Un lievito modificato - un sistema ibrido per studi di interazione tra DNA e proteine ​​eteromeriche

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare e validare l'interazione tra un complesso proteico eteromerico e il DNA in un sistema eterologo per qualsiasi studio di genomica funzionale in un laboratorio standard. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della genomica funzionale, come la genomica pianificata. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di rilevare interazioni proteina-DNA che coinvolgono più di una proteina o fattore di trascrizione.

Iniziare questa procedura nel pomeriggio di quello che sarà indicato come giorno uno. Avviare una coltura di 5 millilitri in mezzo sintetico definito o mezzo SD senza uracile a partire da una piastra di Petri appena seminata. Incubare tutta la notte in un agitatore a 30 gradi Celsius.

Nel pomeriggio seguente, inoculare 10 millilitri di mezzo YPDA con 500 microlitri della coltura da incubazione notturna e incubare tutta la notte in un agitatore a 30 gradi Celsius. Presto al mattino del giorno successivo, inoculare 100 millilitri di mezzo YPDA con 2 millilitri della coltura da incubazione notturna. Far crescere questa coltura fresca a 30 gradi Celsius fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge un valore compreso tra 0,4 e 0,8.

Centrifugare a 1000 × g e 21 °C per 5 minuti. Eliminare il soprannatante. Aggiungere 10 millilitri di acqua sterile e risospendere il pellet mediante vortex.

Centrifugare a 1000 × g e 21 °C per cinque minuti. Eliminare il soprannatante, aggiungere 2 millilitri di acetato di litio TE e risospendere il pellet mediante vortex. Centrifugare a 1000 × g e 21 °C per cinque minuti.

Eliminare il soprannatante. Aggiungere 4 millilitri di acetato di litio TE più 400 microlitri di DNA di sperma di salmone e risospendere il pellet aspirando e dispensando con una pipetta. Le cellule sono ora pronte per la trasformazione, come dimostrato nel segmento successivo.

La co-trasformazione delle cellule viene eseguita in una piastra da 96 pozzetti con fondo a U. In primo luogo, distribuire 20 microlitri di cellule competenti per pozzetto nella piastra da 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere nei pozzetti 150 nanogrammi di ciascuno dei due plasmidi e del controllo di normalizzazione.

Questo schema mostra la configurazione generale della piastra per la co-trasformazione delle cellule di lievito con la proteina di interesse. La configurazione della piastra può essere modificata in base alle esigenze dell'esperimento e al numero di regioni o frammenti di DNA testati. Aggiungere 100 microlitri di acetato di litio TE polietilene glicole per pozzetto e mescolare tre volte mediante pipettaggio.

Coprire la piastra con un sigillo traspirante e incubare a 30 gradi Celsius per 20-30 minuti. Eseguire un trattamento termico a 42 gradi Celsius per esattamente 20 minuti. Dopo il trattamento termico, centrifugare a 1000 × g e a 21 gradi Celsius per 5 minuti.

Utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere il sopranatante. Aggiungere 110 microlitri di TE e mescolare. Centrifugare nuovamente per 5 minuti.

Rimuovere 100 microlitri del soprannatante da ogni pozzetto. Immergere un puncher nell'etanolo al 100%, passarlo alla fiamma, attendere un minuto affinché i perni del puncher si raffreddino, quindi utilizzare il puncher sterile per risospendere il pellet. Trasferire le cellule su piastre agar contenenti SD privo di triptofano e leucina.

Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due giorni. Nel pomeriggio del quinto giorno, recuperare le piastre con i campioni dall'incubatrice. Riempire ogni pozzetto della piastra sterile di miscelazione a fondo rotondo da 96 pozzetti con 50 microlitri di TE. Inumidire preventivamente un punch sterile in TE, prelevare le colonie dalla piastra di selezione SD priva di triptofano e leucina ed emulsionarle nella piastra contenente TE.

Trasferire le colonie su nuove piastre SD prive di triptofano e leucina, per una copertura superficiale ottimale. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 2 giorni. Nel pomeriggio del giorno 7, recuperare le piastre prive di triptofano e leucina dall'incubatore.

Riempire ogni pozzetto di una piastra sterile a 96 pozzetti con fondo rotondo con 50 microlitri di mezzo SD privo di triptofano e leucina. Riempire ogni pozzetto di un blocco sterile a 96 pozzetti profondi con 180 microlitri di mezzo SD privo di triptofano e leucina. Sterilizzare il puncher, inumidire il puncher e il mezzo, quindi trasferire le colonie dalla piastra ai pozzetti contenenti ciascuno 50 microlitri di mezzo.

Trasferire 20 microlitri di lievito nei 180 microlitri di mezzo liquido privo di triptofano e leucina SD. Sigillare la piastra con un sigillo traspirante e incubare a 30 gradi Celsius con agitazione per 36 ore. Al mattino del nono giorno, trasferire 100 microlitri di coltura in 500 microlitri di mezzo YPDA in una piastra sterile da 96 pozzetti profondi.

Coprire con una pellicola traspirante e incubare a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 rpm per tre-cinque ore. Dopo tre-cinque ore, risospendere la coltura e trasferire 125 microlitri da ogni pozzetto in una piastra per spettrofotometro. Misurare la densità ottica a 600 nanometri per verificare che sia compresa tra 0,3 e 0,6.

Centrifugare le cellule rimanenti nel blocco a pozzetti profondi a 3000 × g e 21 °C per 10 minuti. Rimuovere il soprannatante capovolgendo. Aggiungere 200 µL di tampone Z in ogni pozzetto e vortexare.

Centrifugare a 3000 G e 21 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante capovolgendo. Aggiungere 21 microlitri di tampone Z in ogni pozzetto e vortexare.

Coprire la piastra con della pellicola sigillante resistente ai cicli di congelamento e scongelamento. In una cappa chimica, eseguire 4 cicli di congelamento/scongelamento utilizzando azoto liquido e un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius. Aggiungere 200 microlitri di soluzione tampone Z beta-mercaptoetanolo ONPG appena preparata in ogni pozzetto.

Incubare a 30 gradi Celsius per 17-24 ore o fino a sviluppo del colore. Al mattino del giorno 10, verificare lo sviluppo del colore. Aggiungere 110 microlitri di carbonato di sodio uno molare in ogni pozzetto per arrestare la reazione.

Registrare il tempo e vorticare la piastra. Centrifugare a 3000 ×g e 21 °C per dieci minuti. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 125 µL di sopranatante da ogni pozzetto a una piastra per spettrofotometro.

Misurare la densità ottica a 420 nanometri. Calcolare l'attività della beta-galattosidasi in un foglio di calcolo come descritto nel protocollo testuale. In questo studio, la regione del promotore di 2600 paia di basi a monte dell'inizio del sito di inizio della trascrizione è stata suddivisa in sei regioni o frammenti.

Questa foto è un esempio di una piastra ben sviluppata e positiva dopo il quinto giorno del protocollo. In questo risultato rappresentativo, i frammenti di DNA uno e quattro mostrano un'interazione positiva con il complesso delle proteine A e B. Dopo la misurazione dell'attività di beta-galattosidasi, il frammento uno mostra un'induzione quadrupla dell'attività del gene reporter.

È importante ricordare che questa procedura è consigliata per ottenere informazioni su regioni del DNA solo dopo la conferma dell'interazione proteina-proteina proposta e non è stata progettata per fornire informazioni sui siti bersaglio. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi, come il saggio chip e Msar, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, identificare i siti bersaglio in vivo.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare e validare il ruolo di complessi proteici multimerici nell'interazione con una comune sequenza di DNA bersaglio.