Name: Valutazione dellomeostasi dopaminergici in topi tramite luso di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni e assorbimento della dopamina sinaptosomiali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Scopri come valutare l'omeostasi dopaminergica nei topi utilizzando l'assorbimento sinaptosomiale della dopamina e l'analisi HPLC. Questi metodi permettono di misurare i livelli di dopamina nel tessuto striatale e la funzionalità del trasportatore dopo manipolazioni in vivo.

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Questo lavoro è stato supportato dalla UCPH 2016 programma d'eccellenza (U.G., A.R., K.J.), la Fondazione di Lundbeck (M.R.) la Fondazione Lundbeck Center for biomembrane in nanomedicina (U.G.), l'Istituto nazionale di salute sovvenzioni P01 DA 12408 (U.G.), danese Consiglio per la ricerca indipendente - scienze mediche (U.G.).

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<li>Torres, G. E., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+monoamine+transporters%3A+new+visions+of+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).</li>
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<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).</li>
<li>Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+synaptosome+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Thirty years of synaptosome research.</a> J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).</li>
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<li>Earles, C., Schenk, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotating+disk+electrode+voltammetric+measurements+of+dopamine+transporter+activity%3A+an+analytical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation.</a> Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).</li>
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<li>Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+constant+potential+amperometry+for+investigations+of+dopaminergic+neurotransmission+kinetics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo.</a> J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).</li>
<li>Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+regulation+of+dopamine+transporters+by+tyrosine+kinases+in+rat+neuronal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations.</a> J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).</li>
<li>Hansen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+dopamine+transporter+mutations+associate+with+adult+parkinsonism+and+ADHD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD.</a> J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).</li>
<li>Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+substantia+nigra+of+the+human+brain.+II.+Patterns+of+loss+of+dopamine-containing+neurons+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease.</a> Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).</li>
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<li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitive+liquid+chromatographic+method+for+determination+of+neuronal+release+of+serotonin%2C+noradrenaline+and+dopamine+monitored+by+microdialysis+in+the+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex.</a> J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).</li>
<li>Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+neurodegenerative+and+behavioural+changes+induced+by+AAV-mediated+overexpression+of+alpha-synuclein+in+midbrain+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons.</a> Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).</li>
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<li>Mikkelsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPTP-induced+Parkinsonism+in+minipigs%3A+A+behavioral%2C+biochemical%2C+and+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study.</a> Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).</li>
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<li>Van Dam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+distribution+of+biogenic+amines%2C+amino+acids+and+cholinergic+markers+in+the+CNS+of+the+C57BL%2F6+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain.</a> Amino Acids. 28, 377-387 (2005).</li>
<li>Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+hormones+affect+neurotransmitters+and+shape+the+adult+female+brain+during+hormonal+transition+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods.</a> Front Neurosci. 9 (37), (2015).</li>
<li>Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+bulb+monoamine+concentrations+vary+with+time+of+day%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day.</a> Neuroscience. 247, 234-241 (2013).</li>
<li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivity+and+impaired+response+habituation+in+hyperdopaminergic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).</li>
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<li>Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Rapid+Dopamine+Dynamics+with+Fast+Scan+Cyclic+Voltammetry+During+Intra-oral+Tastant+Administration+in+Awake+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats.</a> J Vis Exp. , e52468(2015).</li>
<li>Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+phasic+changes+in+extracellular+dopamine+concentration+in+freely+moving+rats+by+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry.</a> Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).</li>
<li>Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+in+vivo+dynamics+of+neurotransmitter+release+and+serotonin+uptake+after+acute+para-methoxyamphetamine+and+3%2C4-methylenedioxymethamphetamine+revealed+by+chronoamperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry.</a> Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo manoscritto descrive i protocolli sperimentali utili per delineare DA omeostasi in qualsiasi modello del mouse di scelta. Forniamo protocolli dettagliati per misura i livelli di DA nel tessuto cerebrale da topi con HPLC e sinaptosomiali DA assorbimento per valutare funzionale DA trasporto attraverso DAT. Saranno elaborati le procedure, protocolli e i limiti per l'esperimento di HPLC e analisi di assorbimento sinaptosomiale DA sotto.
Il protocollo di assorbimento sinaptosomiale in grado ...

