Name: Preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Impara a preparare sferoidi 3D co-cultura di cellule tumorali pancreatiche e fibroblasti per valutazione metabolica con analizzatore di flusso extracellulare. Questo metodo riproducibile studia le interazioni metaboliche nel microambiente tumorale.

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Vorremmo ringraziare Samuel Zirbel per assistenza nell'ottimizzazione delle condizioni di coltura e monitoraggio crescita della sferoide. Siamo grati a Agilent technologies per fornire l'analizzatoree96 SeaHorse XF, reagenti e approfondimenti tecnici. Ringraziamo anche Dr. Hemant Kocher Barts Cancer Institute nel Regno Unito per fornire le cellule PS1. Questo lavoro è stato supportato in parte dalla Fondazione Seena Magowitz per la ricerca sul cancro del pancreas e un Stand fino al cancro-cancro ricerca UK-Lustgarten Foundation pancreatico cancro Dream Team Research Grant (Grant numero: SU2C-AACR-DT-20-16). Stand Up To Cancer è un programma della Fondazione di industria di intrattenimento. Borse di ricerca sono amministrati dall'associazione americana per ricerca sul cancro, il partner scientifico di SU2C.

1. cultura del cancro del pancreas sferoidi 3D utilizzando multimateriali magnetico <ol><li>Using standard asettica tessuto cultura tecnica, cultura cellule di interesse in una boccetta di T75 ad una confluenza di 70-80% in media di crescita appropriata. 
	Nota: In genere, 5-7 × 10 6 cellule da una boccetta T75 confluente di 70-80% sono state raccolte. Due tipi differenti delle cellule sono stati utilizzati in questo studio - Patu8902 (le cellule del tumore del pancreas) e PS1 cellule (cellule stellari pancreatiche attivate 21). Entrambe le linee cellulari sono state coltivate in Roswell Park Memorial Institute media 1640 (RPMI-1640) completati con 10% (v/v) fetale bovino serum(FBS), 1 × penicillina-streptomicina (p/s).</li>
	<li>Lavare le cellule una volta con 5 mL di Dulbecco &#39; tampone fosfato s saline(DPBS).</li>
	<li>Cellule di scollegamento da plastica di superficie da trypsinizing con 2 mL di 0.05% tripsina-EDTA per 5-10 min a 37 ° C. Check per distacco cellulare sotto un microscopio.</li>
	<li>Disattiva tripsina da aggiunta di media di crescita di 8 mL per indipendente celle. Evitare sopra trypsinization, in quanto questo può influenzare negativamente la salute/vitalità delle cellule.</li>
	<li>Cellule pipet su e giù per generare una sospensione unicellulare e conteggio delle cellule densità utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro.</li>
	<li>Nel frattempo, portate un flaconcino di NS a temperatura ambiente.</li>
	<li>Calcolare la quantità di cellule necessarie per la semina il numero desiderato di sferoidi (pozzi) e aliquota ad un nuovo tubo conico da 15 mL. Ad esempio, al seme di un intero 96 ben piatto con 5.000 cellule/pozzetto, cellule 5 aliquota almeno 5.5 × 10.</li>
	<li>Raccogliere cellule mediante centrifugazione a 500 x g per 3 min attentamente aspirare o decantare il supernatante e risospendere le cellule ad una concentrazione di 1,0 x 10 6 cellule/mL in media di crescita. Pipettare delicatamente utilizzando un puntale ampia annoiato per evitare di tosatura. Ad esempio, risospendere 5.5 x 10 5 celle in 550 µ l di crescita media.</li>
	<li>Magnetizzare la quantità desiderata di celle utilizzando il NS equilibrato (punto 1.6).
	<ol><li>Direttamente aggiungere NS alla sospensione di cellule in coltura e agitare delicatamente. Per le etichette magnetiche efficiente di celle, utilizzare 10 µ l NS per 100 µ l cellule (risospese a 1 x 10 6 cellule/mL). 
		Nota: Per un tipico esperimento, etichetta 5.5 × 10 5 Patu8902 cells in 550 µ l con 55 µ l NS e 1.1 × 10 6 PS1 in 1100 µ l, (separatamente) con 110 µ l NS.</li>
		<li>Delicatamente Inverti tubo un paio di volte per garantire la sospensione cellulare. Provvedere al trasferimento temporaneo, il mix di cella-NS in un unico pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Farlo separatamente per ogni tipo di cellula di essere magnetizzato. Piastra di copertura e incubare le cellule a temperatura ambiente per 2 h con agitazione delicata per consentire l'associazione di NS alla superficie delle cellule. 
		Nota: Cultura e dosaggio di sferoidi a partire sia da Patu8902 o PS1 celle da solo, oltre a sferoidi di co-coltura a partire con entrambi tipi premiscelati prima stampa su dischi magnetici con successo è stato ottenuto utilizzando questo metodo in indipendente delle cellule esperimenti. Un metodo per la generazione di sferoidi di co-coltura dalle cellule Patu8902 e PS2 è descritto di seguito nei passaggi successivi.</li>
	</ol></li> <li>Pipet su e giù per le cellule magnetizzate delicatamente per mescolare in modo uniforme e preparare un mix master contenente il numero di cella desiderata. Per il seeding sferoidi, utilizzare un totale di 15.000 celle (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) e regolare per un volume totale di 150 µ l per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. 
	Nota: Il volume finale erogato in ogni pozzetto deve essere lo stesso indipendentemente dal numero di celle utilizzate.</li>
	<li>Mettere una piastra a 96 pozzetti cella repellente in cima l'unità sferoide magnetico 96 pozzetti e dispensare 150 µ l di mix di celle in ogni pozzetto. Osservare le cellule lentamente raccogliere al centro del pozzo sopra il magnete. Coprire e incubare la piastra durante la notte in un incubatore a CO 2 5% impostato a 37 ° C con il disco magnetico sferoide ancora collegato. Rimuovere il disco magnetico e incubare per un'ulteriore crescita fino a 7 giorni. 
	Nota: È fondamentale usare cartilagini di accrescimento delle cellule repellente per la stampa di sferoide utilizzando unità magnetica sferoide. Assicurarsi che venga utilizzato l'unità sferoide con magneti più piccoli più sottile, non l'unità di detenzione.</li>
	<li>Monitorare la crescita di sferoidi ogni giorno. Ricostituire con media crescita fresco ogni tre giorni inserendo la piastra di crescita montata sul magnetico che tiene in auto ad un angolo e utilizzando una pipetta multicanale per disegnare fuori esaurito media. 
	Nota: Patu8902 e PS1 cellule co-seminate ad 15.000 cellule/pozzetto cresceranno in 3D sferoidi con un diametro di 400-600 µm entro 5-7 giorni. A questo punto sono pronti per caratterizzazione metabolica, valutazione di droga e altre applicazioni a valle sferoidi.</li>
</ol> 2. Analisi metabolica di sferoidi di tumore pancreatico 3D per le vie di bioenergetica utilizzando l'analizzatore Flux extracellulare Nota: In questa sezione, l'analisi delle funzioni metaboliche di sferoidi utilizzando un flusso extracellulare analizzatore con dosaggio micropiastre specificamente progettate per 3D sferoidi è descritta.
<ol><li>Lavaggio e trasferimento di sferoidi da placche di crescita a sferoide dosaggio micropiastre. 
	Nota: Sferoidi possono essere utilizzati per analisi metaboliche quando raggiungono un diametro di ~ 500 µm.
	<ol><li>Il giorno prima dell'esecuzione del saggio, idratare la cartuccia sensore o sonda con dosaggio calibratore (200 µ l/pozzetto) nella piastra di utilità fornito e incubare pernottamento (4-18 h) in un incubatore (non-CO 2) fissato a 37 ° C.</li>
		<li>Preparare medium di analisi appropriato per il dosaggio desiderato metabolico integrando il supporto di base (vedere la tabella materiali) o dosaggio di 2 mM L-Glutammina per test di stress di glicolisi (GST) o con piruvato di 1 mM, 2 mM L-Glutammina e 10 mM glucosio per un l'analisi mitocondriale stress test (MST). 
		Nota: L'analizzatore di flusso extracellulare misura sia la respirazione mitocondriale (OCR) e glicolisi (ECAR) di cellule vive in un formato di piastra a 96 pozzetti. Questi tassi di fornire una panoramica della funzione metabolica cellulare nei campioni in esame. Consultare il manuale nei corredi di analisi per istruzioni dettagliate.</li>
		<li>Dopo l'aggiunta di dosaggio integratori specifici (si veda il punto 2.1.1), scaldare il medium di analisi completati in bagnomaria a 37 ° C e regolare il pH a 7,4 ± 0,1 con 0.1N NaOH. Mantenere il mezzo caldo fino all'uso.</li>
		<li>Ricostituire dosaggio reagenti del kit a medio dosaggio calibrato e consigliate concentrazioni stock. 
		Nota: Questi sono fatti a 10 × la concentrazione finale desiderata nei pozzetti. Le concentrazioni d'archivio per glucosio, oligomycin e 2-deossi-glucosio (2DG) sono 100, 100 µM e 500 mM, rispettivamente.</li>
		<li>Osservare sferoidi nella piastra di crescita sotto una luce microscopio per controllare per morfologia sferoide e uniformità generale; in termini di forma e strutturae di sferoidi.</li>
		<li>Trasferire la piastra di crescita su un disco magnetico della holding e aspirare accuratamente supporti di crescita di ~ 120 µ l. Delicatamente lavare sferoidi con ~ 120 µ l di media analisi riscaldato e pre-calibrato, aspirare e ripetere il lavaggio due volte. Ispezionare le sferoidi sotto il microscopio nuovamente per garantire che non sono mondati sferoidi.</li>
		<li>Preparare la micropiastra dosaggio sferoide aggiungendo media di dosaggio caldo 180 µ l a ciascun pozzetto.</li>
		<li>Impostare una micropipetta P20 a 10 µ l e forma una punta larga annoiata ad esso. Se largo annoiati suggerimenti non sono disponibili, tagliare le punte dei puntali regolari con un pulito forbici o bisturi per allargare il foro. 
		Nota: Questo dovrebbe ridurre tosatura e preservare la morfologia complessiva di sferoidi durante il trasferimento per dosaggio piastre.</li>
		<li>Utilizzare una superficie calda (37 ° C) di effettuare trasferimento di sferoidi. Utilizzare una superficie di Visualizzatore pellicola di raggi x scaldata con una lampada a luce bianca per migliorare il contrasto e visualizzazione di sferoidi durante il processo di trasferimento di aiuti.</li>
