Name: Perla base Multiplex Assay per lanalisi dei profili di Cytokine di lacrima (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Impara a profilare le citochine nel film lacrimale umano utilizzando un saggio multiplex a base di perline. Questo metodo consente l'analisi di multipli analiti con piccoli volumi campione per studi oftalmologici.

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Il lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla sovvenzione centro Tan Tock Seng Hospital personalizzato sementi finanziamento programma 2015; Singapore Eye Research Institute pilota Grant e Tan Tock Seng Hospital Pitch per fondo di concedere.

i protocolli utilizzati in questo studio sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale di Tan Tock Seng Hospital, Singapore.
 1. analisi di Cytokine strappare <ol><li>collezione di lacrime: <ol><li>chiedere al soggetto di sedersi comodamente su una sedia di esame e posizionare il suo testa contro il poggiatesta.</li>
		<li>Chiedere al soggetto di cercare, aprire le strisce di Schirmer (fatte di carta da filtro Whatman n. 41) e posizionare l'estremità arrotondata della striscia il fornix inferiore dell'occhio e istruire il soggetto di chiudere gli occhi per 5 min. Mentre la raccolta le lacrime fare molta attenzione a ridurre al minimo la superficie di contatto oculare. 30</li> <li>chiedere al soggetto di aprire il suo occhi per rimuovere la striscia e metterlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sterile. Il tubo di trasferimento immediatamente al laboratorio o conservare a-80 o C fino al test per il profilo di citochina.</li>
	</ol></li> <li>Eluizione dell'esempio tear striscia a strappo flusso: <ol><li>tagliare la striscia a strappo flusso ad una lunghezza di 0,5 cm (per standardizzare la quantità di lacrime da testare) e metterlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sterile.</li>
		<li>Aggiungere 30 µ l di tampone per il test e incubare a temperatura ambiente per 5 min seguita da centrifugazione il tubo a 14.000 x g per 1 min.</li>
		<li>Trasferire il surnatante in un'altra provetta di microcentrifuga da 1,5 mL e scartare la striscia. Posizionare il campione contenente il tubo sul ghiaccio e utilizzare l'esempio di lacrima eluiti immediatamente per profilatura di citochina.</li>
	</ol></li> <li>Preparazione dei reagenti: Nota: quarantuno analiti per essere testato in ogni campione dall'analisi multiplex perlina basato sono interleuchina (IL)-1 α, IL-1 β, IL-Rα, il-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, p70 di IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A, interferone-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gamma-viscoelastico della proteina 10 (IP-10, CXCL10), macrofago-derivata chemochine (MDC), proteina infiammatoria macrofagica (MIP)-1 α e MIP-1 β, monocito proteina chemiotattica (MCP) -1, MCP-3, fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α), TNF-β, crescita-regolata dell'oncogene (GRO), alfa di fattore di crescita del tumore (TGF-α), fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), fattore di crescita epidermico (EGF) e del fibroblasto fattore di crescita (FGF) -2, piastrina derivato il fattore di crescita (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, fattore distimolazione del granulocyte (G-CSF), fattore distimolazione del granulocyte-macrofago (GM-CSF), eotaxin, fractalchina, solubile ligando di CD40 (sCD40L), Fms-like legante di tirosina chinasi 3 (Flt - 3L) e regolato al momento dell'attivazione, T-cellula normale espressa e secreta proteina (RANTES).
	<ol><li>Portare i flaconcini di soluzione (50 X) anticorpo perlina a temperatura ambiente (20-25 o C) e vortex le fiale per 1 min.</li>
		<li>Contare il numero di pozzetti necessari per il dosaggio e calcolare la quantità di soluzione di anticorpo totale della perla cocktail (25 µ l per pozzetto) e ogni soluzione di perlina di anticorpo (50x) richiesto per il dosaggio di.</li>
		<li>Preparare la soluzione di cocktail aggiungendo la quantità calcolata di ogni soluzione di anticorpo perlina e riempire il volume finale desiderato aggiungendo l'importo residuo del branello diluente. Garantire che la concentrazione finale di ogni anticorpo nel cocktail è 1x. Sempre preparare almeno 20% extra volume della soluzione di cocktail in caso di errori di pipettamento. 