Dopamina (DA) è un neurotrasmettitore modulatory critico per il comportamento del motore, la ricompensa e la funzione conoscitiva1,7,8,9. Squilibri nell'omeostasi DA sono implicati in diverse patologie neuropsichiatriche come disordine di iperattività di deficit di attenzione, tossicodipendenza, depressione e morbo di Parkinson1. DA viene rilasciato dal neurone presinaptico nella fessura sinaptica, dove lega a ed attiva i recettori sulla membrana pre- e postsinaptico, trasporto così ulteriormente il segnale. Il livello di DA nella sinapsi dopo il rilascio è controllato da DAT3,10, spazialmente e temporalmente. Il trasportatore sequestra dallo spazio extracellulare e così sostiene la fisiologica DA livelli3,11. Rimozione genetica di DAT nei topi provoca un fenotipo di hyperdopaminergic caratterizzato dai livelli elevati DA sinaptica, deplezione intracellulare DA piscine e profondi cambiamenti nella postsinaptica DAergica segnalazione10,12.
Qui, vengono presentati due protocolli separati, un metodo di misura DA contenuto del tessuto e l'altro per valutare la funzionalità del DAT. combinata con l'analisi di superficie biotinylation descritto da Gabriel et al.13 questi due metodi forniscono informazioni su DA livelli di contenuto e funzionali di DAT per una valutazione approfondita dell'omeostasi DA. Con questi metodi DA omeostasi dei vari modelli di malattia o topi transgenici può essere caratterizzato e descritto. Questi strumenti sono stati implementati e ottimizzati e sono uso standard nei nostri laboratori. Saggi di corrente hanno servito per studiare le conseguenze sull'omeostasi DA alterare il C-terminale di DAT14 o esprimendo la Cre ricombinasi sotto la tirosina idrossilasi (TH) promotore 5.