		<li>Attentamente aspirato un singolo pre-lavato sferoide dalla piastra di crescita cellulare repellente utilizzando una micropipetta P20 dotato di un ampio foro punta e delicatamente sferoide di trasferimento direttamente nel centro di ciascun pozzetto di una piastra di dosaggio sferoide per svolgere il metabolico test. Consentire ogni sferoide dolcemente cadere in micro-camera centrale di ciascun pozzetto per gravità pura per popolare la piastra dosaggio. 
		Nota: Richiede solitamente 5-8 s per ogni sferoide a cadere verso il centro del pozzo di gravità. Non estrarre la pipetta fino a quando le sferoidi si sono stabiliti nella micro-camera. Fare non il deposito sferoidi nei pozzetti della piastra assay (A1, A12, H1, H12) poiché questi 4 angolo verrà utilizzato come pozzi sfondo.</li>
		<li>Monitorare la morfologia e la posizione di ogni sferoide per garantire che ogni sferoide è al centro di ciascun pozzetto. Se necessario, riposiziona al centro del pozzo aspirando fuori sferoide utilizzando un ampio foro puntale e successiva deposizione dalla forza di gravità.</li>
		<li>Una volta che sono stati trasferiti tutti gli sferoidi, posizionare la piastra di dosaggio in un incubatore a 37 ° C aria umidificata (non-CO 2) per prima un'ora del test.</li>
	</ol></li> <li>Cartuccia sensore con composti e dell'eseguimento del test di carico <ol><li>preparare 10 × concentrato specifici reagenti nei media specifico dosaggio descritto al punto 2.1.2. Ad esempio, per eseguire GST, ricostituire il glucosio, oligomycin e 2-DG in volumi consigliati cui il manuale di analisi. Analisi GST e di MST sono state effettuate utilizzando Patu8902-PS1 sferoidi.</li>
		<li>Correttamente orientare la cartuccia sensore con righe etichettate A-H sul lato sinistro e posizionare una guida di caricamento sopra la cartuccia sensore. Garantire il corretto caricamento della porta desiderata orientando la Guida di carico affinché la lettera corrispondente alla porta per essere caricato è all'angolo superiore sinistro.</li>
		<li>Usando una pipetta multicanale, dispensare i reagenti direttamente nei porti di iniezione. Tenere carico guide in posizione utilizzando la punta delle dita durante l'intera procedura. 
		Nota: Ciascun reagente verrà iniettato in una porta consigliata di cui il manuale di analisi. Evitare la creazione di bolle d'aria, ma non toccare qualsiasi parte della cartuccia per rimuovere le bolle d'aria.</li>
		<li>Rimuovere caricamento Guida e posizione al livello degli occhi con cartuccia per ispezionare visivamente porte di iniezione per il caricamento anche.</li>
		<li>Creare il protocollo di design/strumento di analisi sperimentale utilizzando il controller di strumento software Wave (d'ora in poi, software di analisi), come descritto nella sezione 2.3.</li>
	</ol></li> <li>Analisi progettazione e l'esecuzione utilizzando il software di analisi <ol><li>Crea un modello di analisi per l'esperimento <ol><li>aprire il software di analisi e fare clic su &#34; modelli &#34; o scegliere da un test esistente modello. Fare doppio clic su &#34; modello vuoto &#34;.</li>
			<li>Definire gruppi sperimentali e condizioni.
			<ol><li>Strategie di iniezione di definire per le porte A, B e C. lasciare vuoto di porta D. 
				Nota: Per l'analisi di GST, solo queste porte verranno caricate con glucosio, Oligomycin e 2-DG. In caso di analisi di MST, verrà caricati oligomycin, FCCP e rotenone.</li>
				<li>Pre-trattamenti definire se sferoidi sono stati trattati con uno o più composti di prova e il gruppo di controllo. Definire il supporto di analisi per includere la sorgente, supplementi e altre informazioni.</li>
				<li>Definire uno o più celle tipo (ad es. Patu8902, PS1) vedendo le informazioni sul numeri di densità e passaggio.</li>
			</ol></li> <li>Clic &#34; generare gruppi di &#34;.</li>
			<li>Clic &#34; piastra mappa &#34; scheda e assegnare gruppi alla piastra dosaggio corrispondente al disegno sperimentale.</li>
			<li>Selezionare i pozzi di quattro angoli come pozzi di sfondo. Assicurarsi che non siano nessun sferoidi in questi pozzetti.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Eseguire analisi sull'analizzatore <ol><li>scegliere la scheda protocollo strumento mantenere l'impostazione predefinita i comandi del protocollo controllando &#34; Calibra &#34;, &#34; equilibrato &#34; e &#34; ciclo di misurazione Baseline &#34;.</li>
		<li>Clic &#34; iniezioni &#34; e definire composto per ogni porta. Modificare i cicli di misura a 6 cicli dal valore predefinito 3 cicli per sferoidi. Mantenere l'impostazione predefinita 3 min mix, 0 min attesa e volte misura 3 min. 
		Nota: Orario di mix-attesa-misura predefinito è 0 min, 3 min, 3 min, rispettivamente. Tre tasso basale misurazioni vengono effettuate in genere prima dell'iniezione del primo dosaggio di composto. Queste misurazioni possono essere calibrate e riadattate come per il disegno sperimentale.</li>
		<li>Revisione protocollo e gruppo sintesi.</li>
		<li>Salva modello struttura test.</li>
		<li>Procedere alla calibrazione del pre-dosaggio una volta porti di iniezione sono state caricate con substrati di dosaggio. Trasferire la cartuccia con la piastra di utilità per l'analizzatore di flusso extracellulare. 
		Nota: Questo di solito viene completata entro 15-20 min e calibra i sensori per eseguire misurazioni di OCR ed ECAR.</li>
		<li>Dopo la taratura della cartuccia, riposizionare la piastra di utilità con la piastra di test pre-riscaldato contenente 3D sferoidi e avviare il test. Dopo aver completate le misurazioni, è possibile esportare i dati in fogli di calcolo o software grafico e statistico per analizzare i dati.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+models%3A+Novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies.</a> J Cell Commun Signal. 5 (3), 239-248 (2011).</li>
<li>Ware, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+in+vitro+3D+PDAC+stroma+rich+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model.</a> Biomaterials. 108, 129-142 (2016).</li>
<li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Beyond the Petri dish.</a> Nat Biotechnol. 22 (2), 151-152 (2004).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, New York, N.Y. November 1708-1712 (2001).</li>
<li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer.</a> Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+carboxylation+supports+redox+homeostasis+during+anchorage-independent+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth.</a> Nature. 532 (7598), 255-258 (2016).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Tissue+Morphogenesis+and+Cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Souza, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+based+on+magnetic+cell+levitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation.</a> Nat Nanotech. 5 (4), 291-296 (2010).</li>
<li>Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culturing+by+magnetic+levitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1940-1949 (2013).</li>
<li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spheroid+toxicity+assay+using+magnetic+3D+bioprinting+and+real-time+mobile+device-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging.</a> Sci Rep. 5, 13987(2015).</li>
<li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.promega.com/resources/pubhub/bioprinting-3d-cell-cultures/">Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures</a>. , Promega Corporation. Updated (Figure 1) 1-9 (2015).</li>
<li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+a+three-dimensional+multitype+bronchiole+coculture+model+using+magnetic+levitation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19 (9), 665-675 (2013).</li>
<li>Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+engineering+in+three-dimensional+levitation+tissue+culture+system+based+on+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles.</a> Tissue Eng Part C, Methods. 19 (5), 336-344 (2013).</li>
<li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+co-culture+model+of+the+aortic+valve+using+magnetic+levitation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomat%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation.</a> Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).</li>
<li>Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Acute+Extracellular+Flux+%28XF%29+Assay+to+Assess+Compound+Effects+on+Mitochondrial+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screening%22%5BJournal%5D)">The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function.</a> J Biomol Screening. 20 (3), 422-429 (2015).</li>
<li>Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profile+analysis+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Metabolic profile analysis of zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (71), e4300(2013).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> J Vis Exp. (106), e53464(2015).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+Protocol+to+Analyze+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (117), e54918(2016).</li>
<li>Froeling, F. E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+model+of+pancreatic+cancer+demonstrates+that+stromal+cells+modulate+E-cadherin%2C+beta-catenin%2C+and+Ezrin+expression+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells.</a> Am J Pathol. 175 (2), 636-648 (2009).</li>
<li>Kim, J. W., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer%27s+molecular+sweet+tooth+and+the+warburg+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer's molecular sweet tooth and the warburg effect.</a> Cancer Res. 66 (18), 8927-8930 (2006).</li>
<li>Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curbing+cancer%27s+sweet+tooth%3A+Is+there+a+role+for+MnSOD+in+regulation+of+the+Warburg+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Curbing cancer's sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect.</a> Mitochondrion. 13 (3), 170-188 (2013).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21387/full">Cancer statistics, 2017.</a> CA: Cancer J Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
</ol>