		Nota: Ad esempio, per un dosaggio di 96 pozzetti preparare 3000 µ l di soluzione di anticorpo perlina cocktail. La quantità necessaria di ogni soluzione di perlina di anticorpo = concentrazione di 3000/stock di ogni soluzione di perlina di anticorpo; 3000/50 = 60 µ l di soluzione di ogni anticorpo perlina <ol><li>aggiungere 60 µ l di ciascuna delle soluzioni perlina 41 anticorpo (60 X 41 = 2460 µ l) in un cocktail bottiglia e aggiungere 540 µ l di soluzione diluente della perla per la miscela di microsfere di anticorpo di rendere 3000 µ l di finale soluzione di lavoro (1. X).</li>
			<li>Prima dell'uso, mescolare bene la soluzione cocktail della perla. Dopo l'analisi dell'archivio il volume residuo a 2-8 o C per fino a 30 giorni.</li>
		</ol></li> <li>Preparare i controlli di qualità (QC) aggiungendo 250 µ l deionizzata acqua agli stock 1 QC e QC 2.</li>
		<li>Mescolare correttamente invertendo le bottiglie diverse volte e vortex per 10 s. trasferimento la soluzione correttamente etichettato in polipropilene per microcentrifuga e conservare la soluzione rimanente a-20 ° C, che può essere utilizzato fino a 30 giorni.</li>
		<li>Preparare il tampone di lavaggio aggiungendo 270 mL di acqua deionizzata a 30 mL di 10 X soluzione tampone di lavaggio e mescolare bene (prima diluizione, portare il buffer X 10 a temperatura ambiente e sciogliere tutti i precipitati sale di miscelazione). Conservare il tampone di lavaggio inutilizzati (1x) a 2-8 ° C, che può essere utilizzato fino a 30 giorni.</li>
		<li>Preparare il brodo di standard umana di citochina (10.000 pg/mL di tutti gli analiti) aggiungendo 250 µ l deionizzata acqua nel flacone stock. Mix bene capovolgendo più volte e vortice il flaconcino per 10 s. lasciare riposare per 10 min e trasferire la soluzione di riserva per correttamente etichettato in polipropilene per microcentrifuga. Dopo il dosaggio, conservare la soluzione rimanente a-20 ° C, che può essere utilizzato fino a 30 giorni.</li>
		<li>Preparare il lavoro umano citochina standard da 5 volte diluizioni seriali (50 µ l - &#62; 200 µ l) con tampone di dosaggio per ottenere 2000, 400, 80, 16 e 3,2 pg/mL.</li>
		<li>Dopo preparazione standard, utilizzare gli standard di lavoro entro 60 min e utilizzare il tampone del saggio come vuoto/sfondo (-pg/mL).</li>
	</ol></li> <li>Cytokine Profilatura da perlina basato su analisi multiplex: <ol><li>portare tutti i reattivi a temperatura ambiente e mescolare nel vortex per 5-10 secondi prima di aggiungerli alla piastra microtiter a 96 pozzetti. Se i campioni eluiti lacrima sono conservati a -80 o C prima del dosaggio, scongelare gli estratti congelati lacrima sul ghiaccio e centrifugare a 1000 X g per 5 min.</li>
		<li>Preparare un foglio di lavoro di analisi in una configurazione verticale per l'utilizzo standard di citochina umana [0 (vuoto), 3.2, 16, 80, 400, 2.000 e 10.000 pg/mL], QC1, campioni e QC2.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di tampone di lavaggio di ciascuno: 1x bene della piastra, sigillarlo con copripiastra e tenerlo su un agitatore per piastre a temperatura ambiente (20-25 o C) per 10 min.</li>
		<li>Decantare il tampone di lavaggio X 1 invertendo la piastra e toccare su assorbenti più volte per rimuovere qualsiasi residuo di tampone di lavaggio nei pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere 25 µ l di ogni lavoro umano citochina standard, QC1, DC2, vuoto (tampone) e campioni nei pozzetti appropriati.</li>
		<li>Aggiungere 25 µ l assay buffer in ogni pozzetto.</li>
		Soluzione cocktail perlina di <li>aggiungere 25 µ l di 1 X anticorpo in ciascun pozzetto. Come la soluzione del branello dell'anticorpo è sensibile alla luce, sigillare la piastra con il copripiastra e coprirlo con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce durante il dosaggio.</li>
		<li>Incubare la piastra a 4 o C durante la notte su un agitatore.</li>