<table><tbody><tr><td>Inibitore COMT</td><td>Sigma Aldrich, Germania</td><td>RO-41-0960</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale DA</td></tr><tr><td>[3H]-Dopamina</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA</td><td>NET67-3001MC</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale DA</td></tr><tr><td>Filtri in microfibra di vetro</td><td>GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire</td><td>1822-024</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale</td></tr><tr><td>DA HiSafe Fluido di scintillazione</td><td>Perkin Elmer</td><td>1200-437</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale di DA</td></tr><tr><td>MicroBeta2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale di DA</td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine BCA</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>23225</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale</td></tr><tr><td>DA HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale</td></tr><tr><td>DA Saccarosio</td><td>Sigma Life Science</td><td>S7903</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale DA</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>S3014</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale</td></tr><tr><td>DA KCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>P9541</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale DA</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck KGaA</td><td>10043-52-4</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale</td></tr><tr><td>DA MgSO4</td><td>Sigma Life Science</td><td>63065</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale DA</td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0278</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale DA</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Life Science</td><td>G7021</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale</td></tr><tr><td>DA Pargyline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-8013</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale DA</td></tr><tr><td>Desipramina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3900</td><td>Per la captazione sinaptosomiale DA protocollo</td></tr><tr><td>Dopamina</td><td>Sigma Life Science</td><td>H8502</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale DA</td></tr><tr><td>Cocaina</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5776</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale DA</td></tr><tr><td>Matrice cerebrale</td><td>Strumenti ASI</td><td>RBM2000C</td><td>Per il protocollo di captazione sinaptosomiale DA</td></tr><tr><td>Disgregatore meccanico del teflon Cafano</td><td>Buch & Holm</td><td>Fuori produzione</td><td>Per protocollo di captazione sinaptosomiale DA (omogeneizzazione)</td></tr><tr><td>Antec Decade (Rivelatore amperometrico)</td><td>Antec, Leiden, Paesi Bassi</td><td>Fuori produzione: nuovo modello DECADE Elite / Lite&trade; Rivelatore elettrochimico tipo 175 e 176</td><td>Per protocollo HPLC</td></tr><tr><td>Avantec 0.22 &mu; m filtro in vetro</td><td>Frisenette ApS, Danimarca</td><td>13CP020AS</td><td>Per protocollo HPLC</td></tr><tr><td>Colonna: Prodigy 3 &mu; ODS-3 C18</td><td>Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germania</td><td>Numero di parte: 00A-3300-E0</td> Per il software della soluzione LC <td>del protocollo HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Workstation della serie Shimadzu LabSolutions</td><td>Per il protocollo HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Acido perclorare 0,1M</td><td>Fluka Analytical</td><td>35418-500ml</td><td>Per il protocollo HPLC (preparazione dei tessuti)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-50g</td><td>Per il protocollo</td></tr> <tr><td>HPLCNatriumdiidrogenofosphar</td><td>Bie& Berntsen</td><td>1.06346 1000g</td><td>Per il protocollo HPLC</td></tr><tr><td>Sodio 1-ottanosulfonato monoidrato</td><td>Aldrich</td><td>74885 -10g</td><td>Per il protocollo HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrile, grado HPLC isocratico</td><td>Scharlau</td><td>AC03402500</td><td>Per il protocollo HPLC</td></tr><tr><td>Filtre 0.22um</td><td>Frisenette ApS, Danimarca</td><td>Avantec 13CP020AS</td><td>Per il protocollo HPLC (preparazione dei tessuti)</td></tr> <tr><td>acido orto-fosforico 85%</td><td>Merck</td><td>1.00563. 1000ml</td><td>Per il protocollo HPLC</td></tr><tr><td>Electrode</td><td>Antec, Leiden, Paesi Bassi</td><td>AN1161300</td><td>Per il protocollo HPLC (vedi manuale online)</td></tr><tr><td>Programma di rivelatori sul rivelatore elettrochimico DECADE II</td><td>Antec, Leiden, Paesi Bassi</td><td>Lite&trade; Rivelatore elettrochimico tipo 175 e 176</td><td>Per protocollo HPLC</td></tr></tbody></table>

valutazione dell'omeostasi dopaminergici in topi tramite l'uso di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni e assorbimento della dopamina sinaptosomiali

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamina (DA) è un neurotrasmettitore modulatory controllo attività motoria, i processi di ricompensa e funzione conoscitiva. Danno della neurotrasmissione dopaminergica (DAergic) è fortemente associato con diverse malattie del sistema nervoso centrale-collegata come morbo di Parkinson, disordine di iperattività di deficit di attenzione e farmaco dipendenza1,2 ,3,4. Delineare meccanismi di malattie riguardanti lo squilibrio DA è dipende criticamente su modelli animali di imitare gli aspetti delle malattie, e quindi sono importanti per fornire nuove conoscenze e terapeutiche possibili protocolli che valutano le parti specifiche di omeostasi DA obiettivi per queste malattie.
Qui, vi presentiamo due protocolli sperimentali utili che quando combinati forniscono una lettura funzionale del sistema DAergica in topi. I parametri biochimici e funzionali su DA omeostasi sono ottenuti attraverso la valutazione dei livelli di DA e della dopamina (DAT) trasportatore funzionalità5. Quando si esamina il sistema DA, la capacità di misurare in modo affidabile i livelli endogeni di DA del cervello adulto è essenziale. Pertanto, vi presentiamo come eseguire cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) sul tessuto cerebrale dai topi per determinare i livelli di DA. Eseguiamo l'esperimento sul tessuto da striato dorsale (dStr) e nucleo accumbens (NAc), ma il metodo è adatto per altre aree cerebrali innervati DA anche.
DAT è essenziale per la ricaptazione della DA nel terminale presinaptico, controllando così l'attività temporale e spaziale di DA. rilasciato Nel valutare l'omeostasi DA conoscere i livelli e funzionalità di DAT nello striato è di grande importanza. Qui, forniamo un protocollo che consente contemporaneamente dedurre informazioni sui livelli di superficie e funzione usando un'analisi di assorbimento sinaptosomiale6 DA.
Attuali metodi combinati con protocolli standard immunoblotting forniscono il ricercatore con opportuni strumenti per caratterizzare il sistema DAergica.