Gli autori George W. Rogers e Andrew Neilson sono dipendenti/azionisti di Agilent Technologies che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Utilizzo di cancro del pancreas, la 3rd principale causa di cancro decessi negli Stati Uniti24, come esempio e modello, un metodo rapido e coerenza è stato sviluppato per crescere e analisi 3D sferoidi utilizzando il co-coltura delle cellule di cancro del pancreas e attivato fibroblasti del pancreas. Utilizzando magnetico multimateriali, sferoidi che variano nel formato da 400-600 µm di diametro sono stati ottenuti. Questi sono stati sottoposti a test metabolici per verificare correttamente la funzionalità di sferoidi 3D coltivate. Questo metodo è semplice, coerente e può essere facilmente adattato ad altri tipi di cella.
Mentre questa metodologia accelererà e aggiungere il valore traslazionale delle analisi eseguite con sferoidi 3D, può essere migliorata attraverso lo sviluppo di tecniche che consentono il multiplexing di manipolazione della sferoide e movimentazione. Questo dovrebbe ridurre ulteriormente la complessiva tempo, costo e la manodopera necessaria per svolgere il test. Inoltre, volumi sferoide possono essere utilizzati per normalizzare i segnali di OCR come riportato da altri6. Volume della sferoide normalizzati dal volume medio di una cella potrebbe essere utilizzato per determinare OCR per la cellula, ma dal momento che la crescita di sferoidi non saranno identico, calcolando un assoluto OCR per cella potrebbe essere difficile. Attualmente, questa metodologia è limitata dalla mancanza di uno strumento efficace per multiplex sferoide movimentazione e trasferimento da placche di crescita ambiente di test.
Il metodo descritto è modificato e adattato dalla tecnologia magnetica multimateriali e ulteriormente convalidato per mostrare la rilevanza funzionale applicando le sferoidi coltivate a un'analisi metabolica a valle. Il metodo fornisce un importante strumento per generare sferoidi robusti, praticabile e funzionale che contengono i due tipi principali delle cellule trovati nella maggior parte dei tessuti del tumore, le cellule tumorali e fibroblasti di cancro associato, che possono essere impiegati per altri saggi in fase di sperimentazione, ad esempio gli schermi della droga. La relativa facilità e l'efficienza della metodologia NS è un miglioramento importante sopra altri metodi25, come l'impiccagione drop metodo2,26 di generazione sferoide.
Sferoidi robusti generati come tali forniscono un in vitro del tumore modello che include cellule stromali, che spesso mancano da molti studi di cultura 3D. Le possibilità di applicazione dei modelli 3D sferoide creati come tali sono molto vaste. Ad esempio, tali modelli possono essere impiegati per studiare le interazioni cellula-cellula, turni di bioenergetica e di testare la suscettibilità genetica e dipendenza dei vari regimi terapeutici. Sferoidi 3D che ricapitolano il microambiente tumorale in vivo servono come strumento altamente pertinente e utili per gli studi e quelli indagando i meccanismi di azione di terapeutica corrente e romanzo di screening di stupefacenti. Analisi metaboliche sondaggio vie energetiche utilizzando sferoidi culture con cellule mutanti possono contribuire a gettare nuova luce sul ruolo di questi geni e vie relative nel pathobiology in un modello 3D rilevante di cancro, come sferoidi descritti in questo studio.
La riuscita applicazione di questo metodo si basa innanzitutto sulla salute delle cellule necessarie per la stampa magnetica, motivo per cui cella crescendo in fase logaritmica dovrebbe essere raccolte e magnetizzato. È fondamentale utilizzare l'unità magnetica sferoide per stampare celle magnetizzate e non l'unità di holding, che dovrebbe essere utilizzato solo durante il lavaggio della sferoide e media replenishing passaggi del metodo descritto. L'altro aspetto più critico per il successo della lettura di saggi metabolici è mantenere la morfologia di sferoidi durante il processo di trasferimento dalla piastra di crescita per la piastra di dosaggio.
Nel complesso, questo protocollo è stato stabilito per la generazione di sferoidi 3D che contengono sia cancro e cellule stromali, dopo successivi test metabolici di sferoidi utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare. Le caratteristiche principali di questo metodo sono che è rapido, facilmente adattabile e coerenti, pertinenti e imita il microambiente tumorale in vivo , è relativamente poco costoso e può servire come un nuovo strumento per studiare la biologia del tumore e lo sviluppo di anticancro agenti.

