Utilizzazione di capsule per la colorazione negativa di campioni virali all'interno del Biocontainment

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una procedura di colorazione TEM negativa semplice ed efficace per campioni virali nell'ambito del biocontenimento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in virologia sulla morfologia e le strutture dei virus oggetto di indagine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una gestione facile ed efficace delle griglie di microscopia elettronica all'interno di ambienti di biocontenimento.

Questa tecnica viene utilizzata come parte della diagnosi TEM di un virus sconosciuto perché può essere facilmente applicata a campioni virali in tutti gli ambienti. Sebbene abbiamo utilizzato questo metodo principalmente per aiutare negli studi TEM sui virus, ha un'applicazione molto più ampia e può essere utilizzato nell'indagine EM della maggior parte delle nanoparticelle. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ci vuole un po' di pratica per garantire che le griglie TEM non vengano danneggiate quando vengono caricate e scaricate dalle capsule.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando avevamo problemi a gestire piccole griglie EM nel biocontenimento. Per iniziare questa procedura, preparare o acquistare griglie in rame TEM rivestite di virus e carbonio. Inserire le griglie TEM rivestite nelle capsule.

Quindi, trasferire le capsule caricate insieme ad altre forniture e reagenti al biocontenimento. Per iniziare, collegare la capsula a una pipetta. Aspirare 40 microlitri di espansione virale nella capsula.

Posizionare la pipetta su un lato, con le griglie orientate orizzontalmente per 10 minuti. Quindi, prendere la pipetta ed erogare la soluzione virale in un contenitore di rifiuti. Aspirare 40 microlitri di fissativo glutaraldeide al 2% nelle capsule.

Posizionare la pipetta su un lato per 20 minuti. Successivamente, espellere il fissativo e aspirare 40 microlitri di acqua deionizzata nella capsula, per lavare via il fissativo. Ripetere questo lavaggio tre volte.

Successivamente, aspirare 40 microlitri di acetato di uranile all'1% o acido fosfotungstico di potassio all'1% nella capsula. Lasciare riposare la capsula per 30 secondi. Quindi, rimuovere la capsula dalla pipetta.

Toccare un pezzo di carta da filtro sul bordo delle griglie per asciugare. Trasferire la carta da filtro in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Quindi, immergere la carta da filtro in una soluzione di tetrossido di osmio all'1%.

Posizionare la capsula con il coperchio aperto nel tubo. Sigillare il tubo per un'ora per consentire la completa permeazione del vapore di tetrossido di osmio. Successivamente, decontaminare la provetta e trasferirla fuori dal biocontenimento alla struttura BSL-2 EM.

Rimuovere la capsula dalla provetta da centrifuga, quindi posizionarla su una pipetta. Aspirare 40 microlitri di acqua deionizzata nella capsula e poi erogare l'acqua in un contenitore per rifiuti. Ripeti questo lavaggio con acqua tre volte.

Quindi, rimuovere la capsula dalla pipetta. Con carta da filtro, asciugare le griglie. Lasciare asciugare le griglie all'aria e poi conservarle in una scatola a griglia, fino al momento di eseguire l'imaging TEM.

Per iniziare, mescolare la sospensione virale con un volume uguale di glutaraldeide al 4%, per ottenere una concentrazione finale di glutaraldeide al 2%. Utilizzando il fissativo, inattivare il virus per almeno 24 ore. Decontaminare la provetta e trasferirla alla struttura BLS-2 EM.

Successivamente, collegare una cattura caricata su griglia a una pipetta. Aspirare la miscela nella capsula. Posizionare la pipetta su un lato con le griglie orientate orizzontalmente per 10 minuti.

Quindi, prendere la pipetta ed espellere la miscela virale in un contenitore per rifiuti. Aspirare 40 microlitri di acqua deionizzata nella capsula e poi smaltire l'acqua in un contenitore per rifiuti. Ripetere questo lavaggio tre volte.

Successivamente, aspirare 40 microlitri di 1% QA o 1% PTA nella capsula per 30 secondi. Rimuovere la capsula dalla pipetta. Con carta da filtro, asciugare le griglie.

Quindi, lasciare asciugare le griglie all'aria. In questo studio, i campioni del virus Zaire Ebola vengono sottoposti a colorazione negativa, utilizzando sia il metodo manuale delle goccioline che il metodo della capsula. Le immagini TEM generate da questi metodi, mostrano entrambe dettagli chiaramente definiti, con strutture nucleocapsidi al centro della variazione e glicoproteine visibili sulla superficie.

Pertanto, il metodo della capsula è in grado di produrre immagini TEM di qualità simile a quelle prodotte dal metodo manuale delle gocce. Successivamente, vengono confrontati diversi metodi di inattivazione del campione utilizzando il virus Chikungunya. L'inattivazione del campione si ottiene rapidamente, utilizzando il 2% di glutaraldeide per 20 minuti con successiva esposizione al tetrossido di osmio all'1% per un'ora, o durante la notte, utilizzando il 2% di glutaraldeide per 24 ore.

Come si può vedere, il processo di inattivazione più lungo senza tetrossido di osmio consente di vedere più dettagli ultrastrutturali. Quindi, utilizzando il metodo della capsula, sono state confrontate due colorazioni utilizzando particelle simili a virus fissate con aldeide. Sia l'acetato di uranile che l'acido fosfotungstico mostrano risultati di alta qualità, con bordi chiaramente definiti e glicoproteine visibili.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora e mezza, a seconda del numero di campioni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di selezionare i reagenti fissativi e coloranti appropriati per i propri obiettivi sperimentali. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il conteggio delle particelle per rispondere a ulteriori domande calcolando le concentrazioni del virus.

Questa tecnica migliora il modo in cui i virologi possono esplorare la morfologia del virus e le informazioni sulla struttura con maggiore facilità, specialmente nei virus di livello BLS-3 e 4. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come gestire facilmente le griglie TEM per la colorazione negativa all'interno del biocontenimento. Non dimenticare che lavorare con aldeide, tetrossido di osmio e acetato di uranile può essere estremamente pericoloso e precauzioni come dispositivi di protezione individuale adeguati e una cappa chimica dovrebbero essere sempre utilizzati durante l'esecuzione di questa procedura.