaging campioni all'ora desiderata per catturare momenti individuali o iniziare la formazione immagine di lasso di tempo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. optical Imaging
<ol>
	<li>Abbassare l'Imaging ad alta risoluzione (4-20 X)
	<ol>
		<li>Posto l'intera capsula di Petri contenente il dispositivo ed il semenzale sotto un microscopio invertito campo luminoso per campo luminoso ad alta risoluzione (4-20 X) più basso o imaging (DIC) contrasto differenziale di interferenza. Ottimizzare le condizioni di illuminazione per delucidare le caratteristiche morfologiche di interesse regolando i tempi di esposizione, luminosità della lampada, l'apertura e la polarità della luce. Guidare la fase per l'area desiderata della radice e concentrarsi sulla radice o root hair(s) di interesse.</li>
		<li>Acquisire un punto di tempo singolo o una serie temporale di immagini. Per visualizzare la crescita dei peli radicali, immagine cresciti peli radicali una volta al minuto. Per visualizzare la crescita della radice principale, acquisire una sola immagine ogni 30 min ritorno di Petri e le piantine per camera di crescita o davanzale in posizione verticale dopo formazione immagine è completa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Maggiore formazione immagine ad alta risoluzione (20-63 X)
	<ol>
		<li>Una volta che il semenzale è cresciuto per un tempo desiderato, è possibile utilizzare pinze per rimuovere vetrino coprioggetto e dispositivo da agar. Pulire fuori la parte inferiore del coprivetrino utilizzando un tessuto di laboratorio di etanolo a contatto.</li>
		<li>Applicare i supporti consigliati immersione all'obiettivo come suggerito dal costruttore della lente del microscopio. Posare il coprioggetto sul palco di microscopio e alzare il tavolino per contattare il supporto di immersione sull'obiettivo. Ottimizzare le condizioni di illuminazione regolando i tempi di esposizione, luminosità della lampada, l'apertura e la polarità della luce. Guidare la fase per l'area desiderata e la messa a fuoco su root hair(s) di interesse. Nota: Per visualizzare il flusso citoplasmatico è necessario DIC e marcatori di fluorescenza sono necessari per visualizzare il movimento degli organelli.</li>
		<li>Per quantificare la crescita dei capelli di radice nel corso del tempo, acquisire un'immagine per min. Per visualizzare il movimento degli organelli, ridurre al minimo il tempo di esposizione di fluorescenza pur mantenendo un segnale di fluorescenza identificabili dagli organelli. Più velocemente il tempo di esposizione consente di acquisire immagini degli organelli. Più time-lapse imaging, per utilizzare un'incubatrice di fase imaging di cellule vive per mantenere l'umidità e temperatura ambiente. Nota: Un obiettivo di olio X 63 è consigliato per imaging dei capelli di radice organelli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. non-Optical Imaging
<ol>
	<li>Preparazione del dispositivo
	<ol>
		<li>Una volta che il semenzale è cresciuta per il tempo desiderato,</li></ol></li></ol>rimuovere il dispositivo e il vetrino coprioggetto da di Petri.
		<li>Capovolgere il dispositivo e Sbucci delicatamente il vetrino coprioggetti in modo che la radice rimane all'interno del canale PDMS.</li>
		<li>Procedere per utilizzare il dispositivo PDMS come substrato per la radice nella maggiore forza atomica di risoluzione o microscopia elettronica a scansione.</li>
	