Protocollo di corrente DA assorbimento (Figura 1) include tutti i passaggi necessari per valutare la funzionalità del DAT in sinaptosomi dai topi. I nostri dati rappresentativi del metodo DA assorbimento (Figura 2) raffigura una curva di saturazione con dati non rettificati (Figura 2B) e regolato dati (Figura 2A). La curva di saturazione Mostra l'assorbimento da topi wil...

Assorbimento della dopamina sinaptosomiali e strumenti sperimentali rappresentano di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni per indagare l'omeostasi della dopamina nei topi valutando la funzione del trasportatore della dopamina e livelli della dopamina in tessuto striatal, rispettivamente. Qui presentiamo i protocolli per misurare il contenuto di tessuto di dopamina e di valutare la funzionalità del trasportatore della dopamina.

Valutazione dell'omeostasi dopaminergici in topi tramite l'uso di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni e assorbimento della dopamina sinaptosomiali

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

In questo protocollo stiamo introducendo due tecniche. L'obiettivo della prima è valutare la funzione del trasportatore della dopamina misurando il reuptake della dopamina da preparazioni sinaptosomiali. La seconda serve per valutare i livelli di dopamina nei tessuti mediante analisi con HPLC.Questi metodi forniscono parametri importanti dell'omeostasi della dopamina mostrando come misurare il contenuto tissutale di dopamina e valutare la funzionalità del trasportatore della dopamina nei topi. Il principale vantaggio di queste tecniche è che possono essere eseguite dopo manipolazioni in vivo, come manipolazioni chemogenetiche, trattamenti farmacologici in vivo o addestramento comportamentale degli animali. A illustrare la procedura di HPLC sarà Pia Weikop, Professore Associato presso il Laboratorio di Neuropsichiatria.Per iniziare questa procedura, esporre il cranio tagliando la pelle ed eliminando eventuali tessuti in eccesso. Successivamente, tagliare il cranio lungo la sutura sagittale, fino all'estremit&agrave; anteriore. Inserire le punte delle forbici negli occhi ed asportare il cranio rimanente tagliandolo.Rimuovere rapidamente il cervello e collocarlo in PBS freddo di ghiaccio. Successivamente, utilizzando una matrice cerebrale, dissezionare una fetta coronale di tre millimetri del corpo striato. Proseguire con una dissezione più fine mediante una puntura.Successivamente, trasferire i tessuti in una provetta microcentrifuga da 1,5 millimetri per la pesatura. Quindi, ripetere le procedure per il secondo cervello. Una volta ottenuto il peso per entrambi i cervelli, trasferire i tessuti in un omogeneizzatore di vetro contenente un millilitro di tampone per l'omogeneizzazione freddo di ghiaccio.Successivamente, omogeneizzare il tessuto utilizzando un pestello azionato da motore. Poi, trasferire l'omogenato in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e raccogliere l'omogenato rimanente dal bicchiere di omogeneizzazione risciacquandolo con 0,5 millilitri di ulteriore tampone di omogeneizzazione. Successivamente, pellettizzare i nuclei e i detriti cellulari mediante centrifugazione.Quindi, trasferire il soprannatante contenente le membrane cellulari e il citoplasma nei nuovi tubi da centrifuga microcentrifuga da 1,5 millilitro e centrifugare per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, scartare il soprannatante contenente il citoplasma e risospendere il pellet contenente sinaptosomi grezzi in 40 microlitri per milligrammo di tessuto in buffer di omogeneizzazione. In questo passaggio, aggiungere 440 microlitri di buffer di uptake, ligando e cocaina a 12 tubi microcentrifuga da 1,5 millilitro designati e 440 microlitri di buffer di uptake e ligando ai 36 tubi microcentrifuga da 1,5 millilitro rimanenti.Etichettare sei provette microcentrifuga da due millilitri come 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 e 0,31. Successivamente, aggiungere 750 microlitri di buffer per l’assorbimento e ligando alle cinque provette microcentrifuga con il numero più basso. Poi, aggiungere 1.455,4 microlitri di buffer per l’assorbimento e ligando, 14,6 microlitri di dopamina non marcata e 30 microlitri di dopamina triziata alla provetta etichettata 10.Successivamente, trasferire 750 microlitri della miscela dal tubo etichettato 10 al tubo etichettato 5. Mescolare bene e trasferire 750 microlitri della miscela da questo tubo al tubo etichettato 2,5. Ripetere questo processo di diluizione con i tubi rimanenti.Successivamente, prerisciacquare i filtri in microfibra di vetro con quattro millilitri di buffer di uptake dopo averli posizionati su un supporto filtrante a 12 pozzetti. Successivamente, aggiungere 10 microlitri della sospensione di membrane sinaptosomiali ai primi 24 tubi microcentrifuga da 1,5 millilitro contenenti 440 microlitri di buffer. Vortexare delicatamente e centrifugare brevemente per assicurarsi che i sinaptosomi siano completamente immersi nel buffer.Successivamente, lasciarli a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo 10 minuti, aggiungere 50 microlitri di