		<li>Collocare la piastra sulla cremagliera di piatto di un lavatore automatico piastra magnetica. Lasciate riposare per 1 min a stabilirsi i branelli magnetici nella parte inferiore del pozzo e aspirare il contenuto bene. Aggiungere 200 µ l di tampone di lavaggio per pozzetto e lasciate riposare per 1 minuto e poi aspirare il contenuto bene. Ripetere il lavaggio ancora una volta (per il lavaggio della piastra, seguire il produttore di kit &#39; s istruzioni).</li>
		<li>Aggiungere 25 µ l di soluzione di identificazione degli anticorpi in ogni bene, sigillare la piastra, coprirla con carta stagnola e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti su un agitatore.</li>
		<li>Aggiungere 25 µ l di Streptavidisoluzione di n-ficoeritrina in ciascun pozzetto, sigillare la piastra, coprirla con carta stagnola e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore.</li>
		<li>Collocare la piastra su una rondella piastra magnetica. Lasciate riposare per 1 minuto e poi aspirare il contenuto bene. Aggiungere 200 µ l di tampone di lavaggio per pozzetto. Lasciate riposare per 1 minuto e poi aspirare il contenuto bene. Ripetere il lavaggio ancora una volta.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l di liquido di guaina di ogni bene e posizionare la piastra su un agitatore per 5 min a temperatura ambiente per risospendere le perline di anticorpo.</li>
		<li>Leggere la piastra immediatamente utilizzando il tallone analisi multiplex piastra lettore basato e analizzare le concentrazioni di citochine utilizzando un algoritmo di curva-montaggio 5-parametri. Un diagramma di flusso schematico di lacrima cytokine profilatura è illustrato nella Figura 1.</li>
	</ol></li> <li>Leggendo il saggio piastra (strumento istituito) e analisi dei dati: <ol><li>interruttore sul tallone basato su analisi multiplex reader e pre-caldo il laser per 30 min.</li>
		<li>Avviare il software di analisi multiplex perlina basato. Sotto il &#39; automatizzato manutenzione &#39; scheda, selezionare il &#39; verifica della calibrazione &#39; opzione. Vortex ciascun reagente fiala delle perle taratura e verifica per 30 s. Place 5 gocce di ciascun reagente nei pozzetti designati. Riempire i serbatoi designati con deionizzata acqua e 70% di etanolo.</li>
		<li>Crea un nuovo protocollo <ol><li>aprire il &#39; protocolli &#39; pagina e poi la &#39; protocolli &#39; scheda, fare clic &#34; creare nuove ProtocolŔ il &#39; impostazioni &#39; scheda si aprirà.</li>
			<li>Nella &#39; nome &#39;, digitare il nome del protocollo.</li>
			<li>Digitare una descrizione nella casella a destra del &#39; nome &#39; casella.</li>
			<li>Nella &#39; versione &#39;, digitare la versione del protocollo.</li>
			<li>Nella &#39; produttore &#39;, digitare le informazioni sul produttore per il protocollo.</li>
			<li>Definire impostazioni nella &#39; impostazioni di acquisizione &#39; come segue. Impostare &#39; Volume &#39;: 100 µ l, &#39; Timeout &#39;: 60 s; &#39; DD Gating &#39;: 8.000 a 15.000; &#39; Reporter guadagno &#39;: PMT Standard; &#39; Tallone tipo &#39;: Magnetic Beads.</li>
			<li>Definire impostazioni nella &#39; impostazioni di analisi &#39; sezione, selezione &#39; quantitativa &#39; come il tipo di analisi. Impostare &#39; numero di norme &#39;: 6; &#39; Numero di controlli &#39;: 0; Spunta la &#39; dire di replica &#39; scatola; 
			Spuntare il &#39; analizzare risultati mentre l'acquisizione di campioni &#39; casella.</li>
			<li>Clic &#34; NextŔ la &#39; analiti &#39; si apre, fare clic su analiti desiderati (ID del branello) nella griglia numerata analita.</li>
			<li>Doppio clic e modifica l'analita corrispondente nome nella &#39; nome &#39; colonna a destra della griglia dell'analita (analiti &#39; i nomi e i loro dettagli di regione perlina corrispondenti sono stati menzionati nella tabella 1).</li>
			<li>Clic e digitare l'unità di misura (cioè pg/mL) desiderata nella &#39; unità &#39; casella a sinistra della &#39; applica tutti &#39; pulsante. Quindi fare clic su &#34; applicare tutti i &#34;.</li>