	
	<li>Microscopia elettronica a scansione
	<ol>
		<li>Depositare un sottile (~ 20 nm) strato di cromo sulla radice e dintorni di PDMS utilizzando una pistola Electron Beam evaporazione bicamerale.</li>
		<li>Trasferire la radice e il dispositivo PDMS alla Camera microscopio elettronico a scansione. Nota: Imaging condizioni, cioè tensione, corrente e lavora a distanza dovrà essere ottimizzati per ottenere la risoluzione desiderata per una determinata applicazione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Microscopia a forza atomica (AFM)
	<ol>
		<li>Montare il lato di radice del dispositivo PDMS fino il titolare di un esemplare AFM. Per aumentare il contrasto nella fotocamera e distinguere più facilmente la radice dal PDMS, posizionare il dispositivo PDMS su un substrato piatto riflettente (come mica rivestita in oro) prima di montare il dispositivo sul portacampioni AFM.</li>
		<li>Fissare un attacco ben liquido sopra il dispositivo PDMS e riempirlo con acqua per mantenere le radici idratate durante la formazione immagine.</li>
		<li>Caricare il portacampioni in AFM. Regolare il controllo di z per lo spessore del dispositivo PDMS e guidare il cantilever nella regione di interesse sulla radice usando una macchina fotografica come guida.</li>
		<li>Allineare il laser con la punta del cantilever. Per ottenere risultati ottimali con formazione immagine modalità di contatto, utilizzare cantilever con costanti delle molle di 0,01 o 0,03 N/m per esercitare una forza minima sulla radice durante la scansione.</li>
		<li>Abbassare lentamente il meccanismo di scansione fino a mensola appena entra in contatto con il campione. Regolare le dimensioni di scansione per la regione desiderata e scegliere una velocità di scansione di 1 linea/s con 256 punti di tensione per ogni riga. Acquisire la scansione.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Pritchard, S. G. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Seth_Pritchard/publication/229773581_Soil_organisms_and_global_climate_change/links/53ee8d000cf26b9b7dccbff1.pdf">Soil organisms and global climate change.</a> Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).</li>
<li>Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-root+production+dominates+response+of+a+deciduous+forest+to+atmospheric+CO2+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natll.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment.</a> Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).</li>
<li>McCormack, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+fine+roots+improves+understanding+of+below-ground+contributions+to+terrestrial+biosphere+processes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes.</a> New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).</li>
<li>Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+regulation+of+polar-growth+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">ROS regulation of polar-growth in plant cells.</a> Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).</li>
<li>Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-540-79405-9_8">Root Hairs</a>. , 211-232 (2009).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+an+integrated+microfluidic+chip+for+plant+science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+fluorescence+imaging+of+Arabidopsis+root+growth+with+rapid+manipulation+of+the+root+environment+using+the+RootChip%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li>
<li>Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+chip+for+high-throughput+phenotyping+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis.</a> Lab Chip. 14 (7), 1281(2014).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat. Methods. 9 (11), (2012).</li>
<li>Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+Root+using+Multi-Laminar+Flow+on+a+Microfluidic+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip.</a> Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).</li>
<li>Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7051054/">Early characterization method of plant root adaptability to soil environments.</a> Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).</li>
<li>Sanati Nezhad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platforms+for+plant+cells+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platforms for plant cells studies.</a> Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3604788">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).</li>
<li>Rigas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+gravitropism+and+root+hair+development+constitute+coupled+developmental+responses+regulated+by+auxin+homeostasis+in+the+Arabidopsis+root+apex%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytolol%22%5BJournal%5D)">Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex.</a> New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).</li>
<li>Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+elongation%2C+water+stress%2C+and+mechanical+impedance%3A+A+review+of+limiting+stresses+and+beneficial+root+tip+traits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits.</a> J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).</li>
<li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+in+poly%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophor%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li>
<li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li>
<li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).</li>
<li>Talbot, M. J., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+and+cell+outline+imaging+in+plant+tissues+using+the+backscattered+electron+detector+in+a+variable+pressure+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope.</a> Plant Methods. 9 (1), 40(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo descritto in questo articolo per la creazione di una piattaforma di pianta-on-a-chip è unico in quanto i due strati di design confini i capelli di radice di un unico piano di formazione immagine e la piattaforma può essere decostruiti ed usati come substrato per l'imaging non ottici ad alta risoluzione . Usando la formazione immagine non ottici ad alta risoluzione può fornire informazioni preziose su tessuto della pianta che non poteva essere ottenuto da imaging ottico da solo. Ad esempio, formazione immagine A...