dopamina a 10 micromolari e cinque micromolari alle prime due colonne e lasciarli a 37 gradi Celsius per cinque minuti con agitazione. Dopo cinque minuti, arrestare la reazione aggiungendo un millilitro di tampone di uptake ghiacciato, ripetere con 2,5 micromolari e 1,25 micromolari e poi con 0,62 micromolari e 0,31 micromolari.Aggiungere i campioni ai filtri in microfibra pre-risciacquati e lavarli con cinque volumi di quattro millilitri di tampone di uptake freddo di ghiaccio. Dopo aver aggiunto i primi 12 campioni ai filtri, trasferire i filtri in provette per scintillazione. Ripetere l'operazione con i successivi 12 campioni.Preparare tre provette per il conteggio massimo posizionando un filtro in microfibra sul fondo di provette per scintillazione, da 49 a 51, e aggiungendo 25 microlitri di dopamina massima a 10 micromolare in cima. Successivamente, lasciare tutte e 51 le provette per scintillazione in una cappa per un'ora. Poi, aggiungere tre millilitri di liquido scintillante a ciascuna provetta per scintillazione e agitare vigorosamente su un agitatore per un'ora.Per contare la dopamina triziata in un contatore beta per un minuto, aprire il programma e selezionare le impostazioni appropriate. Per la determinazione delle proteine, utilizzare un kit standard per saggio proteico BCA, al fine di determinare le concentrazioni proteiche dei sinaptosomi per le correzioni e per un adeguato confronto dell'assorbimento tra i campioni. Per la preparazione del tessuto, aggiungere 500 microlitri di soluzione di omogeneizzazione a ciascun campione e omogeneizzare tutti i campioni utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni alla massima velocità per circa 30 secondi.Mantenere i campioni in acqua ghiacciata durante l'omogeneizzazione. Successivamente, centrifugare i campioni per 30 minuti a quattro gradi Celsius, 14.000 x G. Dopodiché, trasferire circa 200 microlitri di ogni campione su un filtro in vetro da 0,22 micron prima di analizzare i campioni mediante metodologia EC-HPLC. Per configurare il rivelatore, impostare l'uscita a 700 millivolt e la temperatura a 32 gradi Celsius nel fornetto del rivelatore.Posizionare le provette nel campionatore automatico. Creare un programma di intervallo utilizzando il manuale online e aggiungere il programma temporale secondo la tabella due. Configurare il sistema aprendo il programma.Successivamente, digitare l'ID utente e la password e fare clic su OK. Attendere quindi che il programma si connetta agli strumenti. Andare quindi alla tabella dei lotti e compilare le informazioni dei dati.Salvare il file andando su file, quindi fare clic su "salva batch file come" e successivamente su salva. Successivamente, iniettare il primo campione premendo avvio batch. In seguito, accedere all'acquisizione dati per seguire il cromatogramma al termine dei campioni.Quindi, passare all'analisi post-run del cromatografo liquido e scegliere il nome del file. Successivamente, fare clic su "Visualizza". Sulla barra di integrazione manuale, aggiungere tutti i picchi da integrare, quindi andare al rapporto dati e stampare il risultato.Dopo aver aggiunto il programma al rilevatore, effettuare una curva di calibrazione a tre punti iniettando lo standard preparato in quantità di cinque, 10 e 15 microlitri. In questa figura, i dati rappresentativi mostrano la curva di saturazione dell'assorbimento della dopamina attraverso il trasportatore della dopamina ottenuta da preparati sinaptosomiali di topi di tipo selvaggio. I punti neri indicano i valori dei quattro topi mostrati separatamente.La curva verde mostra come i dati verrebbero normalmente rappresentati combinando i dati di quattro-sei topi per gruppo. Qui è riportato il grafico di saturazione dei dati grezzi prima della correzione per la concentrazione effettiva di proteina nei campioni. Questo grafico mostra i conteggi dei campioni contenenti cocaina, che vengono utilizzati per sottrarre il fondo dai dati di uptake.Questo controllo è essenziale per determinare l'affidabilità dei dati di captazione. Questo istogramma mostra la capacità di captazione del trasportatore della dopamina e questo istogramma indica un valore di Km per il trasportatore della dopamina pari a 0,1 più o meno 0,03 micromolare, valore che corrisponde bene al metodo della voltammetria con disco rotante, il quale riporta valori di Km per il trasportatore della dopamina compresi tra 0,6 e 1,2 micromolari. Durante l'esecuzione della procedura ottica sinaptosomale, è fondamentale mantenere il tessuto sul ghiaccio in ogni fase della preparazione dei sinaptosomi.Al termine del saggio di captazione della dopamina nei sinaptosomi, possono essere eseguite ulteriori procedure, come il saggio di biotinilazione superficiale, al fine di determinare se una captazione alterata della dopamina possa essere spiegata da una modificata espressione superficiale del trasportatore della dopamina. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come indagare l'omeostasi della dopamina nei topi valutando la funzionalità del trasportatore della dopamina e i livelli di dopamina in preparati di tessuto striatale.