			<li>Doppio clic e modifica il tallone desiderato contare per ogni analita (cioè 50) nella &#39; Conte &#39; casella. Fare clic su &#34; applicare tutti i &#34;.</li>
			<li>Clic &#34; NextŔ si apre la scheda di Layout della piastra. Evidenziare i pozzetti per il standard e selezionare &#34; 2 &#34; sotto conteggio di replicare e fare clic sul &#34; S &#34; pulsante Standard. Ripetere questo passaggio per lo sfondo &#34; B &#34; e campioni &#34; U &#34; wells.</li>
			<li>Clic &#34; salvare &#34;.</li>
		</ol></li> <li>Creare nuovi standard/controllo lotti <ol><li>aperto il &#39; protocolli &#39; pagina e poi la &#39; standard &#38; controlli &#39; scheda, fare clic &#34; creare nuovi Standard/controllo lotti &#34;.</li>
			<li>Apri il &#39; Selezionare protocollo &#39; casella. Selezionare il protocollo che è stato creato nel passaggio 1.5.3.</li>
			<li>Chiave di conseguenza le informazioni delle norme: numero di kit Std/Ctrl, nome kit Std/Ctrl, scadenza e produttore.</li>
			<li>Chiave nel valore di altissimo livello per ciascun analita (cioè 10000 pg/mL). Chiave in 5 sotto diluizione e fare clic su &#34; applica tutti &#34; per generare automaticamente le concentrazioni previste per il resto delle norme.</li>
			<li>Clic &#34; salvare &#34;.</li>
		</ol></li> <li>Crea un nuovo Batch da un protocollo esistente <ol><li>aperto il &#39; batch &#39; pagina e fare clic su &#34; creare una scheda di nuovo Batch da un protocollo esistente &#34;.</li>
			<li>Digitare il nome del batch nel &#39; nome Batch &#39; casella e digitare una descrizione sul batch nella &#39; descrizione facoltativa immettere &#39; casella.</li>
			<li>Fare clic sul protocollo generato in precedenza (nel passaggio 1.5.3).</li>
			<li>Fare clic &#34; NextŔ scheda successiva che si apre è la &#39; Stds &#38; Ctrls &#39; Tab. visualizzare i dettagli delle norme di test e selezionare &#34; prossimo &#34;.</li>
			<li>Sui &#39; piastra Layout &#39; scheda, assegnare comandi ben per questo batch e fare clic su &#34; salvare &#34; per salvare le informazioni di batch per il &#39; Batch in sospeso &#39; elenco.</li>
			<li>Caricare la piastra nel lettore della piastra di perlina basato su analisi multiplex, scuoterlo per 5 min ed eseguire il batch dall'elenco batch in sospeso. I dati acquisiti verranno salvati nel formato di file con estensione CSV.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Analisi dei dati <ol><li>convertire file CSV generato dal software di analisi multiplex perlina basato nel formato di file (file di dati di risultati). RBX utilizzando il software di conversione rbx. Avviare il software di conversione, selezionare il file CSV sotto xPONENT selezionare file e fare clic sul &#34; generare &#34; pulsante; il file. RBX verrà salvato nella cartella di output selezionato.</li>
		<li>Avviare il software di analisi e aprire il file. RBX.</li>
		<li>Ottimizzare le curve standard utilizzando la curva 4PL/5PL.
		<ol><li>Selezionare le opzioni seguenti nella &#39; curva Standard &#39; scheda: &#39; tipo di regressione &#39;: &#39; Logistic-5PLƆ &#39; asse trasformazione &#39;: &#39; log (x) - tick Ɔ lineare (y) il &#39; Mostra linee di gamma Conc &#39; scatola; spuntare il &#39; Show sconosciuto Campioni &#39; scatola; Spuntare il &#39; campioni di controllo Visualizza &#39; scatola; Spuntare il &#39; applica attraverso tutti gli analiti &#39; scatola; spuntare il &#39; Visualizza rapporto dopo l'ottimizzazione &#39; casella.</li>
			<li>Scegliere la &#34; ottimizza &#34; pulsante per auto-ottimizzazione.</li>
		</ol></li> <li>Etichettare le identità di campione sotto &#39; immettere campione Info &#39; Tab.</li>
		<li>Ottenere le concentrazioni osservate nel &#39; Report tabella &#39; scheda e fare clic su &#34; esportare report tabella &#34; per generare i dati in un file di foglio di calcolo per ulteriori analisi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare. Alcun interesse finanziario o conflitti di interesse.

