Name: Piezo alta precisione dossa e la rimozione chirurgica (PHASOR): Una tecnica di chirurgia finestra cranica migliorata in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Scopri la chirurgia piezoelettrica per finestre craniche nei topi, una tecnica che riduce i tempi operatori e le complicanze. Questo metodo consente imaging in vivo dell'attività neuronale con maggiore precisione e sicurezza.

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Tamara Zeric per aver contribuito a ottenere l'immagine multifotonica in questa carta. Supportato da cervello & comportamento, morbo di Parkinson e JPB fondazioni, MH108186 R01 e DA07418 R01. F31 fellowship 1F31MH109293-01A1 a C. S

Tutte le procedure che coinvolgono animali sono stati eseguiti secondo gli standard stabiliti dalla Columbia University Medical Center istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC). L'eutanasia è stata eseguita tramite dislocazione cervicale in anestesia con ketamina 100 mg/kg e xilazina iniettato intraperitonealmente 10 mg/kg. Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite in modo sterile (chirurgo indossava tappo di testa, maschera viso, guanti sterili e camice da laboratorio monouso pulito) e strumenti chirurgici sono stati sterilizzati nell'autoclave tra ogni uso.
1. prechirurgiche passaggi
<ol><li>Autoclave tutti gli strumenti chirurgici per garantire la sterilità.</li>
	<li>Anestetizzare topi C57bl6 con isoflurano (4% per induzione e 1.5-2% per la chirurgia). Pizzicare la punta posteriore ogni 10 min per assicurare la corretta profondità dell'anestesia. Aumentare l'anestesia se è visto ritrazione vocalizzazione o dell'arto.</li>
	<li>Applicare il lubrificante veterinario occhio agli occhi per evitare l'essiccazione.</li>
	<li>Rimuovere i capelli sopra il cuoio capelluto con un'applicazione di 3 min di gel per capelli rimozione o dalla rasatura con un rasoio elettrico.</li>
	<li>Posizionare il mouse nella cornice stereotassica su un rilievo di riscaldamento o coperta di ricircolo acqua calibrato impostata su 38° C.</li>
	<li>Amministrare la buprenorfina (0,1 mg/kg) per via sottocutanea per fornire l'analgesia prechirurgica.</li>
	<li>Disinfettare il cuoio capelluto con tre applicazioni alternati di clorexidina o betadine ed etanolo al 70% utilizzando un batuffolo di cotone con punta applicatore.</li>
	<li>Iniettare 100 mL di bupivacaine diluito 50% in soluzione salina sotto il cuoio capelluto per fornire l'anestesia locale.</li>
</ol>2. piezoelettrico finestra cranica chirurgia
<ol><li>Utilizzando strumenti chirurgici sterili in autoclave, rimuovere un cerchio di 1 cm del cuoio capelluto sopra il cranio di taglio con forbici chirurgiche in un modello circolare. Sollevare il cuoio capelluto fuori del cranio esponendo il tessuto periostio sopra l'osso.</li>
	<li>Utilizzare la punta del forcipe per raschiare l'osso esposto chiaro di qualsiasi tessuto restante del periostio. Questo è importante assicurare che il cemento dentale non cadrà più tardi.</li>
	<li>Impostare l'unità di chirurgia piezoelettrica a vibrare l'impostazione più bassa. Si noti che le impostazioni più alte possono rompere vasi sanguigni a causa di intense vibrazioni.</li>
	<li>Difficoltà la punta circolare sterile al manipolo. Nota: La punta circolare di 4 mm è adatta per interventi chirurgici. Il formato di punta grande contribuisce alla velocità della chirurgia come l'intera finestra può essere assottigliata simultaneamente.</li>
	<li>Riempire una siringa da 10 mL con ghiaccio freddo cerebrospinale artificiale (ACSF) e tenerlo in mano che non impugna il manipolo piezoelettrico.</li>
	<li>Irrigare il cranio di sgocciolatura ACSF da siringa il cranio ad un tasso di 1 mL/min in alternativa, utilizzare una pompa peristaltica, posizionata sopra il cranio per liberare l'uso di altra mano. Nota: Irrigazione con ACSF freddo è importante per prevenire il surriscaldamento dovuto all'attrito dalle vibrazioni ad alta frequenza.</li>