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Neuroscienze

Un protocollo per l'esecuzione unilaterale 6-OHDA lesioni del fascio proencefalo mediale è descritto nei topi. Questo metodo ha un basso tasso di mortalità (13,3%) con l'89% degli animali sopravvissuti mostrano una perdita&gt; 95% della dopamina striatale e di 90,63 ± -4,02% pregiudizi ipsiversive rotazione verso il lato della lesione.

Sviluppo di un unilateralmente lesionata 6-OHDA modello murino della malattia di Parkinson

La tecnica di misura amperometrico il rilascio di dopamina da una singola cellula rilevando la corrente ossidativo prodotta per ossidazione spontanea dopamina. Morsetto di tensione simultanea e la metodologia amperometria rivelano il rapporto meccanicistico tra il generale "attività" del trasportatore della dopamina e il ruolo di regolamentazione di questa attività sul trasporto inverso di dopamina.

Cella di misura singola di rilascio di dopamina con simultanea di tensione-clamp e Amperometria

La dopamina è distintamente regolata nel mesencefalo nuclei, che contengono la cella corpi e dendriti dei neuroni dopaminergici. Qui si descrive un approccio di dissezione e di manipolazione dei campioni per massimizzare i risultati e, quindi, le conclusioni e le intuizioni, sulla regolamentazione dopamina nel mesencefalo nuclei della substantia nigra (SN) e la zona ventrale tegmentale (VTA) in roditori.

Profiling completa del regolamento dopamina nel substantia nigra e ventrale tegmentale Area

Questo video dimostra la valutazione dell'assorbimento della dopamina nei sinaptosomi raccolti dal cervello di topo. Delinea i passaggi per preparare i sinaptosomi per l'assorbimento della dopamina tramite trasportatori della dopamina, trattandoli con concentrazioni variabili di dopamina radiomarcata, isolando i sinaptosomi e misurando la radioattività per quantificare l'assorbimento della dopamina.

