Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

L'obiettivo generale di questo trasferimento genico del vettore virale adeno-associato è quello di manipolare geneticamente il cervello e il midollo spinale del ratto su larga scala. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del trasferimento genico. È un modo molto efficiente per introdurre geni in vivo e quindi una tecnica molto potente e versatile.

Questa procedura è rapida e altamente riproducibile. Abbiamo utilizzato questo approccio di trasferimento genico su larga scala per esprimere una proteina correlata alla sclerosi laterale amiotrofica in tutto il midollo spinale dei ratti in diverse pubblicazioni. Il mio collega, Robert Dayton, illustrerà la procedura.

Mychal Grames assisterà Robert. Inizia preparando la postazione di lavoro, per prima cosa pulisci la superficie con etanolo al 70%. Quindi posizionare un termoforo nell'area di lavoro e impostarlo su un riscaldamento a 37 gradi Celsius.

Posiziona un tappetino da banco sopra il termoforo. Verificare che ci sia ossigeno e isoflurano adeguati per la procedura. Pulire la camera di induzione e la maschera per anestesia con etanolo al 70% e posizionare la maschera per anestesia sul cuscinetto della panca.

Assicurarsi che siano a portata di mano, un quadrato di pellicola di paraffina di circa 5 x 5 centimetri per animale, un tampone per la preparazione dell'alcol e due o tre tamponi di garza per animale, puntali per pipette e una micropipetta. Quindi, scongelare il vettore a temperatura ambiente ed etichettare una provetta sterile per microcentrifuga per ogni animale. Pipettare il volume richiesto di AAV nell'apposita provetta e portare il volume fino al volume di iniezione desiderato con una soluzione di ringer lattato o soluzione fisiologica.

Posizionare il vortice del campione per uno o due secondi, quindi centrifugare a impulsi per cinque secondi per portare il campione sul fondo della provetta. Pipettare il volume totale di iniezione fuori dalla provetta e sul quadrato del film di paraffina. Quindi, posiziona un ago calibro 30 su una siringa da un millilitro.

Posizionare l'ago con lo smusso rivolto verso il basso nel vettore sulla pellicola di paraffina. Tira indietro lo stantuffo della siringa fino a quando tutto il virus è nell'ago e nella siringa. Anestetizzare correttamente il ratto utilizzando il sistema di anestesia.

Garantire un adeguato piano di anestesia grazie all'assenza di reazione a un pizzicamento delle dita. Quindi, posiziona il ratto nell'area di lavoro su un lato e mantieni l'anestesia usando il cono del naso. Con il ratto sdraiato su un fianco, una vena laterale della coda dovrebbe essere rivolta verso l'alto.

L'iniezione è due terzi lungo la lunghezza della coda. Pulire il sito di iniezione con il tampone per la preparazione dell'alcol. Tenere saldamente la coda leggermente sopra l'area di iniezione, con un dito direttamente sopra la vena laterale della coda, questo dilatarà la vena.

Con lo smusso rivolto verso l'alto, allineare l'ago con la vena della coda visibile nella stessa direzione. Forare la pelle sopra la vena caudale, facendo molta attenzione a evitare che l'altra mano tenga la coda e prema sulla vena caudale . Rilasciare la pressione dalla vena caudale per consentire il normale flusso sanguigno.

Quindi sposta l'ago nella vena. Per assicurarsi che l'ago abbia perforato la vena caudale, tirare leggermente indietro lo stantuffo. Se l'ago è nella vena, il sangue scorrerà nell'ago.

Dopo aver riposizionato l'ago, se necessario, stabilizzare l'ago tenendo l'estremità della siringa contro la coda. Iniettare lentamente il vettore nella coda a circa 20 microlitri al secondo. In caso di iniezione insufficiente, l'animale verrà trasdotto solo parzialmente e i risultati probabilmente non saranno utili.

Tuttavia, con la pratica, le buone iniezioni sono molto riproducibili e affidabili. Se il vettore è stato somministrato, rimuovere l'ago dalla coda e premere una garza contro il sito di iniezione per aiutare ad arginare l'emorragia per 30-60 secondi. Spegnere l'anestesia con isoflurano e l'ossigeno.

Monitora il ratto fino a quando non riprende conoscenza e poi rimettilo nella sua gabbia. Smaltire i materiali che potrebbero essere contaminati da AAV in un contenitore appropriato per il rischio biologico e pulire la postazione di lavoro con etanolo al 70%. Ottenere sezioni coronali di 50 micron dal cervello fisso e crioprotetto di un animale iniettato con AAV, utilizzando un microtomo scorrevole con stadio di congelamento.

Dopo l'immunocolorazione per GFP e il montaggio su vetrini, fotomicrografare ogni sezione nella regione di interesse definita con una lente a basso ingrandimento utilizzando un microscopio. Mantieni le stesse impostazioni della fotocamera su tutti i campioni da analizzare e salva i dati come file TIFF. Apri il fotomicrografo nel programma Scion Image, ampiamente disponibile.

Si apriranno due finestre, chiuderà la finestra indicata come colore indice. Scegli le opzioni, quindi la sezione di densità. Una gamma di sfumature sarà indicata in rosso sulla finestra della tabella di ricerca.

Nella finestra, utilizzare il cursore per inserire solo l'etichettatura GFP specifica e fermarsi quando lo sfondo non specifico inizia a essere rilevato nell'immagine. Quindi, fai clic su Analizza e imposta scala. La quarta riga dovrebbe dire unità, dall'elenco a discesa, scegli i pixel e fai clic su OK.

Per misurare l'area fluorescente, fare clic su Analizza e quindi su Misura. Quindi, fai clic su analizza e mostra i risultati. Apparirà una finestra dei risultati e la misurazione dell'area fluorescente sarà sotto l'intestazione etichettata, area.

Una volta registrate tutte le misurazioni, fare la media dei valori da tre a sei sezioni per animale. Utilizzare un test statistico appropriato per confrontare le aree trasdotte tra i gruppi. Questa immagine rappresentativa mostra l'immunofluorescenza GFP nel cervelletto di ratto, quattro settimane dopo un'iniezione di AAV 9 GFP nella vena caudale.

Il software di analisi delle immagini è stato utilizzato per evidenziare selettivamente l'area fluorescente e per quantificare i pixel evidenziati. Questa è l'immagine GFP di un animale non trasdotto. L'analisi di questa immagine, utilizzando gli stessi parametri per l'animale iniettato con GFP, rileva un livello molto basso di segnale di fondo.

Una volta padroneggiata, l'iniezione può essere eseguita in circa cinque minuti per ratto. In conclusione, questa tecnica descrive un modo per introdurre in modo efficiente i geni nel SNC del ratto, una sola consegna genica produce un'espressione duratura ed effetti a lungo termine. Ancora più importante, il sistema nervoso centrale viene manipolato dalla periferia.

Un'iniezione di vettore endovenoso relativamente non invasiva raggiunge il cervello e il midollo spinale, il SNC.