Valvola di isolamento e caratterizzazione del ratto primario cellule interstiziali: un nuovo modello per studiare la calcificazione della valvola aortica

L'obiettivo generale di questo protocollo è isolare le cellule interstiziali valvolari di ratto o VIC per studiare i meccanismi della malattia calcifica della valvola aortica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della calcificazione valvolare, ad esempio perché i VIC calcificano e cosa possiamo fare per prevenire la calcificazione di queste cellule. I principali vantaggi di questa tecnica sono l'accessibilità e la possibilità di trasformarsi in linee cellulari per ulteriori studi.

Eseguire tutte le dissezioni in una cappa ventilata precedentemente disinfettata con etanolo al 70% per garantire la sterilità dei campioni e dei reagenti. Sterilizzare gli strumenti di dissezione mediante sterilizzazione in autoclave, quindi immergere le punte degli strumenti in un becher contenente il 70% di etanolo prima dell'uso. Immergere gli strumenti di dissezione nei becher del tampone di lavaggio prima di entrare in contatto con l'animale o i tessuti.

Dopo aver abbattuto i ratti come descritto nel protocollo di testo, posizionare l'animale supino su una tavola di dissezione di vetro e disinfettare la pelle spruzzando con etanolo al 70%. Per sezionare il cuore, praticare un'incisione di quattro centimetri nella linea mediana del ratto con l'aiuto di forbici da dissezione per esporre la cavità addominale e rimuovere con cura la gabbia toracica e i polmoni per esporre il cuore. Rimuovi il cuore con un paio di forbici affilate.

Conservare il cuore sezionato in un tampone di lavaggio ghiacciato fino a quando tutte le dissezioni grossolane dei ratti non sono complete. Per microsezionare ogni cuore, trasferire il cuore sezionato in una capsula di Petri coperta da un tampone di lavaggio. Taglia il muscolo cardiaco con un paio di forbici dritte a molla per essere un sinistro con una piccola area che circonda l'aorta ascendente e la radice aortica.

Usando le stesse forbici dritte a molla, tagliare con cura l'aorta ascendente verso il ventricolo sinistro ed esporre i lembi della valvola aortica. Quindi, trasferisci l'aorta aperta in una capsula di Petri sterile fresca riempita con la soluzione salina bilanciata di Hank. Seziona i lembi della valvola aortica contrassegnati dalla loro unica forma a U alla base dell'aorta con un paio di forbici Vannas.

Conservare tutti i lembi in un millilitro di tampone di lavaggio ghiacciato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri fino al completamento di tutte le dissezioni. Una volta raccolte tutte le foglioline, centrifugarle a 100 g per un minuto a quattro gradi Celsius per rimuovere il tampone di lavaggio. Per rimuovere le cellule endoteliali valvolari o VEC, digerire i lembi in 100 microlitri da 425 unità per millilitro di Collagenasi II per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Interrompere la digestione pipettando delicatamente su e giù utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri. Centrifugare a 100 g per 30 secondi per pellettare i foglietti. Dopo aver scartato accuratamente il surnatante, lavare i lembi con 500 microlitri di tampone di lavaggio e ripellettare le cellule mediante centrifugazione a 100 g per 30 secondi.

Per raccogliere i VIC dalle foglioline, digerire con 100 microlitri di Collagenasi II per 1,5-2 ore a 37 gradi Celsius. Quindi rilasciare i VIC pipettandoli delicatamente su e giù utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri. Diluire la collagenasi II in 19 millilitri di terreno di coltura e centrifugare a 670 g per cinque minuti per pellettare i VIC e i residui rimanenti del lembo valvolare.

Dopo aver scartato il surnatante, trasferire i lembi e i VIC in piastre di coltura o fiasche. Coltivare i VIC per cinque-sette giorni nel terreno di coltura fino a raggiungere la confluenza a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di CO2, cambiando il terreno dopo 72 ore. Per preparare VIC primari di ratto per esperimenti di calcificazione in vitro, seminare le cellule a una densità di 150.000 cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti.

Mantenere le cellule nel terreno di coltura fino a una confluenza superiore al 90%. Trattare i VIC con calcificazione rispetto al terreno di controllo e incubare a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di CO2 per ulteriori 72 ore. Per studiare i VIC primari calcificati di ratto per le successive analisi a valle, rimuovere il mezzo di calcificazione o di controllo.

Lavare i monostrati con tampone di lavaggio per rimuovere gli ioni calcio e fosfato non legati prima di eseguire la caratterizzazione VIC del ratto come descritto nel protocollo di testo. Per gli studi di calcificazione del VIC di ratto, colorare i monostrati cellulari con una soluzione di rosso S di alizarina al 5%, facendo oscillare delicatamente su uno shaker per 20 minuti. Successivamente, lavare tre volte con acqua distillata per cinque minuti ogni volta.

Per quantificare la deposizione di calcio, utilizzare un kit per il dosaggio biochimico del calcio. Svuotare gli ioni di calcio utilizzando acido cloridrico molare 0,6 per 24 ore a quattro gradi Celsius con una leggera agitazione. Raccogliere il surnatante e misurare la concentrazione di calcio utilizzando un kit per il dosaggio del calcio seguendo le linee guida del produttore.

Infine, calcola la concentrazione di calcio come frazione della proteina cellulare totale come descritto nel protocollo di testo. Il fenotipo VIC delle cellule isolate è stato confermato attraverso l'immunofluorescenza, sondando i marcatori VIC, la vimentina e l'alfa actina della muscolatura liscia. Inoltre, l'espressione del regolatore di crescita VIC, il fattore di crescita tissutale beta-1 e 2, è stata confermata mediante analisi PCR.

È stata eseguita anche l'analisi Western blot per verificare che i VIC di ratto fossero negativi per il marcatore delle cellule endoteliali CD 31, utilizzando i VEC mitralici canini come controllo positivo. I VIC di ratto sono stati esposti a livelli elevati di calcio e fosfato, che imitano le condizioni patologiche di ipercalcemia e iperfosfatemia. Trattamento di VIC con calcificazione indotta da calcio e fosfato, come determinato mediante colorazione con rosso di alizarina per la deposizione di calcio e determinazione colorimetrica dei livelli di calcio dopo lisciviazione dell'acido cloridrico.

Il trattamento dei VIC con calcio e fosfato ha indotto un aumento significativo dell'espressione dell'mRNA dei marcatori osteogenici MSX2, ALPL e PHOSPHO1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una o due ore, escludendo la digestione per 18 lembi valvolari. Durante il tentativo di questa procedura, è importante garantire la sterilità durante la dissezione e la digestione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i VIC primari di ratto e usarli per studiare i meccanismi alla base della calcificazione dei VIC. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la citometria a flusso e l'analisi al microscopio per studiare la fisiologia e il comportamento dei VIC. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo della ricerca cardiovascolare per esplorare i meccanismi di classificazione della valvola aortica nell'uomo utilizzando il modello di ratto.