Nell'ultimo decennio, sono stati sviluppati numerosi modelli 3D in vitro per ricapitolare e per studiare in vivo del tumore biologia, microambiente e crescita condizioni di cancro cellule1,2. Coltura sistemi con un'esposizione uniforme agli fattori biochimici e composti in fase di sperimentazione non riescono a replicare le interazioni tumore-stroma 3D native esposte a una sfumatura di composti attraverso l'extracellulare di cellule dello strato monomolecolare di bidimensionale (2D) matrice proteine (ECM)3,4. Così, rispetto ai modelli 2D coltura tissutale, cancro 3D modelli sono emerso per mostrare meglio il potenziale a simulare il microambiente tumorale e servito come strumenti importanti per meglio comprendere in vivo le caratteristiche del tumore, quali ipossia, il desmoplasia, dormienza, penetranza di droga, tossicità e resistenza terapeutica5,6. A tal fine, modelli 3D hanno il potenziale di colmare il divario tra coltura cellulare 2D e modelli animale intero imitando in vivo caratteristiche del tumore, pur essendo relativamente poco costoso e ottimizzato per la generazione rapida e coerenza. Questi vantaggi vengono sfruttati per accelerare la ricerca traslazionale in molti settori tra cui biologia del cancro, morfogenesi e7,8di ingegneria tissutale.
In un impeto di evoluzione di metodi di coltura del tessuto 3D, tecniche di levitazione magnetica hanno recentemente sviluppati e descritti per la crescita, analizzante e imaging di sferoidi derivati da varie cellule tipi9,10, 11 , 12. magnetico 3D multimateriali sfrutta l'uso di forze magnetiche di ingegnere tessuti da cellule con nanoparticelle biocompatibile di magnetizzazione e stamparle in formati multi-pozzetto. Questo consente la rapida produzione di coerente, vicino identici sferoidi 3D, che possono essere sfruttate e utilizzate per una pletora di applicazioni a valle per indagini biochimiche e biofisiche10. Qui abbiamo adattato la tecnica multimateriali magnetica utilizzando un materiale biocompatibile chiamato Nanoshuttle (NS) è composta da ossido di ferro, poli L-lisina e oro nano particelle per etichettare i fibroblasti e le cellule di cancro del pancreas. NS attribuisce elettrostaticamente alla membrana del plasma, non è noto da associare a qualsiasi specifici recettori, e uscite fuori la cella in superficie entro una settimana. Richiede forze magnetiche molto basse (30pN), abbastanza per aggregato, ma non danno delle cellule e non influisce l'attuabilità delle cellule, il metabolismo o proliferazione per renderlo estremamente biocompatibile per culture 3D10,13,14 ,15.
In questo studio, utilizzando il cancro del pancreas come esempio e modello, descriviamo la generazione e l'analisi metabolica di sferoidi cellulare-fibroblasto cancro 3D. A partire da cellule coltivate in vasi 2D, illustriamo le condizioni di cultura e di crescita di sferoidi di co-coltura di tumore pancreatico-fibroblasto utilizzando multimateriali magnetico. Sferoidi coltivate sono stati poi utilizzati in analisi metaboliche funzionali utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare, una tecnologia dimostrato misurare simultaneamente i due percorsi di produzione energetici principali, la glicolisi e la respirazione mitocondriale, in una varietà di live cellule e tessuti16,17,18,19,20. La glicolisi è stata misurata come una variazione nel tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), mentre la respirazione mitocondriale o fosforilazione ossidativa è stata misurata come tasso di consumo di ossigeno (OCR). Proponiamo che questo metodo sviluppato per sferoidi di tumore pancreatico può servire come una dorsale per ottimizzazione e traduzione 3D tumore sferoide generazione e analisi di altri tipi di tessuto e delle cellule.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina EDTA</td><td>Sigma</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti piastra repellente per cellule</td><td>USA Scientific / Griener Bio-One</td><td>655970</td><td>piastra di crescita sferoidale</td></tr><tr><td>Cellometria Vetrini per conteggio cellulare</td><td>Nexcelom&nbsp;</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Kit per test da sforzo di glicolisi</td><td>Agilent Technologies</td><td>103020-100</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma</td><td>59202C</td><td></td></tr><tr><td>Mitocondriale Kit per test da sforzo</td><td>Agilent Technologies</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>n3D Unità di sferoide magnetica</td><td>Nano3D Bioscience</td><td>655841</td><td>Parte di Spheroid Bioprinting Kit</td></tr><tr><td>n3D Unità di tenuta per sferoidi magnetici</td><td>Nano3D Bioscience</td><td>655841</td><td>Parte di Spheroid Bioprinting Kit</td></tr><tr><td>n3D NanoShuttle-PL&nbsp;</td><td>Nano3D Bioscience</td><td>655841</td><td>parte di Spheroid Bioprinting Kit:&nbsp; memorizza a 4 &deg; Cellule C</td></tr><tr><td>Patu8902</td> Cellule di <td>adenocarcinoma duttale pancreatico</td>Stock da <td>laboratorio</td><td></td></tr><tr><td>Cellule PS1</td><td>Cellule stellate pancreatiche attivate</td><td>Stock</td><td></td> da laboratorio</tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>terreni di crescita per cellule, sferoidi</td></tr><tr><td>SeaHorse XFe96 analizzatore di flusso extracellulare</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>analizzatore di flusso extracellulare</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>XF Terreni di base</td><td>Agilent Technologies</td><td>102365-100</td><td>terreni di base per saggi metabolici su XFe96</td></tr></tbody></table>

preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Molti tipi di cancro, tra cui il cancro del pancreas, hanno uno stroma fibrotico denso che svolge un ruolo importante nella progressione del tumore e l'invasione. Fibroblasti attivati cancro associato sono una componente fondamentale dello stroma del tumore che interagiscono con le cellule tumorali e sostenere la loro crescita e sopravvivenza. Modelli che ricapitolano l'interazione delle cellule tumorali e attivato fibroblasti sono strumenti importanti per studiare la biologia stromal e per lo sviluppo di agenti antitumorali. Qui, un metodo è descritto per la generazione rapida di co-coltura robusto sferoide 3-dimensionale (3D) delle cellule del tumore pancreatico e fibroblasti attivati del pancreas che possono essere utilizzati per successivi studi biologici. Inoltre, descritto è l'uso di sferoidi 3D nello svolgimento delle analisi funzionali metaboliche per sondare le vie di bioenergetica cellulare utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare accoppiato con una micropiastra sferoide. Le cellule di cancro del pancreas (Patu8902) e le cellule del fibroblasto pancreatici attivati (PS1) sono state co-coltivate e magnetizzato utilizzando un assembly di nanoparticella biocompatibile. Magnetizzato cellule erano rapidamente bioprinted utilizzando unità magnetiche in un formato ben 96, in crescita media per generare sferoidi con un diametro che varia tra i 400-600 µm entro 5-7 giorni di cultura. Analisi metaboliche funzionali utilizzando Patu8902-PS1 sferoidi poi venivano realizzate utilizzando la tecnologia di flusso extracellulare per sonda vie energetiche cellulari. Il metodo qui è semplice, permette la generazione costante di cancro cellula-fibroblasto sferoide co-colture e può essere potenzialmente adattato per altri tipi di cellule di cancro all'ottimizzazione della metodologia descritta corrente.