Le citochine sono piccole proteine secrete cellulare e potenti modulatori immuni regolazione della risposta immunitaria. 32 i profili di espressione di varie citochine in campioni collegati alle varie circostanze patologiche dell'occhio e studi sulla citochina profili aiutano a capire i meccanismi della patogenesi della malattia, determinare lo stato di salute oculare, lacrima la gravità della malattia, la diagnosi e la progressione. 2 , Piccolo campione volumi e...

Le lacrime sono prodotte dalla ghiandola lacrimale e ghiandole accessorie e rivestire la superficie esterna dell'occhio. Film lacrimale è costituito da uno strato lipidico esterno e uno strato acquoso interno che comprende proteine solubili, mucine e membrana associato mucine. Lacrime impediscono l'invasione microbica, forniscono sostanze nutritive e forniscono la lubrificazione alla superficie oculare. Lacrime di fungere da interfaccia tra l'aria ed il tessuto per il trasporto di ossigeno alla cornea. 1 film lacrimale è costituito da proteine, carboidrati, lipidi ed elettroliti. L'associazione tra proteine di strappo con malattie oculari e sistemiche come glaucoma, malattia dell'occhio secco, congiuntivite primaverile, mellito di diabete, cancro e orbitopatia tiroide-collegato è stato identificato in diversi studi. 2 , 3 , 4 lacrima campioni possono essere raccolti da microcapillary tubi o lacrima flusso strips (strisce di Schirmer). Inoltre, test di Schirmer è una procedura standard eseguita nella cornea e cliniche di chirurgia refrattiva, i cui risultati possono essere utilizzati per analisi di analisi di cytokine. Raccolta dei campioni non-invasivo, accessibilità del bio-campione e l'associazione di strappo composizione con varie condizioni fisiologiche e patologiche fanno strappare la pellicola una potenziale fonte di biomarcatori per parecchie malattie oculari e sistemiche. 4 , 5 , 6
Lacrima citochine svolge un ruolo importante nello studio della salute di superficie oculare e condizioni infiammatorie di varie malattie oculari. 7 concentrazioni anormali di diverse citochine in campioni di rottura sono state segnalate per essere associati con la malattia dell'occhio asciutta, cheratocongiuntivite primaverile (VKC) e cheratocongiuntivite atopica (AKC), congiuntivite allergica stagionale e uveite. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 lacrima proteine possono essere analizzati con metodi tradizionali come la spettrometria di massa, western blotting e analisi enzima-collegate dell'immunosorbente (ELISA). 14 , 15 tuttavia, le limitazioni di questi metodi sono scarsa sensibilità e un più grande volume di campione richiesto per l'analisi delle citochine multiple di lacrima in ogni paziente. 16 , 17 saggi multiplex perlina basata sono stati sviluppati per analizzare più analiti nei campioni di miscela complessa e applicati con successo su campioni di lacrima per analizzare più citochine nelle malattie differenti. 6 , 18 A combinazione di sandwich ELISA e tecniche di citometria di flusso consentono queste analisi diventare più sensibile dell'ELISA per la quantificazione degli analiti multipli in un singolo campione. 19 questo metodo può essere applicato su una varietà di campioni clinici e surnatanti della cultura delle cellule e aiuta nello studio delle risposte immunitarie in diverse condizioni fisiopatologiche. 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Ci sono parecchi studi confrontando perlina basato multiplex assays con ELISA e hanno segnalato una correlazione tra i metodi. Perlina di Loo et al rispetto basato l'analisi multiplex con ELISA convenzionale per la rilevazione di adiponectina, resistina, leptina e grelina nei campioni di siero o plasma umano e segnalato una forte correlazione (r &#62; 0,9) tra i saggi. 25 Dupont et al ha segnalato una forte correlazione fra saggi multiplex perlina basato ed ELISA per la rilevazione di IL-1 β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ e TNF-α nel phytohemagglutinin e lipopolisaccaride stimolato sangue intero raccolti da donne incinte. 26 Pickering et al ha segnalato un altro forte correlazione tra analisi multiplex perlina basato ed ELISA per la rilevazione degli anticorpi del siero di Haemophilus influenzae tipo b polisaccaride (r = 0,96), tossoidi del Clostridium tetani (r = 0,96) e Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). 