Caratteristiche di radice bene aumentano acqua e acquisizione dei nutrienti per la pianta, esplorare nuovi spazi di terreno e aumentando la superficie di radice totale. Il fatturato di queste caratteristiche del bene principale svolge un ruolo importante nello stimolare la catena alimentare della metropolitana1 e il numero di radici fini in alcune specie di piante è previsto a doppia sotto anidride carbonica atmosferica elevata2. Radici fini sono generalmente definite come quelli inferiori a 2 mm di diametro, anche se nuove definizioni di avvocato per la caratterizzazione di radici fini dalla loro funzione3. Come molte radici fini, peli radicali forniscono la funzione di assorbimento e di assorbimento, ma occupano uno spazio molto più piccolo con diametri dell'ordine di micron. A causa delle loro piccole dimensioni, peli radicali sono difficili da immagine in situ e sono spesso trascurati come parte dell'architettura complessiva radice nel campo scala esperimenti e modelli.
Ex terra dei capelli di radice studia, come nel caso di piantine coltivate su piastre di agar, hanno fornito preziose informazioni sulla crescita cellulare e trasporti4,5la comunità scientifica. Mentre piastre di agar consentono sistemi della radice essere imaged in modo non distruttivo e in tempo reale, essi non offrono alta controllo ambientale per l'aggiunta di trattamenti sperimentali come le sostanze nutrienti, ormoni vegetali o batteri. Una soluzione emergente a facilitare la formazione immagine di alta risoluzione mentre anche offrendo dinamico controllo ambientale è stato l'avvento di piattaforme di microfluidica per studi di pianta. Queste piattaforme hanno permesso la crescita distruttiva e la visualizzazione di diverse specie vegetali per throughput elevato phenotyping6,7,8,9, trattamenti chimici isolati 10, vigore misure11,12e l'aggiunta di microrganismi13. Disegni di piattaforma microfluidica si sono concentrati sull'uso di strati fluidico unico ambiente open space in cui le radici possono propagare, permettendo i capelli di radice alla deriva dentro e fuori di messa a fuoco ottica durante la crescita o il trattamento.
Qui presentiamo una procedura per lo sviluppo di una piattaforma di due-strato microfluidici utilizzando foto e metodi soft-Litografia che si basa su disegni di pianta-on-a-chip precedenti di confinare i semenzale di peli radicali allo stesso piano imaging come la radice principale. Questo ci permette di monitorare lo sviluppo dei capelli di radice in tempo reale, ad alta risoluzione e durante tutto il processo di trattamento sperimentale. I nostri metodi di coltura permettono di Arabidopsis thaliana piantine essere germinati dal seme all'interno della piattaforma e colta per fino ad una settimana in un ambiente sterile e idratata che non richiede l'uso di attrezzature pompa siringa. Una volta che l'esperimento di time-lapse imaging ha concluso, la piattaforma qui presentata possa essere aperti senza disturbare la posizione delle funzioni radice più fini. Questo consente l'utilizzo di altri metodi di imaging ad alta risoluzione. Qui forniamo risultati rappresentativi per la quantificazione e la visualizzazione della morfologia dei capelli di radice in questa piattaforma di microscopia ottica, scansione (SEM) e a forza atomica (AFM) di tecniche di microscopia.

<table><tbody><tr><td>Materiali WRS</td> <td>per wafer di silicio</td><td>Diametro 100 mm, spessore 500-550um, Prime, resistività 10-20, N/Phos< Allineatore a contatto 100></td><td></td></tr><tr><td>Quintel</td><td>Neutronix Quintel Corp</td><td>NXQ 7500 Allineatore</td><td></td>a maschera</tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>tessuto da laboratorio</td><td>Kimberly Clark</td><td>Kimwipe KIMTECH SCIENCE Marca, 34155</td><td></td></tr><tr><td>Fotoresist negativo Epossidico</td><td>Microchem</td><td>SU-8 serie</td><td></td>2000s</tr><tr><td>Sviluppatore</td> <td>PhotoresistMicrochem</td><td>Su-8 sviluppatore</td><td></td></tr><tr><td>tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-ottil)silano</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>uso in cappa chimica</td></tr><tr><td>Pulitore al plasma d'aria</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 Agente</td> indurente PDMS a base <td></td>di elastomero siliconico</tr><tr><td></td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 Agente</td><td></td></tr> <tr><td>indurente in elastomero siliconicoEssiccatore</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-000</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>X-acto coltello</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per biopsia Punch</td><td>Ted Pella</td><td>15110-15</td><td></td></tr><tr><td>Nastro adesivo</td><td>Graffe</td><td>Nastro</td><td></td>invisibile</tr><tr><td>Tubo per microfuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>J.T.Baker XI98-07</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>Chlorox</td><td>Terreni concentrati</td><td></td></tr> a <tr><td>base vegetale</td><td>Phyto Technology Laboratories</td><td>M524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Teknova</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio in film di cera</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscopio a forza atomica Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Keysight Technologies</td><td>5500 PicoPlus AFM</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>JEOL</td><td>7400</td><td></td></tr><tr><td>Evaporatore a fascio di elettroni a doppia pistola</td><td>Thermionics</td> Sistema <td></td><td>di evaporazione personalizzato a doppia pistola</td></tr></tbody></table> elettronica