Il flusso di lavoro generale per l'analisi di flusso extracellulare di sferoidi 3D e multimateriali magnetico 
Figura 1 illustra una panoramica dell'intero processo descritto in questo protocollo. Le cellule di cancro del pancreas (Patu8902) e le cellule stellate attivate (PS1) sono state coltivate in coltura tissutale recipienti contenenti la media di crescita appropriata a una confluenza di 70-80%. Le cellule sono state distaccate dalla nave di cultura 2D e lavato, densità delle cellule è stata determinata e cellule infine risospese nel media di crescita presso 1 × 106 cellule/mL. NS, un assembly di nanoparticella costituito da oro, ossido di ferro e poli-L-lisina è stato utilizzato per magnetizzare le cellule. Cellule Patu8902 e PS1 individualmente magnetizzate erano poi mescolate e stampate sulla crescita cellulare repellente 96 pozzetti piastre montate su un disco magnetico sferoide. Abbiamo ottimizzato i 15.000 per essere il numero totale di cellule per il seeding di un singolo pozzo (5.000 Patu8902 cellule miscelati con 10.000 PS1 cellule per generare un singolo sferoide). Dopo incubazione in condizioni di coltura del tessuto appropriato per 5-7 giorni, 3-dimensionale sferoidi sono stati ottenuti, durante i quali la crescita di questi sferoidi era monitorata e registrata. Dopo il lavaggio con media di dosaggio, sferoidi erano fisicamente trasferiti su una micropiastra sferoide di svolgere analisi metaboliche utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare per la misura simultanea di glicolisi e respirazione mitocondriale.
Cultura e crescita di sferoidi di tumore pancreatico-fibroblasto Per ottenere sferoidi funzionale e robusti, la cellula tumorale epiteliale linea Patu8902 e attivato le cellule stellate PS1 sono state coltivate in RPMI-1640 completati con siero fetale bovino. Pat8902 e cellule di PS1 magnetizzate con NS erano poi mescolate in un rapporto di 1:2, in modo da un totale di 15.000 cellule per pozzetto di una piastra di crescita del seme. All'interno di 24 h di stampa le celle sui dischi magnetici, cellule focalizzato al centro del pozzo esattamente sulla cima di ogni perno magnetico sotto ciascun pozzetto. Crescita di sferoidi Patu8902-PS1 è stata monitorata da formazione immagine nei giorni 2, 4, 7 e 9 dopo la semina di cellule. La figura 2 Mostra la quantificazione del diametro medio di sferoidi rappresentativi a vari intervalli di tempo sopra. Il diametro di sferoidi aumenta da 414 µm giorno 2 a 596 µm il giorno 7 post stampa. Non c'era differenza significativa tra la crescita nei giorni 7 e 9, e così tutti gli altri la sperimentazione era limitata a 7 giorni di crescita della sferoide. Abbiamo notato che le sferoidi acquisiscono una morfologia più nitida soprattutto intorno ai bordi esterni e il NS è progressivamente più uniformemente diffusa in tutto il volume della sferoide con più giorni nella cultura. Inoltre abbiamo stimato la sfericità della 10 sferoidi in base alla lunghezza del loro assi maggiore e minore. La sfericità medio è 0.92 ± 0,04 per Patu8902 da solo (tumore), 0.95 ± 0,04 per PS1 (stromali) da solo e 0.94 ± 0.02 per sferoidi di co-coltura.
Analisi funzionale metabolica del pancreas sferoidi 3D utilizzando il analizzatore di flusso extracellulare Per verificare la funzionalità di sferoidi, abbiamo impiegato metabolica e analisi bioenergetica per sondare le vie energetiche in sferoidi. Abbiamo effettuato un test di stress di glicolisi su sferoidi coltivate come descritto sopra. A tal fine, sferoidi generati dalle cellule Patu8902 o PS1 oltre a quelli derivanti da una co-coltura delle due tipi cellulari sono stati sottoposti a test. Interessante, tutti i tre tipi di sferoidi, se che proviene dalle cellule distinte o miste, hanno esibito una risposta biologicamente funzionale per il dosaggio di GST. Al momento di iniettare una saturante concentrazione di glucosio, i tipi di sferoidi testati Visualizza aumenti nella via glicolitica, come evidenziato da un aumento in ECAR (Figura 3). Quando, produzione mitocondriale di ATP è stata inibita utilizzando oligomycin, produzione di energia si sposta verso la glicolisi e spinto le cellule alla massima capacità glicolitica, vista come ulteriore aumento ECAR. Inibizione della glicolisi utilizzando 2-DG, un glucosio analogico che lega competitivamente glucosio esochinasi, ha provocato una diminuzione in ECAR, confermando che il precedente aumento ECAR è stato a causa di attività glicolitica. Abbiamo notato che le sferoidi testati in questo studio ha risposto in questo modo, anche se la PS1 solo sferoidi (diametro medio 250 µm) avevano un segnale relativamente inferiore, probabilmente a causa della loro dimensione più piccola e bassa capacità glicolitica rispetto al cancro Patu8902 cellule (diametro medio 600 µm). In generale, una maggiore ECAR segnale dalla cellula del tumore derivata sferoidi rispetto a quelli da relativamente più piccolo del fibroblasto PS1 derivato sferoidi, potrebbe probabilmente essere attribuita a inclinazione di metabolica intrinseca delle cellule tumorali verso glicolisi22, 23. Tutti i tre tipi di sferoidi sono stati derivati dalla semina lo stesso numero di cellule, anche se abbiamo notato che la variazione della dimensione della sferoide fra ogni tipo, con PS1 solo sferoidi essendo il più piccolo, seguita da sferoidi di co-coltura, e Patu8902 da sola sferoidi essendo il più grande.
Per verificare la funzione mitocondriale in sferoidi 3D, abbiamo sottoposto sferoidi di co-coltura ad un dosaggio di MST. Il MST misura parametri chiave della funzione mitocondriale misurando direttamente OCR delle cellule (Figura 4A e 4B). Un'iniezione seriale con composti (oligomycin, FCCP e un mix di rotenone e antimycin A) serviva a misurare parametri chiave mitocondriali quali, produzione ATP, massima respirazione e la respirazione non mitocondriale. Questi parametri e tassi di respirazione basale sono stati ulteriormente utilizzati per calcolare la perdita di protone e ricambio capacità respiratoria (Figura 4). Una diminuzione in OCR in risposta a oligomycin, un inibitore del trifosfato di adenosina synthase (complesso V) è correlato alla respirazione mitocondriale associata con produzione di ATP cellulare. Sferoidi sono state incubate con oligomycin per una durata più lunga consentire la massima penetrazione e tempo di risposta efficiente. Una seconda iniezione con il disaccoppiante FCCP stimola il massimo consumo di ossigeno e un corrispondente incremento di OCR. L'OCR FCCP-stimolato è stato utilizzato per calcolare ricambio capacità respiratoria, una misura della capacità della cellula di rispondere alla domanda di maggiore energia. La terza iniezione; un mix di rotenone, (un complesso ho inibitore) e antimycin A (un inibitore del complesso III) blocca la respirazione mitocondriale, vista come una forte diminuzione in OCR (Figura 4BONG &gt;).
Nel complesso, le nostre osservazioni confermano la funzionalità di sferoidi coltivate utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare come una misura della loro impronta/attività metabolica sia in termini di potenziale glicolitico e mitocondriale come descritto sopra.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig1.jpg"> 
Figura 1 . Rappresentazione schematica della metodologia per la cultura e il dosaggio di sferoidi di cancro pancreatico cellule/del fibroblasto. Patu8902 e PS1cells sono state coltivate, tripsinizzate, lavate e contati. Per la semina ogni sferoide, Patu8902 (5.000 cellule/pozzetto) e fibroblasti PS1 (10.000 cellule/pozzetto) erano magnetizzati utilizzando NS e stampato su una piastra di crescita cellulare repellente il giorno 1. Dopo la semina, la piastra di crescita era montata su un disco magnetico sferoide (con un magnete sotto ciascun pozzetto della piastra di crescita 96 ben formato) e permise alla cultura per 2-7 giorni ottenere 3D sferoidi. Sferoidi risultante sono stati lavati e trasferiti al sferoide dosaggio micropiastre per svolgere le analisi metaboliche sullo strumento flusso extracellulare. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig2.jpg"> 
Figura 2 . Crescita di sferoidi di tumore pancreatico-fibroblasto. (A) un'immagine rappresentativa della sferoide di co-coltura Patu8902-PS1 corrispondente al giorno nella cultura è mostrata in alto a sinistra e le dimensioni di diametro di sferoide (µm) sono quantificata di sotto. Progressivo aumento nel formato della sferoide e diffusione di particelle di NS (puntini scuri) in tutto il suo volume è evidente tra 2 e 7 giorni. Sferoidi erano tenute in coltura per altri 2 giorni dopo questo, che non ha provocato un aumento significativo di diametro sferoide. (B) rappresentante immagini di sferoidi derivati dalle cellule del tumore (Patu8902), le cellule dello stroma (PS1) e cellule co-coltivate (Patu8902 + PS1) è mostrato. Dati (C) sfericità sono raffigurati da 10 sferoidi individuali da ogni gruppo. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig3.jpg"> 
Figura 3 . Glicolisi Stress Test (GST) con pancreatici sferoidi. (A) schematica rappresentazione di un'analisi della funzione tipica glicolitico con vari parametri di dosaggio raffigurato. (B) un esempio di un test di GST eseguita su sferoidi pancreatiche coltivate utilizzando la metodologia descritta. Rampa di iniezione di glucosio su glicolisi visto come un aumento di ECAR, con ulteriore aumento su aggiunta di oligomycin per spegnere la respirazione mitocondriale. ECAR cade in risposta a 2-DG, un analogo competitivo di glucosio, bloccando la glicolisi. Tutti gli sferoidi sono notati per esibire una risposta funzionale per il dosaggio di GST. (C) un'uscita del dosaggio GST utilizzando il generatore di report del produttore raffigurante i tre parametri principali del dosaggio GST. Barre di errore rappresentano errore standard della media (SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56081/56081fig4.jpg"> 
