Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA
12 novembre 2017
Microirradiation laser è uno strumento utile per gli studi della riparazione del DNA in cellule viventi. È indicato un approccio metodologico per l'utilizzo del laser UVA per indurre varie lesioni del DNA. Abbiamo ottimizzato un metodo per microirradiation locale che mantiene il normale ciclo cellulare; quindi, cellule irradiate procedono attraverso mitosi.
L'obiettivo generale di questi esperimenti è quello di indurre lesioni al DNA utilizzando la microirradiazione locale delle cellule e di osservare il reclutamento di proteine coinvolte nei processi di riparazione del DNA. Questo metodo può aiutarci a capire una domanda molto complessa e profonda come ad esempio come le cellule normali e tumorali rispondono al danno al DNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che siamo in grado di studiare la risposta al danno del DNA in singole cellule vive. A dimostrare la procedura saranno Sona Legartova, una post-doc e Jana Suchankova, una dottoranda del mio laboratorio. Per iniziare, coltivate le cellule HeLa in DMAM integrato con il 10% di FBS e antibiotici appropriati. Incubare le cellule a 37 anni
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Panoramica
L'irraggiamento microscopico con laser è una tecnica preziosa per lo studio dei meccanismi di riparazione del DNA nelle cellule vive. Questo studio presenta un metodo ottimizzato per l'utilizzo di laser UVA per indurre lesioni specifiche del DNA mantenendo intatta la normale progressione del ciclo cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Riparazione del DNA
- Biologia cellulare
- Microirradiazione con laser
Sfondo
- Comprendere la riparazione del DNA è fondamentale per ottenere informazioni sulle risposte cellulari ai danni.
- La microirradiazione con laser consente l'induzione precisa di lesioni del DNA.
- Il mantenimento di un ciclo cellulare normale è essenziale per uno studio accurato dei meccanismi di riparazione.
- I laser UVA sono efficaci nel creare danni localizzati al DNA.
Scopo dello studio
- Ottimizzare un metodo di microirradiazione locale mediante laser UVA.
- Studiare gli effetti delle lesioni del DNA indotte sul progresso del ciclo cellulare.
- Migliorare la comprensione dei processi di riparazione del DNA in cellule vive.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di laser UVA per microirradiazione.
- Monitoraggio della progressione del ciclo cellulare dopo l'irradiazione.
- Valutazione dei meccanismi di riparazione del DNA in cellule irradiate.
- Confronto del comportamento tra cellule normali e irradiate.
Risultati principali
- Il metodo di microirradiazione ottimizzato ha indotto con successo lesioni del DNA.
- Le cellule hanno mantenuto un normale progresso del ciclo cellulare nonostante l'irradiazione.
- È stata ottenuta una valutazione efficace dei meccanismi di riparazione del DNA.
- I risultati contribuiscono alla comprensione delle risposte cellulari ai danni del DNA.
Conclusioni
- Il metodo ottimizzato di microirradiazione con laser UVA è efficace per lo studio della riparazione del DNA.
- Il mantenimento del normale ciclo cellulare è cruciale per ottenere risultati sperimentali accurati.
- Questo approccio può essere applicato a ulteriori ricerche sui danni al DNA e sulla sua riparazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La microscopia confocale avanzata combinata con microirradiazione laser consente un'analisi precisa in cellule vive delle interazioni proteina-proteina e della cinetica di riparazione a livello di lesioni del DNA. Questa capacità è fondamentale per ridurre i rischi associati alle ipotesi iniziali di scoperta riguardo ai percorsi di risposta al danno del DNA e per acquisire una maggiore sicurezza predittiva nella validazione degli obiettivi terapeutici. L'approccio favorisce la continuità traslazionale permettendo studi meccanicistici in contesti cellulari rilevanti per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'osservazione diretta del reclutamento delle proteine e delle dinamiche di interazione nei siti di danno al DNA in cellule vive.
- Consente la validazione funzionale degli obiettivi della riparazione del DNA quantificando la cinetica e il coinvolgimento delle vie.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico distinguendo le risposte dipendenti dal ciclo cellulare mediante il sistema Fucci.
- Fornisce evidenze riguardo alla selettività della via e al coinvolgimento dell'obiettivo in modelli pertinenti alle malattie.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce sistemi validati di cellule vive per la valutazione quantitativa della cinetica e delle interazioni proteiche.
- Supporta la standardizzazione dei saggi attraverso l'induzione riproducibile di lesioni del DNA con parametri laser definiti.
- Permette lo screening ad alto contenuto di modulatori che influenzano la dinamica delle proteine di riparazione del DNA.
- Fornisce output quantitativi mediante FRAP, FLIM e FLIM-FRET per una valutazione robusta dei composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati meccanicistici ai fenotipi del riparo del DNA rilevanti per la malattia in cellule tumorali e normali.
- Supporta la scoperta di biomarcatori collegando la cinetica delle interazioni proteiche agli esiti cellulari dopo il danno.
- Permette un avanzamento proporzionato al rischio fornendo dati predittivi sulla modulazione delle vie di riparo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa metodologia integra le fasi iniziali della scoperta fino all'identificazione del composto guida, supportando sia la verifica delle ipotesi sia lo screening quantitativo in sistemi cellulari viventi.
- Biologia della scoperta: Fornisce un'analisi in tempo reale del reclutamento proteico e delle interazioni a livello di lesioni del DNA per chiarire le vie coinvolte.
- Screening: Offre letture quantitative e riproducibili della cinetica proteica e delle interazioni per lo sviluppo di saggi.
- Analisi: Utilizza FRAP, FLIM e FLIM-FRET per generare dati cinetici e di interazione comparativi tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega il comportamento meccanicistico delle proteine alla fase del ciclo cellulare e agli esiti della riparazione del DNA in modelli pertinenti.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma modulare adattabile a diversi bersagli di riparazione del DNA e sistemi cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dei bersagli della riparazione del DNA e nella deconvoluzione dei percorsi.
- Valore operativo: Standardizza l'induzione del danno al DNA in cellule vive e i flussi di lavoro per l'analisi quantitativa delle proteine.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o meno fornendo evidenze meccanicistiche dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione, corretta in base al rischio, dei bersagli e dei meccanismi della riparazione del DNA per lo sviluppo successivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze avanzate in microscopia confocale e tecniche di imaging su cellule vive.
- Necessita l'accesso a piattaforme di microirradiazione laser e infrastrutture per l'imaging quantitativo.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i parametri di irradiazione e i protocolli di analisi cinetica.
- L'adattamento a diversi tipi cellulari potrebbe richiedere l'ottimizzazione delle impostazioni laser e dei marcatori del ciclo cellulare.
- L'interpretazione dei dati cinetici e delle interazioni deve tenere conto della fase del ciclo cellulare e del tipo di lesione del DNA.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Cultivation of HeLa-derived Cell Lines
1:48
Cell Transfection
3:21
Induction of Local DNA Lesions and Confocal Microscopy
4:47
Fluorescence Lifetime Image Microscopy
6:24
FRET Efficiency Using the FLIM-FRET Script
7:48
FRAP Analysis
8:50
Results: Analysis of Recruitment of mCherry-tagged PCNA and -53BP1 at DNA Lesions in HeLa Cells
11:00
Conclusion