la morfologia dei capelli di radice di semenzali di arabidopsis in una piattaforma di microfluidic di due-strato di imaging

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Peli radicali aumentare la superficie di radice per migliore assorbimento di acqua e assorbimento delle sostanze nutritive dalla pianta. Perché sono di piccole dimensioni e spesso oscurata dal loro ambiente naturale, funzione e morfologia dei capelli di radice sono difficili da studiare e spesso esclusi dalla ricerca sulle piante. Negli ultimi anni, microfluidica piattaforme hanno offerto un modo per visualizzare la radice sistemi ad alta risoluzione senza disturbare le radici durante il trasferimento di un sistema di imaging. La piattaforma microfluidica presentato qui compilazioni su ricerca precedente pianta-on-a-chip incorporando un dispositivo di due-strato per confinare la radice principale di Arabidopsis thaliana allo stesso piano ottico come i capelli di radice. Questo design consente la quantificazione di peli radicali su un cellulare e organello livello e inoltre impedisce l'asse z alla deriva durante l'aggiunta di trattamenti sperimentali. Descriviamo come conservare i dispositivi in un ambiente confinato e idratato, senza la necessità di pompe fluidiche, pur mantenendo un ambiente gnotobiotici per il semenzale. Dopo l'esperimento di imaging ottico, il dispositivo può essere smontato e utilizzato come substrato per forza atomica o microscopia elettronica a scansione pur mantenendo intatta la strutture delle radici fini.

I dispositivi microfluidici di due-strato PDMS qui descritti hanno un canale alta 200 µm per la radice principale di Arabidopsis e una camera alta di 20 µm per confinare lateralmente cresciti peli radicali (Figura 1A). Questo disegno può essere utilizzato per le specie vegetali con diametri di radice simile come Arabidopsis thaliana e possa essere facilmente modificato per ospitare specie di diverse dimensioni. Il disegno incorpora ...

In questo articolo viene illustrato come Arabidopsis thaliana semenzali in una piattaforma di due-strato microfluidici che limita la radice principale e peli radicali per un singolo piano ottico della coltura. Questa piattaforma può essere utilizzata per imaging ottico in tempo reale della morfologia di radice bene anche per quanto riguarda imaging ad alta risoluzione con altri mezzi.

La morfologia dei capelli di radice di semenzali di Arabidopsis in una piattaforma di Microfluidic di due-strato di imaging

