Determinazione degli acidi sialici nei campioni di fegato e latte di tipo selvatico e

L'obiettivo generale di questa metodologia è la rilevazione di acido N-acetilneuraminico e acido N-glicolilneuraminico nel fegato e nel latte di topi di tipo selvaggio e di topi knock-out per CMAH mediante analisi HPLC. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nel campo della glicoscientifica, in particolare all'effetto che i genotipi dei modelli murini CMAH hanno sui contenuti effettivi di acidi sialici in questi animali. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto agli screening genetici è che i livelli relativi di acidi sialici possono essere determinati anche nei topi eterozigoti.

La valutazione di questo metodo sarà effettuata da Cui Cao e Wang Wenjiao, due studenti laureati del nostro laboratorio. Iniziare questa procedura con il prelievo di latte murino e tessuto epatico murino da topi knock-out per CMAH, come descritto nel protocollo testuale. Per isolare gli acidi sialici dal latte, trasferire 50 microlitri di latte in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitro e aggiungere 1,2 millilitri di soluzione acquosa di acido acetico preparata.

Per isolare gli acidi sialici dal tessuto epatico, scongelare delicatamente da 20 a 50 milligrammi di fegato di topo e trasferirli in un omogeneizzatore tissutale Dounce. Aggiungere 1,2 millilitri di soluzione acquosa di acido acetico e omogeneizzare il tessuto mediante taglio delicato per 10 secondi. Trasferire la sospensione ottenuta in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.

Successivamente, incubare il latte acidificato o la sospensione tissutale per quattro ore a 80 gradi Celsius. Poi, centrifugare il campione a 14 mila volte g per 10 minuti. Trasferire i primi 1000 microlitri del soprannatante in un nuovo tubo da centrifuga da 1,5 millilitri.

Rimuovere il solvente mediante evaporazione centrifuga a temperatura ambiente fino a completa essiccazione. Riportare il campione in soluzione con 500 microlitri di acqua distillata. Successivamente, preparare una colonna microscopica per scambio anionico trasferendo 200 milligrammi di resina a scambio anionico per campione in tubi vuoti da 3 millilitri dotati di rubinetto.

Aggiungere 2 millilitri di soluzione acquosa di acido acetico per sostituire gli ioni cloruro nella resina con ioni acetato. Chiudere il rubinetto non appena il solvente raggiunge la sommità della resina. Aggiungere delicatamente 2 millilitri di acqua distillata e aprire il rubinetto.

Fermare il flusso non appena la maggior parte del solvente raggiunge la sommità della resina. Assicurarsi che la resina sia sempre coperta di solvente. Quindi, lavare la colonna di resina altre due volte con due millilitri di acqua distillata per rimuovere l'eccesso di acetato.

Trasferire i 500 microlitri risultanti di solvente del campione sulla colonna di resina e scartare il flusso iniziale. Lavare delicatamente la resina con 2 millilitri di acqua distillata. Eluire gli anioni del campione dalla resina utilizzando 1 millilitro di una soluzione di acetato di ammonio 50 millimolare in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri.

Rimuovere il solvente mediante evaporazione centrifuga a temperatura ambiente fino a completa essiccazione. Pesare da 5 a 8 milligrammi di acido N-acetilneuraminico su una bilancia analitica in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri. Annotare il peso esatto e aggiungere 164 microlitri di acqua distillata per ogni milligrammo.

Acquisire acido N-glicolilneuraminico in piccole quantità a un prezzo moderato, ad esempio in aliquote da 1 milligrammo. Aggiungere direttamente 154 microlitri di acqua distillata al composto per ottenere una soluzione madre di circa 20 millimolari di Neu5Gc. Trasferire la soluzione in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri.

Questa soluzione può essere conservata a meno 20 gradi Celsius per un massimo di 12 mesi. Combinare 5 microlitri di ciascuna soluzione madre in un nuovo tubo da centrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, rimuovere il solvente mediante evaporazione centrifuga a temperatura ambiente fino a completa essiccazione.

Aggiungere 20 microlitri della soluzione OPD ai campioni di acido sialico ottenuti dal latte di topo, fegato di topo o dallo standard misto di acidi sialici. Vortexare il campione vigorosamente per 30 secondi. Successivamente, incubare i campioni per quattro ore a 80 gradi Celsius al buio.

Dopo aver lasciato raffreddare i campioni per cinque minuti, aggiungere 80 microlitri di acqua distillata. Successivamente, centrifugare i tubi a 14 mila ×g per un minuto. Poi, trasferire 80 microlitri del soprannatante in un vial HPLC ad alto recupero da 300 microlitri.

I campioni di acido sialico derivatizzato possono essere conservati da quattro a sei gradi Celsius per un massimo di una settimana. Analizzare i campioni utilizzando un sistema HPLC standard collegato a un rivelatore di fluorescenza in linea. Utilizzare una colonna a fase inversa C18 con una lunghezza di 250 millimetri e un diametro di 4,6 millimetri per l'analisi.

Dopo aver preparato il solvente A e il solvente B e aver configurato la corsa di HPLC come specificato nel protocollo, iniettare 50 microlitri del campione nel sistema di HPLC. Monitorare l'eluizione utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione del rivelatore di fluorescenza di 373 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 448 nanometri. Infine, calcolare la quantità relativa di Neu5Gc come descritto nel protocollo testuale.

Qui sono mostrati cromatogrammi rappresentativi di acidi sialici marcati con fluorescenza provenienti da campioni di latte, ottenuti da topi CMAH knock-out omozigoti e da topi CMAH knock-out eterozigoti. Sono inoltre mostrati topi di tipo selvaggio. Analogamente, vengono mostrati i cromatogrammi di acidi sialici marcati con fluorescenza derivati dal fegato di topo.

Il confronto tra le quantità relative di Neu5Gc mostra che i topi knock-out omozigoti per CMAH non contengono Neu5Gc, mentre i topi knock-out eterozigoti per CMAH e i topi wild-type contengono tra il 10 e il 75% di Neu5Gc. Una volta acquisita padronanza, i campioni possono essere preparati entro otto ore se la procedura viene eseguita correttamente. Inoltre, i campioni possono essere analizzati mediante autosampling HPLC durante la notte.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di effettuare l'isolamento dell'acido sialico e la procedura di derivatizzazione nello stesso giorno. Dopo aver eseguito la procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'analisi spettrometrica di massa, al fine di confermare la natura dei segnali fluorescenti ottenuti. Lo sviluppo di questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare la distribuzione dell'acido sialico in campioni biologici.

Non dimenticare che lavorare con acido acetico e acido formico concentrati può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.