27 Biagini et al ha segnalato un'alta correlazione positiva (r = 0,852) tra analisi multiplex perlina basato ed ELISA per il rilevamento di Bacillus anthracis anti-PA IgG nei campioni di siero. 28 Wang et al ha segnalato una correlazione tra analisi multiplex perlina basato ed ELISA per l'individuazione di biomarcatori di malattia di Alzheimer amiloide-β 42 (r = 0.77), tau totale (r = 0.94) e tau fosforilate su aminoacido 181 (r = 0.82) in campioni del liquido cerebrospinale. 29 questi studi hanno dimostrato che l'applicabilità del branello basato multisala saggi su varietà di campioni clinici, minori requisiti di volume di campione e una correlazione con ELISA standard, che rendono saggi multiplex perlina basato un promettente alternativa ai tradizionali metodi ELISA per il rilevamento di più analiti in diversi tipi di campioni in fenotipi differenti di malattia. Qui descriviamo un protocollo standardizzato per l'analisi multiplex perlina basato per la citochina profilatura per 41 analiti in lacrima campioni prelevati da soggetti sani utilizzando strisce di Schirmer.

<table><tbody><tr><td>Milliplex MAP citochine umane / chemochine pannello di perline magnetiche -1 kit</td><td>Merck, USA</td><td>HCYTOMAG-60K-41</td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D luminex instrument&nbsp;</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>software xPonent&nbsp;</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software RBXGenerator</td><td>BIO-RAD, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex Manager 6.1</td><td>BIO-RAD, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per piastre</td><td>Corning, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TECAN Lavatrice per micropiastre</td><td>Tecan, Svizzera</td><td>HydroSpeed</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries inc, USA</td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Mettler Toledo, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Axygen, USA</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Striscia reattiva per flusso lacrimale Schirmer</td><td>Eye Care and Cure, USA</td><td>101657</td> Kit di calibrazione 3D Flexmap <td></td></tr><tr><td></td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td>40-028</td><td></td></tr><tr><td>Kit di verifica 3D Flexmap</td><td>Luminex Corp, Austin, TX, USA</td><td>40-029</td><td></td></tr><tr>Poltrona <td></td><td></td><td></td><td>per visita oculare</td></tr></tbody></table>

perla base multiplex assay per l'analisi dei profili di cytokine di lacrima

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Film lacrimale è una miscela complessa di lipidi, proteine e minerali che copre la superficie esterna dell'occhio, fornendo in tal modo la lubrificazione, la nutrizione e la protezione alle celle sottostanti. Analisi delle lacrime sono un'area emergente per l'identificazione di biomarcatori per la previsione, diagnosi e prognosi di varie malattie oculari. Le lacrime sono facilmente accessibili e loro insieme è invasivo. Di conseguenza, avanzante tecnologie stanno guadagnando importanza per l'identificazione degli analiti multiple in lacrime per studiare i cambiamenti nella composizione della proteina o del metabolita e la sua associazione con condizioni patologiche. Lacrima citochine sono biomarcatori ideale per studiare la salute della superficie oculare e anche aiutano nella comprensione dei meccanismi di diversi disordini di superficie oculari come malattia dell'occhio asciutta e congiuntivite primaverile. Saggi multiplex perlina base hanno la capacità di rilevare analiti multiple in una piccola quantità di campione con una maggiore sensibilità. Qui descriviamo un protocollo standardizzato di raccolta del campione di lacrima, estrazione ed analisi di cytokine profilatura mediante una perlina basato su analisi multiplex.

Lacrima campioni sono stati raccolti da 8 occhi di 4 soggetti sani utilizzando strisce di flusso lacrima e livelli di citochina sono stati analizzati utilizzando il protocollo di cui sopra. Tutti gli oggetti erano maschi e l'età delle quattro materie era 36, 42, 44 e 52 anni rispettivamente. Salute di superficie oculare e l'occhio asciutto la malattia è stata valutata da test clinici (lacrima film break up tempo, di Schirmer test, colorazione corneale, colorazione congiuntivale, esame del...