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

L'obiettivo generale di questo metodo di coltura microfluidica con spaziatura controllata è far crescere le piante direttamente dal seme in un ambiente strutturato, che può essere utilizzato anche per trattamenti controllati e per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione delle radici delle piantine. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia vegetale, come ad esempio in che modo la crescita delle radici delle piante risponde a stimoli fisici e chimici su diverse scale di lunghezza. Il principale vantaggio di questa piattaforma è che le radici sono confinate in un singolo piano, rendendo impossibile trattarle e osservarle senza perdere il fuoco ottico.Oggi mi assisterà la dottoressa Sahar Hasim, professoressa associata di ricerca presso l'Università del Tennessee. Per iniziare, versare un rapporto 10:1 di PDMS e agente indurente su una wafer master prefabbricata e silanizzata. Depurare il PDMS in una camera a vuoto e quindi indurire il polimero in forno a 70 gradi Celsius per un'ora.Successivamente, utilizzare un bisturi per tagliare i dispositivi in PDMS e staccarli dal master. Poi, utilizzare un punch per biopsia da 1,5 millilitri per creare l'ingresso del seme a un angolo di 45 gradi, al fine di favorire la crescita della radice nel canale principale. Inoltre, utilizzare lo stesso punch per sgomberare gli ingressi del trattamento.Utilizzare del nastro adesivo per rimuovere eventuali detriti dal dispositivo e posizionarlo con il lato di progettazione rivolto verso il basso su un vetrino coprioggetto. Una volta assemblati, sterilizzare i dispositivi in autoclave. Collocare i semi di Arabidopsis thaliana in una provetta microcentrifuga e aggiungere una miscela di candeggina e detergente per sterilizzare i semi.Quindi, lavare i semi quattro volte con acqua sterile. Successivamente, stratificare i semi refrigerandoli nel tubo microcentrifuga durante la notte oppure conservarli fino a una settimana a quattro gradi Celsius. Prima di utilizzare i dispositivi sterili, posizionarli in una camera a vuoto per la degasificazione, al fine di rimuovere l'aria dal PDMS permeabile ai gas e dai canali fluidici.Questo migliorerà il successivo riempimento dei dispositivi. Rimuovere i dispositivi dalla camera a vuoto e immergerli immediatamente in una piastra di Petri riempita con un mezzo liquido a base vegetale diluito a un quarto, a un pH di 5,7. Utilizzando una pipetta, aspirare il liquido attraverso gli ingressi per riempire il dispositivo.Assicurarsi che non rimangano bolle d'aria all'interno dei canali ispezionandoli visivamente prima di trasferirli in piatti di Petri freschi e asciutti individuali. Successivamente, versare l'agar caldo attorno al dispositivo fino a quando il livello dell'agar è quasi allineato con la parte superiore del dispositivo. In un ambiente sterile, utilizzare una piccola pipetta e trasferire un seme sterilizzato all'ingresso di ciascun dispositivo.Quindi, coprire ogni piastra di Petri con pellicola di cera e posizionarle in una camera di crescita con ciclo luminoso/oscuro a temperatura ambiente. Orientare la piastra di Petri nella camera di crescita a temperatura ambiente in posizione verticale, in modo che la gravità favorisca la crescita delle radici attraverso il canale. Al momento desiderato e allo stadio di sviluppo della piantina, utilizzare una pipetta per aggiungere una quantità prestabilita del trattamento sperimentale in ciascuna delle otto aperture laterali dei dispositivi.Al termine, sigillare nuovamente le piastre di Petri con pellicola di cera. Successivamente, riposizionarle nella camera di crescita. Regolare l'ingrandimento di un microscopio a campo chiaro invertito tra 4x e 20x.Posizionare l'intera piastra di Petri contenente il dispositivo e la piantina sotto il microscopio per l'acquisizione in campo chiaro o in contrasto di interferenza differenziale. Ottimizzare le condizioni di illuminazione regolando i tempi di esposizione, la luminosità della lampada, il diaframma e la polarità della luce per mettere in evidenza le caratteristiche morfologiche di interesse. Successivamente, spostare il tavolino nella zona desiderata della radice e mettere a fuoco la radice o il peluria radicale di interesse.Acquisire un singolo punto temporale o una serie temporale di immagini per visualizzare la crescita dei peli radicali. Per la serie temporale, acquisire immagini