Screening delle nanoparticelle bioattive in cellule immunitarie fagocitiche per gli inibitori della segnalazione di ricetrasmettitori simili

L'obiettivo generale di questa procedura di screening è identificare nuove nanoparticelle bioattive in grado di inibire la segnalazione del recettore toll-like. Questo metodo può aiutarti a identificare fisicamente nuovi nanoinibitori che mirano alla segnalazione del recettore toll-like nelle cellule immunitarie innate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce, robusta e facile da eseguire utilizzando i sistemi di celle reporter.

Le applicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di molte malattie infiammatorie perché si è scoperto che la segnalazione del recettore toll-like è coinvolta nella patogenesi di queste malattie. Sebbene questo metodo possa fornire un elevato screening su nanoparticelle d'oro, può essere applicato anche ad altri sistemi di nanoparticelle, nonché a piccole molecole terapeutiche e alle biologie. Per iniziare questa procedura, preparare i terreni di coltura come indicato nel protocollo di testo.

Quindi, aggiungi 100 millilitri di acqua ultrapura priva di endotossine a un pallone di vetro pulito da 125 millilitri. Aggiungere una busta di polvere di substrato di fosfatasi alcalina embrionale secreta e agitare delicatamente la soluzione fino a quando non è completamente dissolta. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per garantire la completa dissoluzione dei substrati.

Utilizzando una membrana da 0,2 micrometri, filtrare la soluzione. Conservare a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Quindi, aggiungere una busta di polvere di substrato di luciferasi a una provetta da centrifuga da 50 millilitri contenente 25 millilitri di acqua ultra pura priva di endotossine.

Dopo che la polvere si è completamente sciolta, conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana fino al momento dell'uso. Quindi, preparare le soluzioni stock di tutti gli altri reagenti come indicato nel protocollo di testo. Dopo aver coltivato e preparato le cellule, trasferirle dal pallone di coltura a una provetta da centrifuga.

Far girare le celle a 300 volte G per cinque minuti. Quindi, risospenderli nel mezzo R-10 a una concentrazione di 1 X 10 per 6 cellule per millilitro. Aggiungere aliquote della soluzione di PMA alla sospensione cellulare in modo tale che la concentrazione finale sia di 50 nanogrammi per millilitro.

Versare la sospensione cellulare in un serbatoio di reagenti sterile. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a fondo piatto da 96 pozzetti. Incubare in un incubatore per colture cellulari per 24 ore a 37 gradi Celsius.

Successivamente, utilizzare un aspiratore a vuoto per rimuovere con cura il terreno di coltura. Utilizzando un microscopio invertito, controllare le cellule per assicurarsi che i macrofagi derivati aderiscano sul fondo del pozzetto. Lavare delicatamente le cellule due volte utilizzando 100 microlitri di PBS per pozzetto per ogni lavaggio.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno fresco di R-10 a ciascun pozzetto. Lasciare riposare le cellule per due giorni in un incubatore a 37 gradi Celsius prima di eseguire il test reporter. Innanzitutto, determinare la dose ottimale di LPS come indicato nel protocollo di testo.

Quindi, aggiungere 180 microlitri di soluzione Quanti-Blue preriscaldata a ciascun pozzetto di una nuova piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Quindi, trasferire 20 microlitri di surnatante da ciascun campione nella piastra. Incubare a 37 gradi Celsius per una o due ore per consentire al colore di svilupparsi dal rosa al blu scuro.

Dopo che la densità ottica è superiore a uno, utilizzare un lettore di piastre per determinare l'assorbimento a 655 nanometri. Per iniziare l'analisi dell'attivazione dell'IRF, trasferire 10 microlitri di surnatante fresco da ciascun campione in una piastra bianca a fondo piatto trasparente a 96 pozzetti. Utilizzando l'autoiniezione, aggiungere 50 microlitri della soluzione di luciferasi a ciascun pozzetto.

Quindi raccogliere immediatamente la luminescenza pozzetto per pozzetto per produrre una curva dose-risposta per determinare la concentrazione ottimale di LPS per lo screening delle nanoparticelle. Successivamente, centrifugare 20 volumi della soluzione ibrida peptide-GMP in provette Eppendorf da 1,5 millilitri a 18.000 volte G per 30 minuti. Scartare con cura i surnatanti.

