Profilare IgG anti-Neu5Gc in Sera umana con un assaggio microarray di Sialoglycan

L'obiettivo generale del saggio di microarray sialoglycan è quello di valutare le IgG anti-Neu5Gc in sieri umani in modo ad alto rendimento rispetto a una collezione diversificata di scialoglicani. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della glicoimmunologia, come ad esempio il modo in cui gli anticorpi anti-Neu5Gc sono coinvolti in varie malattie umane tra cui il cancro, le malattie cardiache e gli xenotrapianti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la profilazione ad alto rendimento degli anticorpi anti-Neu5Gc contro una miriade di antigeni sialoglicani.

A dimostrare la procedura sarà Sharon Yehuda, una studentessa del mio laboratorio. Una pianificazione attenta e dettagliata della fabbricazione e del layout dell'array è importante per garantire il successo. Questo processo è descritto in dettaglio nel testo, nel protocollo e nelle informazioni supplementari.

Diluire ciascun glicano a 100 micromolari in un volume totale di 100 microlitri di tampone di stampa del glicano in provette per microcentrifuga. Successivamente, preparare un'ammina primaria contenente colorante fluorescente a un milligrammo per millimetro con tampone marcatore. Quindi, diluire a un microgrammo per millilitro in un volume totale di un millilitro.

Preparare le diluizioni della curva standard delle IgG umane come descritto nel protocollo di testo. Posizionare la piastra a 384 pozzetti sul ghiaccio. Utilizzando una multipipetta elettronica, aliquotare sette microlitri di ciascun glicano, marcatore e curva di stardard IgG secondo il layout della piastra trovato nel protocollo di testo.

Coprire il piatto con parafilm e girare per due minuti a 250 volte g e 12 gradi Celsius. La stampa deve essere eseguita in un'area priva di polvere con un'umidità compresa tra il 60 e il 70%Qui, tutti i passaggi vengono eseguiti in una camera bianca con guanti e indumenti adeguati per la protezione. Accendere la stampante nano e l'umidificatore.

Dopo aver programmato la macchina da stampa come descritto nel protocollo di testo, posizionare la piastra a 384 pozzetti con campioni aliquotati nella sua posizione sul piano di distribuzione e rimuovere il coperchio in parafilm. A questo punto, inizia a stampare. Numerare i vetrini con un pennarello resistente ai solventi dell'alcol e conservarli al buio in una scatola sottovuoto.

Per elaborare gli array, rimuovere prima un vetrino dalla scatola sigillata sottovuoto e metterlo in una cappa chimica per cinque minuti, con l'array rivolto verso l'alto, per far evaporare il liquido in eccesso. Successivamente, idratare il vetrino mettendolo in un tubo di colorazione riempito con acqua deionizzata. Coprire la provetta con un foglio di alluminio e incubare per cinque minuti agitando lentamente e delicatamente a temperatura ambiente.

Per bloccare i gruppi epossidici reattivi sul vetrino, immergere il vetrino nel tubo di colorazione da 50 millilitri riempito con una soluzione bloccante di etanolammina preriscaldata. Coprire la provetta con un foglio di alluminio e incubare per 30 minuti agitando lentamente e delicatamente a temperatura ambiente. Gettare la soluzione bloccante dell'etanolammina nell'apposito contenitore per rifiuti a rischio biologico.

Quindi, posizionare il vetrino in un tubo di colorazione nuovo e pulito riempito con acqua deionizzata a 50 gradi Celsius. Coprire la provetta con un foglio di alluminio e incubare per 10 minuti agitando lentamente e delicatamente a temperatura ambiente. Scartare l'acqua e trasferire i vetrini in un supporto per colorante in vetro.

Posizionare l'apparecchio in un supporto per piastra oscillante e centrifugare il vetrino a secco. Quindi, posizionare il vetrino su un divisore a 16 pozzetti. Dopo aver pre-bagnato i pozzetti, utilizzare una multipipetta per aliquotare 200 microlitri di PBST nei pozzetti del vetrino.

Quindi, metteteli in una camera coperta e umida e agitateli per cinque minuti. Rimuovere il PBST sfiorando e picchiettando delicatamente su un tovagliolo di carta pulito. Quindi, aliquotare 200 microlitri di tampone bloccante PBS-Ovalbumina in ciascun pozzetto.

Collocare i vetrini in una camera umida e incubare per un'ora a temperatura ambiente agitando delicatamente. Quindi, preparare il rilevamento primario, diluito nel buffer di blocco PBS-OVA come descritto nel protocollo di testo. Estrarre il tampone di blocco PBS-OVA dal vetrino e aggiungere 200 microlitri di anticorpi primari per pozzetto.

Incubare i vetrini in una camera umida per due ore. Quindi, rimuovere il rilevamento primario dal vetrino e lavare tre volte con PBST. Incubare il vetrino in PBST per cinque minuti in una camera umida prima di lavare un'ultima volta con PBST.

Quindi, lavare una volta con PBS. Successivamente, preparare l'anticorpo secondario nel PBS come descritto nel protocollo di testo. Togliete il PBS dal vetrino e aggiungete 200 microlitri di anticorpi secondari.

Togliere l'anticorpo secondario dal vetrino e lavare quattro volte con PBST come prima. Rimuovere con cautela il telaio, quindi posizionare i vetrini in un tubo di colorazione dei vetrini da 50 millilitri riempito di PBS e agitare per cinque minuti. Quindi, riempire due bagni di colorazione per vetrini con acqua deionizzata.

Posizionare lo scivolo nel supporto del vetrino e immergerlo nel primo bagno. Immergi rapidamente il vetrino dieci volte. Quindi, trasferisci lo scivolo nella seconda vasca e immergilo altre dieci volte.

Dopo l'immersione, incubare il vetrino per dieci minuti a temperatura ambiente agitandolo. Dopo l'incubazione, scartare l'acqua e trasferire il vetrino in un supporto per colorante in vetro. Posizionare il supporto per la colorazione del vetro in un supporto per piastra oscillante e centrifugare il vetrino ad asciugare.

Aprire lo sportello dello scanner e posizionare il vetrino all'interno, con la matrice rivolta verso il basso. A questo punto, avviare la scansione. Salvare le diapositive scansionate come file TIFF.

Per preparare una diapositiva per l'analisi, selezionare Carica elenco array" e caricare il file GAL appropriato che mappa le matrici in ciascun blocco sulla diapositiva. I vetrini sono stati sviluppati con 16 diverse porzioni di rilevamento primario, una in ogni blocco. La pianta Lectina SNA lega l'acido sialico legato a2-6

Mentre la pianta Lectina MALII lega l'acido sialico legato a2-3. Le IgY policlonali anti-Neu5Gc legano i scialoglicani contenenti Neu5Gc ma non legano i scialoglicani contenenti Neu5Ac. Per profilare le IgG anti-Neu5Mc, 12 sieri provenienti da donatori umani sani sono stati analizzati sul microarray stampato di sialoglycan e sviluppati utilizzando IgG anti-umane marcate in fluorescenza normalizzate a nanogrammi per microlitro.

Tutti i sieri umani testati contenevano vari livelli di IgG anti-Neu5Gc con quasi nessun riconoscimento delle coppie abbinate di scialogcani contenenti Neu5Ac. Inoltre, i modelli di riconoscimento delle IgG anti-Neu5Gc sono molto diversi tra questi 12 diversi sieri, sia nel livello di intensità che nella diversità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come profilare gli anticorpi anti-Neu5Gc in vari campioni umani in modo ad alto rendimento, utilizzando un sistema di microarray di glicani.