Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule progenitrici endoteliali dal sangue del cordone ombelicale umano. Questo metodo descrive l'isolamento di cellule progenitrici endoteliali dal sangue del cordone ombelicale per il loro potenziale utilizzo come cellule autologhe per l'ingegneria tissutale di innesti vascolari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la procedura di isolamento può essere eseguita in terreni specializzati senza la necessità di alcuna selezione amminica.

Le cellule progenitrici endoteliali isolate possono essere utilizzate per studiare la neovascolarizzazione e i rapporti hanno anche suggerito che queste cellule possono essere utilizzate come biomarcatori per identificare i pazienti a rischio di malattie cardiovascolari. Prima di iniziare la procedura di isolamento, pre-rivestire sei piastre a pozzetti con due millilitri di coda di ratto appena preparata, una soluzione di collagene per pozzetto. Equilibrare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% CO2 per almeno un'ora.

Quindi diluire circa 25 millilitri di sangue del cordone ombelicale con HBSS a una concentrazione di uno a uno. Quindi aggiungere 20 millilitri di reagente del terreno a gradiente di densità in una provetta conica da 50 millilitri ed erogare con cura 20 millilitri di sangue del cordone ombelicale diluito lungo la parete della provetta per sovrapporre il sangue al terreno. Separare le cellule mediante centrifugazione, seguita da un'attenta rimozione dello strato di plasma.

Utilizzando una siringa dotata di un ago calibro 18, raccogliere la cellula mononucleata contenente buffy coat in una nuova provetta da 50 millilitri. E aggiungi un volume uguale di terreno basale endoteliale alle cellule. Lavare le cellule mediante centrifugazione e lisare i globuli rossi nel palato risultante con cinque millilitri di soluzione di cloruro di ammonio su ghiaccio.

Dopo cinque-10 minuti agitando occasionalmente, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet bianco in un terreno di crescita endoteliale fresco. Dopo il conteggio, aspirare il collagene da ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti e lavare i pozzetti tre volte in PBS. Seminare le cellule mononucleate a una volta 10 fino alla settima cella per due millilitri di terreno per concentrazione di pozzetti.

E rimetti la piastra nell'incubatrice per 24 ore. Il giorno successivo, sciacquare le cellule una volta con un terreno di coltura endoteliale fresco. Quindi sostituire il lavaggio con tre millilitri di terreno di coltura endoteliale fresco e rimettere le cellule nell'incubatore per colture cellulari.

Utilizzando un microscopio a campo chiaro, ottenere immagini giornaliere delle cellule per monitorare la progressione delle colonie di cellule endoteliali, contrassegnando le piastre in cui sorgono le colonie per seguirne la crescita. Quando le colonie di cellule endoteliali raggiungono una dimensione di circa tre millimetri, rivestire un pallone di coltura T25 con collagene fresco di coda di ratto per almeno un'ora nell'incubatore di coltura cellulare. Quindi raccogliere le cellule con 150 microlitri di tripsina-EDTA allo 0,05% per pozzetto nell'incubatore di coltura cellulare per due o tre minuti.

Picchiettare delicatamente la piastra per rimuovere le celle attaccate. Quando le cellule iniziano a staccarsi, aggiungere immediatamente due millilitri di terreno di crescita endoteliale fresco e tirare le cellule in un unico tubo conico da 15 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un terreno di crescita endoteliale fresco.

Dopo il conteggio, seminare le cellule nel pallone rivestito di collagene a una velocità di cinque volte 10 fino alla quinta cellula in tre millilitri di terreno per densità del pallone e contrassegnare il pallone come passaggio uno. Quindi rimetti il pallone nell'incubatrice, riseminando le cellule ogni volta che la colonia raggiunge il 90% di confluenza. Dopo la semina sulle piastre trattate con collagene, la prima crescita della colonia si osserva in genere tra il quinto e il nono giorno.

Le colonie continuano a crescere e ad acquisire una morfologia cellulare a forma di fuso nelle prime fasi della coltura, che in seguito progredisce verso una morfologia simile a un ciottolo. Il numero totale di cellule raccolte ad ogni passaggio aumenta in diretta correlazione con il numero totale di giorni in coltura. L'analisi Western blot rivela un'espressione precoce di CD 31 e CD 34 da parte delle cellule endoteliali in coltura, che sembra diminuire con il successivo passaggio.

L'espressione del recettore due del fattore di crescita dell'endotelio vascolare, tuttavia, si mantiene nel tempo, anche se ad un livello di espressione leggermente inferiore rispetto a quello osservato dopo il primo passaggio. Da notare che le cellule progenitrici endoteliali non sono positive per il marcatore delle cellule mesenchimali alfa actina della muscolatura liscia, a differenza, ad esempio, dei lisati delle cellule interstiziali valvolari, che possono essere inclusi come controllo positivo. L'intera procedura di isolamento può essere completata in meno di cinque ore, a seconda dell'unità di sangue cordonale ottenuta.

Dopo aver isolato e seminato le cellule mononucleate nel terreno di crescita endoteliale, di solito ci vogliono dai cinque ai nove giorni prima che le colonie di EPC si presentino nella coltura. Il metodo di isolamento proposto utilizza terreni specializzati per la coltura delle cellule progenitrici endoteliali ed evita l'uso di un citometro a flusso, per quanto riguarda la necessità di avere marcatori endoteliali. Questo metodo fornisce anche un protocollo efficiente per ottenere elevate quantità di cellule progenitrici endoteliali in un breve lasso di tempo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule progenitrici endoteliali dalle unità di sangue del cordone ombelicale umano. Non dimenticare che il sangue del cordone ombelicale umano può essere pericoloso e che è necessario seguire il corretto smaltimento del sangue di scarto e dei prodotti di coltura cellulare.