Nella figura 4. Mitocondriale Stress Test (MST) con Patu8902-PS1 sferoidi. (A) schematica rappresentazione di un'analisi della funzione mitocondriale tipica con vari parametri di dosaggio è raffigurato. (B) un esempio di una MST su sferoidi tumore pancreatico-fibroblasto è mostrato. Sferoidi 3D (C) co-coltura esibiscono una risposta funzionale per il dosaggio di MST. Come previsto, la funzione mitocondriale misurata come un declino in OCR è stata notata quando sferoidi sono stati sfidati con oligomycin, un inibitore di ATP sintasi. Usando FCCP per accelerare il flusso di elettroni provocato maximal OCR, che immediatamente crollato all'inibizione della respirazione mitocondriale usando un - cocktail di inibitori del complesso mitocondriali. Barre di errore rappresentano errore standard della media (SEM). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56081/56081fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui, un metodo è descritto per la preparazione di co-coltura 3-dimensionale della sferoide (3D) delle cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti, seguiti dalla misura delle funzioni metaboliche utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di coltivare in co-coltura sferoidi tridimensionali tumorali e stro-mali ottenuti da cellule di cancro del pancreas e fibroblasti, al fine di valutarne il metabolismo mediante un analizzatore del flusso extracellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande riguardo gli effetti del microambiente tumorale sul metabolismo cellulare e sulla sensibilità ai farmaci. I principali vantaggi di queste tecniche sono la rapidità, la relativa semplicità, l'elevata riproducibilità e la facilità con cui possono essere adattate ad altri casi di alleati cellulari.La procedura sarà dimostrata da Pawan Noel e Ruben Munoz. Utilizzando tecniche standard di coltura cellulare asettica, coltivare le cellule tumorali e i fibroblasti di interesse in fiaschi T75 nel mezzo di crescita appropriato. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 70% al 80%, lavare le colture una volta con cinque millilitri di PBS e staccare le cellule dalle superfici dei fiaschi utilizzando due millilitri di tripsina EDTA 0,05% per fiasco, per cinque minuti a 37 gradi Celsius.Dopo aver confermato il distacco al microscopio, inattivare la tripsina aggiungendo otto millilitri di mezzo di crescita per fiasca e pipettare le cellule alcune volte per ottenere sospensioni cellulari singole da contare. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet a una concentrazione di 1 x 10 alla sesta cellule per millilitro in mezzo di crescita fresco. Per magnetizzare le cellule, aggiungere 10 microlitri di nanoshuttle nel mezzo di crescita per ogni 100 microlitri di cellule e agitare delicatamente le soluzioni.Ribaltare delicatamente i tubi alcune volte e trasferire le miscele di nanoshuttle cellulari in singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Incubare le cellule a temperatura ambiente per due ore con agitazione delicata, al fine di favorire il legame del nanoshuttle alla superficie cellulare. Al termine dell'incubazione di legame, mescolare delicatamente ciascuna sospensione cellulare magnetizzata mediante pipettaggio e aggiustare la concentrazione a 1,5 x 10⁴ cellule tumorali o fibroblasti magnetizzati per 150 microlitri di mezzo.Mescolare i fibroblasti e le cellule tumorali in un rapporto di due a uno, per un totale di 150 microlitri di cellule seminate per pozzetto. Posizionare la piastra a 96 pozzetti con proprietà antiadesive sulla piastra magnetica per sferoidi a 96 pozzetti con magneti più sottili e seminare 150 microlitri di miscela cellulare in ciascun pozzetto. Una volta seminate tutte le cellule, incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5%CO2, lasciando la piastra magnetica per sferoidi ancora attaccata.Il mattino successivo, rimuovere il dispositivo magnetico e reinserire le cellule nell'incubatore per un massimo di altri sette giorni. Il giorno precedente il saggio metabolico, idratare la cartuccia della sonda con 200 microlitri di calibratore per saggio per ogni pozzetto nella piastra fornita e incubare la piastra di supporto tutta la notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius senza CO2. Il mattino seguente, osservare gli sferoidi nella piastra di crescita al microscopio ottico per verificarne la morfologia e l'uniformità generale.Trasferire la piastra di crescita su un supporto magnetico e aspirare con attenzione circa 120 microlitri di mezzo di crescita per pozzetto. Lavare delicatamente gli sferoidi con 120 microlitri di mezzo saggio temperato, per tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, ispezionare nuovamente gli sferoidi al microscopio per confermare che non siano stati rimossi, quindi aggiungere 180 microlitri di mezzo saggio temperato in ogni pozzetto.Utilizzare una punta a largo foro per aspirare delicatamente un singolo sferoide prelavato dalla piastra di crescita con superficie repellente per le cellule e trasferire dolcemente lo sferoide direttamente al centro di una pozzetta della piastra per saggio sferoidi, lasciando che lo sferoide cada nel microscomparto centrale della pozzetta per gravità. Una volta trasferiti tutti gli sferoidi, posizionare la piastra per il saggio nell'incubatrice con aria umidificata a 37 gradi Celsius senza CO2 per un'ora. Durante l'incubazione, orientare la cartuccia del sensore in modo che le righe da A a H siano sul lato sinistro e posizionare una guida di carico sulla parte superiore della cartuccia, in modo che la lettera corrispondente alla porta da caricare si trovi nell'angolo in alto a sinistra.Se la piastra è stata caricata uniformemente, aprire il software di analisi e fare clic su modelli. Fare doppio clic sul modello vuoto e fare clic su genera gruppi. Nella scheda mappa della piastra, assegnare i gruppi alla piastra del saggio, in base al disegno sperimentale, e selezionare le quattro pozzette agli angoli come pozzette di fondo.Nella scheda del protocollo dello strumento, selezionare calibrazione, equilibrazione e ciclo di misura della linea di base. Fare clic su iniezioni e definire il composto per ogni porta. Modificare i cicli di misura a sei, rivedere il protocollo e il riepilogo del gruppo, quindi salvare il modello di progettazione del saggio.In base alla progettazione del saggio come guida, utilizzare una pipetta multicanale per dispensare ogni reagente direttamente nei porti di iniezione, tenendo i supporti di caricamento in posizione con la punta delle dita. Una volta caricati tutti i reagenti, rimuovere il supporto di caricamento e tenere la cartuccia all'altezza degli occhi per ispezionare visivamente i porti di iniezione e verificare un caricamento uniforme. Trasferire la cartuccia sulla piastra di servizio nell'analizzatore del flusso extracellulare e avviare la calibrazione pre-saggio.Dopo la calibrazione, sostituire la piastra di utilità con la piastra per il saggio pre-riscaldata contenente gli sferoidi 3D e avviare il saggio. Al termine del saggio, esportare i dati nel software appropriato per l'analisi. In un esperimento tipico, il diametro degli sferoidi aumenta da circa 400 micrometri al secondo giorno a quasi 600 micrometri al settimo giorno dopo la stampa, senza un aumento significativo osservato dopo il settimo giorno.Tutti e tre i tipi di colture sferoidali mostrano una risposta biologicamente funzionale al test di stress sulla glicolisi in seguito all'iniezione di una concentrazione satura di glucosio, come dimostrato dall'aumento dei loro tassi di acidificazione extracellulare. In generale, un segnale più elevato di acidificazione extracellulare proveniente da sferoidi derivati da cellule tumorali, rispetto al segnale proveniente da sferoidi più piccoli derivati da fibroblasti PS1, può essere attribuito alla propensione metabolica intrinseca delle cellule tumorali verso la glicolisi. In questo test rappresentativo di stress mitocondriale su sferoidi di fibroblasti tumorali, si è osservata una riduzione della respirazione mitocondriale in risposta a un inibitore della ATP sintasi, correlata alla frazione di respirazione mitocondriale utilizzata per la produzione cellulare di ATP.Una seconda iniezione con un agente disaccoppiante ha stimolato il consumo massimo di ossigeno degli sferoidi, con conseguente aumento della respirazione mitocondriale. Una terza iniezione di inibitori dei complessi uno e tre della catena di trasporto degli elettroni ha bloccato la respirazione mitocondriale, osservata come una brusca diminuzione del tasso di consumo di ossigeno. Questi parametri e i tassi di respirazione basale possono essere utilizzati per calcolare la perdita di protoni e le capacità respiratorie di riserva degli sferoidi, fornendo un'analisi metabolica multiparametrica degli sferoidi magnetizzati.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre o quattro ore, se pianificata bene. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di idratare la sonda in un incubatore a 37 gradi da quattro a sedici ore prima di eseguire il saggio metabolico. Dopo la procedura di coltura degli sferoidi, è possibile eseguire altri saggi, come esperimenti di risposta alla dose, per rispondere ad ulteriori domande riguardo l'efficacia del farmaco, la tossicità, i penetranti e la suscettibilità.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del cancro del pancreas per esplorare le interazioni tra stroma tumorale e microambiente tumorale in un modello tridimensionale che imita la biologia e le caratteristiche del tumore in vivo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare sferoidi tridimensionali, partendo da cellule tumorali pancreatiche e fibroblasti coltivati fino all'analisi successiva delle funzioni metaboliche cellulari.