Misurazione dell'assorbimento della dopamina nei sinaptosomi cerebrali di topo utilizzando la dopamina radiomarcata

Nella malattia e dei disordini del movimento di Parkinson, in generale, le analisi comportamentali sensibili e affidabili sono essenziali per testare nuove potenziali terapie. Qui, descriviamo una batteria gestibile di prove sensomotorie per i topi che sono sensibili a vari gradi di lesioni al sistema nigrostriatal e utile per gli studi preclinici.

Valutazione della Sensorimotor funzione in modelli murini di malattia di Parkinson

Qui descriviamo due saggi che sono stati stabiliti per studiare neurodegenerazione età-dipendente di dopaminergici (DA) neuroni...

Valutare fenotipi neurodegenerative<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni dopaminergici mediante saggi arrampicata e Whole Brain Immunostaining

Gli isozimi lipossigenasi (LOX) possono generare prodotti che possono aumentare o diminuire la neuroinfiamminazione e la neurodegenerazione. Uno studio di interazione gene-ambiente potrebbe identificare effetti specifici dell'isozima LOX. L'uso del modello 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) del danno nigrostriatale in due linee transgeniche carenti di isozima LOX consente il confronto del contributo degli isozimi LOX sull'integrità dopaminergica e sull'infiammazione.

Modelli di interazione gene-ambiente per smascherare i meccanismi di suscettibilità nel morbo di Parkinson

Questa carta dettaglia l'uso di registrazioni di fisso-potenziale amperometrico utilizzando elettrodi in fibra di carbonio e tecnologia dei biosensori enzimatici per misurare il rilascio di dopamina e glutammato con elevata risoluzione temporale durante il naturale comportamento gratificante nella criceto femmina.

Misurare In Vivo i cambiamenti in neurotrasmettitori extracellulare durante naturalmente Premiando i comportamenti in criceti siriani femminili

Vi presentiamo una comoda estrazione in fase solida accoppiata alla cromatografia liquida (HPLC) con rivelazione elettrochimica (ECD) per la determinazione simultanea di tre neurotrasmettitori di monoammina e due dei loro metaboliti nelle urine dei bambini. Identifichiamo anche il metabolita MHPG come potenziale biomarcatore per la diagnosi precoce del danno cerebrale per neonati.

Un metodo pratico per estrazione ed analisi con cromatografia liquida dei neurotrasmettitori della catecolamina e loro metaboliti

Identificazione del recettore D1-alfa della dopamina nel nucleus accumbens è fondamentale per chiarire la disfunzione dei recettori D1 durante una malattia del sistema nervoso centrale. Abbiamo effettuato un romanzo determinazione del RNA in situ di ibridazione per visualizzare singole molecole di RNA in un'area specifica del cervello.

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology

Questo metodo introduce una semplice tecnica per il rilevamento del rilascio endogeno di monoammina utilizzando fette di cervello acute. La configurazione utilizza una piastra a 48 pozzetti contenente un supporto in tessuto per il rilascio di monoammina. La monoammina rilasciata viene analizzata mediante HPLC accoppiato con il rilevamento elettrochimico. Inoltre, questa tecnica fornisce un metodo di screening per la scoperta di farmaci.

Un test basato su piastre per la misurazione del rilascio di monoamina endogena in fette cerebrali acute

Scopri come valutare l'omeostasi dopaminergica nei topi utilizzando l'assorbimento sinaptosomiale della dopamina e l'analisi HPLC. Questi metodi permettono di misurare i livelli di dopamina nel tessuto striatale e la funzionalità del trasportatore dopo manipolazioni in vivo.

Valutazione dellomeostasi dopaminergici in topi tramite luso di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni e assorbimento della dopamina sinaptosomiali (Video) | JoVE Journal

Valutazione dell'omeostasi dopaminergici in topi tramite l'uso di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni e assorbimento della dopamina sinaptosomiali

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