Trasferisci gli ibridi in un unico tubo fresco e lavali due volte con un millilitro di PBS. Successivamente, risospendere gli ibridi lavati in un volume di terreno R-10. Miscelare volumi uguali degli ibridi concentrati e dell'LPS contenente terreno R-10 in modo tale che la concentrazione finale degli ibridi e dell'LPS sia rispettivamente di 100 nanomolari e 10 nanogrammi per millilitro.

Quindi, rimuovere il terreno di coltura dalla piastra di coltura dei macrofagi. Aggiungere 100 microlitri della miscela ibrida di LPS in ogni pozzetto, con tre repliche per ogni condizione. Includi un controllo negativo e un controllo LPS.

Incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, trasferire il terreno di ciascun pozzetto in una provetta da centrifuga separata. Centrifugare le provette a 18.000 volte G e quattro gradi Celsius per 30 minuti.

Trasferire i surnatanti in una piastra inferiore rotonda fresca da 96 pozzetti. Per iniziare il test reporter su questi campioni, aggiungere 180 microlitri di soluzione Quanti-Blue preriscaldata a ciascun pozzetto di una nuova piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Quindi, trasferire 20 microlitri di surnatanti da ciascun campione in questa piastra.

Incubare a 37 gradi Celsius per una o due ore fino a quando il colore blu scuro si sviluppa fino a una densità ottica superiore a uno. Successivamente, utilizzare un lettore di piastre per registrare l'assorbimento a 655 nanometri. Quindi, trasferire 10 microlitri di surnatante fresco da ciascun campione in una piastra bianca trasparente a fondo piatto a 96 pozzetti.

Utilizzando un iniettore automatico, aggiungere 50 microlitri della soluzione di luciferasi a ciascun pozzetto e registrare immediatamente la luminescenza pozzetto per pozzetto. Quindi, convalidare l'effetto inibitorio dei potenziali candidati e valutare la specificità del TLR come delineato nel protocollo di testo. In questo studio, l'attivazione di NF-Kappa B AP1 è rilevata dal saggio colorimetrico SEAP, in cui l'attivazione di TLR-4 da parte di LPS provoca l'attivazione di NF-Kappa B AP1 e la produzione di SEAP.

Il PAES rilasciato converte il substrato, portando a un cambiamento di colore proporzionale alla quantità di PAES rilasciata dopo la stimolazione. Questo viene quantificato misurando l'assorbanza a 655 nanometri. Successivamente, l'attivazione dell'IRF mediata da LPS ha portato all'espressione della luciferasi, catalizzando il substrato per produrre luminescenza.

Da queste risposte alla dose viene determinata una concentrazione ottimale di LPS di 10 nanogrammi per millilitro per lo screening di una libreria precedentemente stabilita di ibridi peptide-GMP. Da questo, un gruppo di ibridi è stato identificato per la loro potente capacità di inibire l'attivazione innescata da LPS sia per NF-Kappa B AP1 che per IRF. La convalida di questa attività inibitoria mostra che all'aumentare della concentrazione di LPS, gli effetti inibitori dell'ibrido si riducono, come previsto.

L'immunoblotting viene quindi condotto per confermare l'attività di inibizione. Si è visto che l'ibrido di piombo riduce la fosforilazione di p65, inibisce la degradazione di I-Kappa B alfa e ritarda la fosforilazione di IRF3, confermando che l'ibrido di piombo, P12, è in grado di inibire la segnalazione TLR-4 mediata da LPS. Ulteriori indagini rivelano che P12 riduce anche la segnalazione di NF-Kappa B AP1 mediata da TLR-2 e TLR-5, così come l'attivazione dell'IRF mediata da TLR-3, suggerendo che P12 ha una potente attività inibitoria su più vie di TLR.

Dopo questa procedura, devono essere eseguite altre misure come l'immunoblotting e il test di citotossicità al fine di convalidare i risultati dello screening ed evitare la scoperta di falsi positivi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ad altri ricercatori nel campo della nanomedicina per esplorare i nanoinibitori nella segnalazione del recettore toll-like come terapie informatorie di nuova generazione.