dei peli radicali in crescita una volta al minuto. Per visualizzare la crescita della radice principale, acquisire un'immagine ogni 30 minuti.Una volta terminato, riposizionare la piastra di Petri e le piantine nella camera di crescita, in posizione verticale. Dopo che la piantina è cresciuta per il tempo desiderato, utilizzare una pinzetta per rimuovere il vetrino e il dispositivo dall'agar. Quindi, inumidire un fazzoletto da laboratorio con etanolo e usarlo per pulire la parte inferiore del vetrino.Applicare l'olio appropriato a un obiettivo da 63x ad immersione in olio e posizionare il vetrino coprioggetto rivolto verso il basso sul portapreparati del microscopio. Successivamente, sollevare il portapreparati fino a farlo entrare in contatto con il mezzo di immersione presente sull'obiettivo. Ottimizzare le condizioni di illuminazione regolando i tempi di esposizione, la luminosità della lampada, il diaframma e la polarità della luce.Quindi, spostare la piastra nell'area desiderata della radice e mettere a fuoco i peli radicali di interesse. Per quantificare la crescita dei peli radicali nel tempo, impostare il software in modo da acquisire un'immagine al minuto, nella posizione di interesse. Per visualizzare la fluorescenza autodella pianta o i marcatori fluorescenti, ridurre al minimo il tempo di esposizione alla fluorescenza, mantenendo comunque un segnale fluorescente identificabile.Acquisire le immagini degli organelli il più rapidamente possibile, entro i limiti del tempo di esposizione. Una volta che la piantina avrà cresciuto per il tempo desiderato, rimuovere il dispositivo e il vetrino coprioggetto dalla piastra di Petri. Capovolgere il dispositivo e staccare delicatamente il vetrino coprioggetto in modo che la radice rimanga all'interno del canale in PDMS.Posizionare il dispositivo in PDMS su un substrato piatto e riflettente, ad esempio microricoperto in oro, quindi montare il dispositivo sul portacampioni del microscopio a forza atomica (AFM) con la radice rivolta verso l'alto. Dopo aver fissato un attacco per pozzetto liquido sulla parte superiore del dispositivo in PDMS, riempirlo con acqua per mantenere idratate le radici durante l'acquisizione delle immagini. Una volta caricato il campione nell'AFM, regolare il controllo z per lo spessore del dispositivo in PDMS e portare la mensola nella regione di interesse sulla radice.Utilizzando una telecamera come guida, allineare il laser con la punta del cantilever e utilizzare l'immagine in modalità a contatto per esercitare una forza minima sulla radice durante la scansione. Abbassare lentamente il meccanismo di scansione fino a quando il cantilever entra appena a contatto con il campione. Successivamente, regolare le dimensioni della scansione per la regione desiderata e scegliere una velocità di scansione di una linea al secondo con 256 punti di tensione per linea.Infine, acquisire la scansione. I dispositivi microfluidici in PDMS a due strati descritti qui hanno un canale centrale alto 200 micrometri per la radice principale di Arabidopsis e due camere laterali alte 20 micrometri, per confinare i peli radicali in crescita laterale. Questo garantisce che i peli radicali si trovino nello stesso piano di osservazione della radice principale.All'interno della piattaforma microfluidica, i peli radicali possono essere quantificati a livello cellulare in base alla loro lunghezza, densità e angolarità di crescita rispetto alla radice. Uno dei vantaggi principali dell'utilizzo di una piattaforma microfluidica è la capacità di aggiungere in modo uniforme concentrazioni precise di trattamenti chimici agli organismi. Qui, un'immagine di una piantina viene acquisita prima e dopo l'aggiunta di microsfere fluorescenti di polistirene carbossilate.L'aggiunta di questo trattamento abiotico non ha alterato l'orientamento del fuoco ottico dei peli radicali delle piantine. Utilizzando marcatori fluorescenti, è possibile osservare il flusso citoplasmatico in un pelo radicale. Il movimento di questi tre organelli è riportato in questo grafico di distribuzione cumulativa.Oltre all'immagine ottica, questa piattaforma consente anche l'analisi mediante AFM e SEM, grazie alla sua capacità di essere smontata senza disturbare la radice. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, inclusa l'analisi chimica, al fine di rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio come appaiono i profili chimici attorno alla radice.