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Questo video spiega la biostampa magnetica 3D di cellule tumorali pancreatiche e fibroblasti co-coltivati. Le cellule tumorali del pancreas e le cellule dei fibroblasti pancreatici attivati vengono co-coltivate e magnetizzate utilizzando un assemblaggio di nanoparticelle biocompatibili, per generare sferoidi, sotto l'influenza delle forze magnetiche.

Co-colture di sferoidi 3D biostampate magneticamente: un metodo per la co-coltura di cellule cancerose e fibroblasti

Questo protocollo descrive la tecnica per eseguire il saggio del flusso extracellulare su sferoidi 3D generati dalla co-coltura di cellule tumorali pancreatiche (Patu8902) e fibroblasti pancreatici attivati (PS1) per misurare le due principali vie di produzione di energia, la glicolisi e la respirazione mitocondriale.

Saggio del flusso extracellulare in sferoidi 3D: un metodo per misurare l'attività metabolica degli sferoidi tumorali del pancreas

Questo video mostra un metodo per stabilire una co-coltura tridimensionale di sferoidi tumorali e cellule T. Viene preparato un calco di agarosio con micropozzetti contenenti sferoidi tumorali, seguito dall'aggiunta di cellule T. Dopo l'incubazione, questa configurazione consente di studiare l'interazione delle cellule T con gli sferoidi tumorali in un ambiente tridimensionale controllato.

Un modello tridimensionale di co-coltura di cellule T infiltranti negli sferoidi tumorali

Questo metodo valuta l'invasione delle cellule tumorali dagli sferoidi in una matrice 3D circostante.  Gli sferoidi vengono generati con il metodo della coltura a goccia sospesa e quindi incorporati in una matrice composta da materiali a membrana basale e collagene di tipo I.  L'invasione degli sferoidi viene successivamente monitorata.

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

Qui, presentiamo diversi semplici metodi per valutare la vitalità e la morte negli sferoidi delle cellule tumorali 3D, che imitano i gradienti fisico-chimici dei tumori in vivo molto meglio della cultura 2D. Il modello sferoide, quindi, consente di valutare l'efficacia del farmaco controilcancro con una migliore traduzione in condizioni in vivo.

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un modello in vitro 3D per studiare la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro (CAF) in un ambiente di massa tumorale, che può essere affrontato in diversi sistemi di analisi, come l'immunofluorescenza, la trascrizione l'analisi e l'imaging delle cellule di vita.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

L'approccio presentato valuta simultaneamente l'invasione delle cellule tumorali nei saggi dello sferoideo 3D e nella citotossicità delle cellule T. Gli spheroidi sono generati in un cast multi-microwell senza scaffold. La co-coltura e l'incorporamento nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dello stesso dispositivo che permette di monitorare l'invasione delle cellule tumorali e la citotossicità mediata a cellule T.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Questo protocollo presenta un nuovo sistema di coltura robusto e riproducibile per generare e far crescere sferoidi tridimensionali dalle cellule adenocarcinoma del colon Caco2. I risultati forniscono la prima prova di concetto per l'appropriatezza di questo approccio allo studio della biologia delle cellule staminali tumorali, compresa la risposta alla chemioterapia.

Un modello tridimensionale di sferoidi per studiare le cellule staminali del cancro del colon

Il presente protocollo descrive la generazione di modelli di coltura tumorale 3D da cellule tumorali primarie e la valutazione della loro sensibilità ai farmaci utilizzando saggi di vitalità cellulare ed esami microscopici.

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Presentiamo un protocollo per la coltivazione di sferoidi ad alta riproducibilità e la loro caratterizzazione fenotipica utilizzando l'acquisizione di immagini e la proteomica.

Analisi fenotipica semi-automatizzata di colture cellulari sferoidi 3D funzionali

Il cancro al pancreas rimane uno dei tumori più difficili da trattare. Pertanto, è fondamentale che i modelli preclinici che valutano l'efficacia del trattamento siano riproducibili e clinicamente rilevanti. Questo protocollo descrive una semplice procedura di co-coltura per generare sferoidi desmoplastici riproducibili e clinicamente rilevanti.

Sferoidi tridimensionali tridimensionali per cancro al pancreas desmoplastico in crescita da co-coltura

Impara a preparare sferoidi 3D co-cultura di cellule tumorali pancreatiche e fibroblasti per valutazione metabolica con analizzatore di flusso extracellulare. Questo metodo riproducibile studia le interazioni metaboliche nel microambiente tumorale.

Preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti

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