Analisi del film lacrimale citochine aiuta a studiare varie malattie oculari. Saggi multiplex perlina basata sono semplici e sensibili e abilitare il testing di bersagli multipli in campioni con piccoli volumi. Qui descriviamo un protocollo per lacrima film cytokine profilatura un mediante perlina basato su analisi multiplex.

Perla base Multiplex Assay per l'analisi dei profili di Cytokine di lacrima

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è studiare i profili di citochine in campioni di lacrime umane raccolti mediante strisce di Schirmer, utilizzando un saggio multiplex basato su microsfere. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'oftalmologia, come il ruolo delle citochine in diverse malattie oculari. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di analizzare più analiti partendo da volumi ridotti di campione.La procedura sarà dimostrata da Praveen Balne, un ricercatore post-dottorato del mio laboratorio. Dopo aver raccolto le lacrime da un soggetto seguendo il protocollo descritto nel testo, tagliare la striscia di flusso lacrimale a una lunghezza di 0,5 centimetri e posizionarla in una provetta sterile da 1,5 millilitri. Aggiungere 30 microlitri di buffer per il saggio e incubare la provetta a temperatura ambiente per cinque minuti.Quindi centrifugare il tubo a 14.000 ×g per un minuto. Trasferire il soprannatante in un altro tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e scartare la striscia. Successivamente, posizionare il tubo contenente il campione sul ghiaccio e utilizzare immediatamente il campione di lacrime eluito per il profilo delle citochine.Per eseguire il saggio multiplex basato su microsfere, portare tutti i reagenti a temperatura ambiente e vorticare per cinque-dieci secondi. Se i campioni di lacrime eluiti sono stati conservati a meno 80 gradi Celsius prima del saggio, scongelare gli estratti lacrimali su ghiaccio e centrifugare i campioni a 1.000 ×g per cinque minuti. Preparare un foglio di lavoro per il saggio in configurazione verticale per gli standard di citochine umane QC-1, QC-2 e i campioni.Aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio 1X in ogni pozzetto della piastra e sigillarla con un sigillante per piastre. Quindi, incubare la piastra su un agitatore per piastre a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, eliminare il tampone di lavaggio 1X capovolgendo la piastra e battere più volte su un tovagliolo assorbente per rimuovere ogni residuo di tampone di lavaggio dai pozzetti.Quindi aggiungere 25 microlitri di ciascuno standard di citochina umana in lavorazione QC-1, QC-2, il bianco contenente solo il tampone per saggio e i campioni nelle pozzette corrispondenti. Aggiungere 25 microlitri di tampone per saggio in ogni pozzetta. Successivamente, aggiungere 25 microlitri di soluzione 1X del cocktail di anticorpi legati a microsfera nelle pozzette.Poiché la soluzione di perle anticorpali è sensibile alla luce, sigillare la piastra e coprirla con carta d'alluminio e coperchio della piastra per proteggerla dalla luce durante il saggio. Incubare la piastra a quattro gradi Celsius su un agitatore per tutta la notte. Il giorno seguente, posizionare la piastra sul supporto della piastra di un lavatore magnetico automatico e lasciarla riposare per un minuto per far sedimentare le perle magnetiche sul fondo del pozzetto.Aspirare il contenuto dei pozzetti e aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio per pozzetto utilizzando un lavatore magnetico automatico. Lasciare in posa la piastra per un minuto, quindi aspirare nuovamente il contenuto dei pozzetti come in precedenza e ripetere il lavaggio un’altra volta. Aggiungere 25 microlitri di soluzione di anticorpo di rilevamento in ciascun pozzetto.Sigillare la piastra. Coprirla con pellicola di alluminio e coperchio della piastra e incubarla a temperatura ambiente su un agitatore per 60 minuti. Successivamente, aggiungere 25 microlitri di soluzione di Streptavidina-Ficoeritrina in ogni pozzetto e, dopo aver sigillato e coperto la piastra, incubarla a temperatura ambiente su un agitatore per 30 minuti.Dopo l'incubazione, posizionare la piastra su un lavatore magnetico e lasciarla a riposo per un minuto. Quindi aspirare il contenuto dei pozzetti e aggiungere 200 microlitri di buffer di lavaggio per ogni