Un lievito modificato - un sistema ibrido per studi di interazione tra DNA e proteine ​​eteromeriche

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di studiare e convalidare l'interazione eteromerica proteina-DNA in un sistema eterologo per qualsiasi studio di genomica funzionale in un normale ambiente di laboratorio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genomica funzionale, come la genomica pianificata. Il vantaggio principale di questa tecnica è che rileva le interazioni proteina-DNA che coinvolgono più di una proteina o fattore di trascrizione.

Inizia questa procedura il pomeriggio di quello che verrà designato come primo giorno. Iniziare una coltura da 5 millilitri in terreno sintetico definito o SD senza uracile da una piastra di Petri appena striata. Incubare per una notte in un agitatore a 30 gradi Celsius.

Il pomeriggio successivo, inoculare 10 millilitri di terreno YPDA con 500 microlitri di coltura notturna e incubare per una notte in un agitatore a 30 gradi Celsius. La mattina presto del giorno successivo, inoculare 100 millilitri di terreno YPDA con 2 millilitri di coltura notturna. Coltiva questa coltura fresca a 30 gradi Celsius fino a quando la densità ottica, a 600 nanometri, raggiunge da 0,4 a 0,8.

Centrifugare a 1000 volte G e 21 gradi Celsius per 5 minuti. Scartare il surnatante. Aggiungere 10 millilitri di acqua sterile e ricostituire il pellet mediante vortex.

Centrifugare a 1000 volte G e 21 gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il surnatante, aggiungere 2 millilitri di acetato di litio TE e ricostituire il pellet mediante vortex. Centrifugare a 1000 volte G e 21 gradi Celsius per cinque minuti.

Scartare il surnatante. Aggiungere 4 millilitri di acetato di litio TE più 400 microlitri di DNA di sperma di salmone e risospendere il pellet pipettando su e giù. Le cellule sono ora pronte per la trasformazione, come dimostrato nel prossimo segmento.

La co-trasformazione delle cellule viene eseguita in una piastra di miscelazione con fondo a U a 96 pozzetti. Innanzitutto, distribuire 20 microlitri di cellule competenti per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere ai pozzetti, 150 nanogrammi ciascuno dei due plasmidi e il controllo di normalizzazione.

Questo schema mostra la piastra generale impostata per la co-trasformazione delle cellule di lievito con la proteina di interesse. La configurazione della piastra può essere modificata in base alle esigenze dell'esperimento e al numero di regioni o frammenti di DNA testati. Aggiungere 100 microlitri di polietilenglicole acetato di litio TE per pozzetto e mescolare tre volte mediante pipettaggio.

Coprire la piastra con una guarnizione traspirante e incubare a 30 gradi Celsius per 20-30 minuti. Shock termico a 42 gradi Celsius per 20 minuti esatti. Dopo lo shock termico, centrifugare a 1000 volte G e 21 gradi Celsius per 5 minuti.

Utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere il surnatante. Aggiungere 110 microlitri di TE e mescolare. Centrifugare nuovamente per 5 minuti.

Rimuovere 100 microlitri di surnatante da ogni pozzetto. Immergere un perforatore in etanolo al 100%, fiammarlo, attendere un minuto che i perni del perforatore si raffreddino, quindi utilizzare il perforatore sterile per risospendere il pellet. Trasferire le cellule su piastre a coclea SD triptofano e lucina drop-out.

Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due giorni. Nel pomeriggio del quinto giorno, recupera le piastre della coclea dall'incubatrice. Riempire ogni pozzetto della piastra di miscelazione sterile a 96 pozzetti con fondo a U con 50 microlitri di TE. Prebagnare un perforatore sterile in TE, perforare le colonie dalla piastra di rilascio di triptofano SD e lucina e risospenderle nella piastra riempita di TE.

Trasferire le colonie su nuove piastre a coclea SD triptofano e lucina, per una copertura ottimale della superficie. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 2 giorni. Nel pomeriggio del giorno 7, recuperare le piastre della coclea dall'incubatrice.

Riempire ogni pozzetto di una piastra di miscelazione sterile con fondo a U a 96 pozzetti con 50 microlitri di triptofano SD e terreno di uscita di lucina. Riempire ogni pozzetto di un blocco sterile di 96 pozzetti profondi con 180 microlitri di triptofano SD e terreno di uscita di lucina. Sterilizzare il perforatore, prebagnare il perforatore e il terreno e trasferire le colonie dalla piastra ai pozzetti che contengono ciascuno 50 microlitri di terreno.

Trasferire 20 microlitri di lievito nei 180 microlitri di triptofano SD e terreno di uscita di lucina. Sigillare il blocco con una guarnizione traspirante e incubare a 30 gradi Celsius agitando per 36 ore. La mattina del nono giorno, trasferire 100 microlitri di coltura in 500 microlitri di terreno YPDA in un blocco di 96 pozzetti profondi sterilizzato.

Coprire con una guarnizione traspirante e incubare a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min per tre-cinque ore. Dopo tre-cinque ore, risospendere la coltura e trasferire 125 microlitri da ciascun pozzetto a una piastra spettrofotometrica. Misurare la densità ottica a 600 nanometri per assicurarsi che sia compresa tra 0,3 e 0,6.

Centrifugare le celle rimanenti nel blocco del pozzetto profondo a 3000 volte G e 21 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il surnatante invertendolo. Aggiungere 200 microlitri di tampone Z a ciascun pozzetto e vortice.

Centrifugare a 3000 g e 21 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il surnatante invertendolo. Aggiungere 21 microlitri di tampone Z a ciascun pozzetto e vortice.

Coprire la piastra con una pellicola sigillante resistente ai cicli di gelo e disgelo. In una cappa aspirante, eseguire 4 cicli di congelamento/scongelamento utilizzando azoto liquido e un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius. Aggiungere 200 microlitri di soluzione ONPG di beta-mercaptoetanolo tampone Z appena preparata a ciascun pozzetto.

Incubare a 30 gradi Celsius per 17-24 ore o fino a quando non si sviluppa il colore. La mattina del giorno 10, controlla che il colore si sia sviluppato. Aggiungere 110 microlitri di carbonato di sodio molare in ogni pozzetto per fermare la reazione.

Registra il tempo e agita la piastra. Centrifugare a 3000 volte G e 21 gradi Celsius per dieci minuti. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 125 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto a una piastra spettrofotometrica.

Misura la densità ottica a 420 nanometri. Calcolare l'attività della beta galattosidasi in un foglio di calcolo come descritto nel protocollo di testo. In questo studio, la regione del promotore di 2600 coppie di basi a monte dell'inizio del sito di inizio della trascrizione è stata segmentata in sei regioni o frammenti.

Questa foto è un esempio di un piatto ben cresciuto e positivo dopo il quinto giorno del protocollo. In questo risultato rappresentativo, i frammenti di DNA uno e quattro mostrano un'interazione positiva con il complesso proteico A e B. Dopo la misurazione dell'attività della beta golattosidasi, il primo frammento mostra un'induzione quadrupla dell'attività del gene reporter.

È importante ricordare che questa procedura è raccomandata per ottenere informazioni sulle regioni del DNA solo dopo la conferma dell'interazione proteina proteina proposta e non è progettata per fornire informazioni sui siti bersaglio. Seguendo queste procedure, è possibile eseguire altri metodi, come il test del chip e l'Msar per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, l'identificazione dei siti target in vivo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare e convalidare il ruolo dei complessi proteici multimerici che si legano a un bersaglio comune del DNA.