imaging-root-hair-morphology-arabidopsis-seedlings-two-layer

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Descriviamo l'uso di perfluorodecalin come mezzo infiltrante di montaggio. Questo è un metodo semplice per migliorare la profondità delle immagini...

Un metodo semplice per l&#39;imaging Arabidopsis Foglie Utilizzando Perfluorodecalin come Media Imaging infiltrativa

Questo articolo fornisce un protocollo per la coltivazione di piantine di Arabidopsis in RootChip, una piattaforma di imaging microfluidico che combina controllo automatizzato delle condizioni di crescita con il monitoraggio radice al microscopio e FRET-based misura i livelli di metaboliti intracellulari.

Time-lapse imaging di fluorescenza della crescita Root Arabidopsis con manipolazione accelerato dell&#39;ambiente root usando il RootChip

Descriviamo un protocollo mediante diapositive da camera e media per immobilizzare cotiledoni di impianto per l'imaging confocale dell'epidermide più giorni di sviluppo, documentazione differenziazione stomatica. Proteine ​​fluoroforo-tag possono essere monitorati in modo dinamico attraverso l'espressione e la localizzazione subcellulare, aumentare la comprensione dei ruoli possibili durante la divisione cellulare e la differenziazione delle cellule-tipo.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Questo protocollo descrive un procedimento per la rapida raccolta di immagini di piantine di Arabidopsis rispondono ad uno stimolo gravità utilizzando commercialmente disponibili scanner piani. Il metodo consente di poco costoso, ad alto volume cattura di immagini ad alta risoluzione possono essere sindacate per algoritmi di analisi a valle.

Utilizzo di Scanner Flatbed per la raccolta ad alta risoluzione e ritardi Immagini della Arabidopsis Root gravitropica risposta

Segnalazione Ca 2 + regola diversi processi biologici nelle piante. Qui vi presentiamo approcci per il monitoraggio di stress abiotico indotto Ca spaziale e temporale 2+ segnali nelle cellule e tessuti utilizzando le geneticamente codificati Ca 2 + indicatori aequorina o Case12 Arabidopsis.

Misurazione spaziale e temporale Ca 2 + Segnali in Arabidopsis Piante

Questo protocollo mostra un metodo di preparazione del campione di piante per la microscopia a foglio di luce. La configurazione è caratterizzata dal montaggio verticale della pianta sulla superficie di un gel e dal lasciarla crescere in condizioni di luminosità controllata. Ciò consente l'osservazione a lungo termine dello sviluppo degli organi vegetali in condizioni standardizzate.

Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

immagini dal vivo confocale offre biologi con un potente strumento per studiare lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia confocale in diretta di sviluppare Arabidopsis fiori.

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

Presentata qui è una tecnica semplice per l'imaging rapido a tempo determinato di elevata risoluzione di sviluppo radicale e ipocotile per un massimo di 3 giorni utilizzando elevati obiettivi di apertura numerica e perfluorodecalin come mezzo di immersione.

Una Camera Semplice per l&#39;Imaging Confocale a lungo termine dello sviluppo di radici e ipocotili

Descriviamo un metodo per indagare la capacità di crescita punta di cellule vegetali, compresi i tubi di polline, peli radicali e muschio protonemata, allunga attraverso lacune estremamente strette (~ 1 µm) in un dispositivo microfluidico.

Sviluppo di dispositivi microfluidici per studiare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali in spazi estremamente ridotti

Qui forniamo un chip microfluidico e un sistema microfluidico di circolazione automaticamente controllato e altamente efficiente che ricapitola il microambiente iniziale della neovascolarizzazione, consentendo alle cellule endoteliali (EC) di essere stimolate da elevate sollecitazioni di taglio luminali, livello fisiologico di flusso transendoteliale e distribuzione simultanea di vari fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF).

Modello microfluidico per imitare l&apos;evento iniziale di neovascolarizzazione

Il protocollo di indentazione della microscopia a forza atomica offre la possibilità di sezionare il ruolo delle proprietà fisiche della parete cellulare di una particolare cellula di un tessuto o organo durante la crescita normale o limitata (cioè in deficit idrico).

Microscopia a forza atomica per studiare le proprietà fisiche delle cellule epidermiche delle radici vive di Arabidopsis

Scopri un metodo microfluidico per coltivare Arabidopsis thaliana e analizzare la morfologia delle radici in tempo reale. La piattaforma confina le radici in un unico piano ottico per imaging ad alta risoluzione.

La morfologia dei capelli di radice di semenzali di Arabidopsis in una piattaforma di Microfluidic di due-strato di imaging

Esplora altri video