pozzetto. Lasciare a riposo per un minuto, quindi aspirare il contenuto dei pozzetti e ripetere il lavaggio una seconda volta.Aggiungere 150 microlitri di fluido di guaina in ogni pozzetto. Successivamente, posizionare la piastra su un agitatore per cinque minuti a temperatura ambiente per risospendere le perle anticorpali prima di procedere con la lettura della piastra e l'analisi delle concentrazioni di citochine. Per leggere la piastra del saggio secondo il protocollo indicato, aprire la pagina dei lotti e fare clic sulla scheda crea un nuovo lotto da un protocollo esistente.Nella casella del nome del lotto, inserire il nome del lotto e digitare una descrizione sul lotto nella casella di inserimento della descrizione facoltativa. Fare clic sul protocollo generato in precedenza, quindi fare clic su avanti. La scheda successiva che si apre è la scheda standard e controlli.Visualizzare i dettagli degli standard del saggio e selezionare avanti. Nella scheda layout della piastra, assegnare i comandi alle pozzette per il batch e fare clic su salva per memorizzare le informazioni del batch nell'elenco dei batch in sospeso. Caricare la piastra nel lettore di piastre per saggi multiplex a base di microsfere ed eseguire il batch dall'elenco dei batch in sospeso.Avviare il software di conversione RBX e, nella sezione seleziona file esponente, selezionare il file csv generato dal software dell'assay multiplex basato su perline. Quindi fare clic sul pulsante genera. Un file rbx verrà salvato nella cartella di output selezionata.Ora, avviare il software di analisi e aprire il file rbx. Quindi, utilizzando l'adattamento della curva 4PL-5PL, ottimizzare le curve standard. Per ottimizzare le curve standard, selezionare nella scheda curva standard le seguenti opzioni: tipo di regressione, logistica 5PL, e trasformazione assi log X, Y lineare. Successivamente, spuntare le seguenti caselle: mostrare le linee dell'intervallo di concentrazione, mostrare i campioni sconosciuti, mostrare i campioni di controllo, applicare a tutti gli analiti e mostrare il rapporto dopo l'ottimizzazione.Fare clic sul pulsante di ottimizzazione per l'ottimizzazione automatica. Nella scheda inserisci informazioni sul campione, assegnare le identità ai campioni. Infine, ottenere le concentrazioni osservate nella scheda della tabella dei risultati e fare clic su esporta tabella dei risultati per generare i dati in un file di foglio elettronico per ulteriori analisi.Sono stati raccolti campioni di lacrime da otto occhi di quattro uomini sani di et&agrave; compresa tra 36 e 52 anni. Dei 41 citochine analizzate mediante saggio multiplex basato su microsfere, 31 sono state rilevate in tutti i campioni di lacrime. Ad esempio, IL-17A, MIP-1b e TNFa sono state rilevate in sette occhi di quattro soggetti e IL-4 &egrave; stata rilevata in sei occhi di quattro soggetti.Inoltre, l'interferone gamma è stato rilevato in sei occhi di tre soggetti. L'interleuchina-1a è stata rilevata in cinque occhi di tre soggetti. L'eotassina e l'interleuchina-9 sono state rilevate in tre occhi di due soggetti.Interleuchina-3 è stata rilevata in un occhio e MIP-1a non è stata rilevata in nessuno dei campioni. Le concentrazioni medie ± deviazione standard delle 41 citochine rilevate sono illustrate in questo grafico a dispersione. L'interleuchina-1ra è risultata altamente espressa in tutti i campioni.Le citochine IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, fractalchina, interleuchina-a, EGF, PDGF-BB, VEGF e G-CSF sono state anch'esse altamente espresse a livelli di nanogrammi per millilitro, mentre le rimanenti citochine sono state espresse a livelli di picogrammi per millilitro. Come si osserva qui, la concentrazione minima misurata di citochine nelle lacrime è stata quella del TNF-a, con una media ± deviazione standard di 27,25 ± 19,97 picogrammi per millilitro. Tra le 31 citochine rilevate in tutti i campioni, nessuna ha mostrato una differenza statisticamente significativa nella concentrazione tra occhio destro e sinistro mediante test T.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 1-1/2 giorni se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come eseguire un saggio multiplex basato su microsfere per il profilo citochinico delle lacrime.

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