	<li>Applicare delicatamente la punta vibra chirurgica al cranio con un leggero movimento circolare (3 cerchi per 1 s) e sottile dell'osso alla profondità desiderata per eseguire una preparazione cranio sottile (5-10 min). Nota: Qui, windows 4 mm sono state fatte che sono state assottigliate a 20 µm. Tuttavia, la dimensione della finestra variano con la dimensione della punta chirurgica. Lo spessore dell'osso può essere regolata fino alla profondità desiderata in base alla lunghezza del tempo trascorso applicando la punta al cranio.</li>
	<li>Delicatamente, regolare l'angolazione del manipolo e cambiare l'angolo della punta, esercitando pressione al cranio per fluidificare il cranio uniformemente.</li>
	<li>Per eseguire una rimozione completa dell'osso senza lasciare alcun osso sottile dietro, sottile dell'osso fino a quando le crepe sono visibili intorno alla zona di finestra. Rimuovere le rimanenti scaglie di osso sottile con le pinzette senza danneggiare il sottostante dura.</li>
	<li>Immergere un pezzo di 1 mm di schiuma di collagene emostatico in ACSF freddo. Tenere la schiuma bagnata con una pinza e posizionarlo sul cranio sottile. Lasciare riposare sul cranio sottile per circa 30 s per interrompere qualsiasi micro sanguina in via di sviluppo.</li>
	<li>Utilizzare pinze per posizionare un coprioggetto in vetro 4 mm lateralmente sopra la finestra che è stata assottigliata nell'osso.</li>
	<li>Utilizzare il retro di un cotone piccolo di plastica o di legno con punta applicatore per applicare circa 100 µ l di acrilico dentale al cranio per tenere la finestra in posizione.</li>
</ol>3. post chirurgico cura
<ol><li>Rimuovere il mouse dall'apparato chirurgico e metterlo in una gabbia riscaldata per il recupero. Monitor continuamente fino a quando ha riguadagnato la coscienza completa (valutato da comportamento, andatura e mobilità normale).</li>
	<li>Valutare gli animali due volte al giorno per tre giorni per manifestazioni del dolore post-operatorio, compresa l'attività in diminuzione, toelettatura, cibo e consumo di acqua, custodire il comportamento (ad es. zoppicando o una postura ricurva) o aumentata aggressività. Non restituire l'animale per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato.</li>
	<li>Amministrare la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per via sottocutanea come un analgesico 8 – 12 h dopo l'intervento chirurgico per 3 giorni. Monitorare l'area della finestra molto attentamente dopo la chirurgia per deiscenza, infiammazione e segni di infezione. Se l'animale non tornare alla linea di base di alimentazione e governare i comportamenti, consultare un veterinario per quanto riguarda i possibili interventi o l'eutanasia.</li>
</ol>

<ol><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li>
<li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+intravital+thinned+skull+and+cranial+window+approaches+to+study+CNS+immunobiology+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex.</a> Intravital. 3, e29728-1-e29728-8 (2014).</li>
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<li>Wang, J., Zhang, Y., Xu, T. H., Luo, Q. M., Zhu, D. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.7452/lapl.201210017/meta">An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing.</a> Laser Physics Letters. 9, (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skull+Optical+Clearing+Solution+for+Enhancing+Ultrasonic+and+Photoacoustic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Med+Imaging%22%5BJournal%5D)">Skull Optical Clearing Solution for Enhancing Ultrasonic and Photoacoustic Imaging.</a> IEEE Trans Med Imaging. 35, (2016).</li>
<li>Vercellotti, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezoelectric+surgery+in+implantology%3A+a+case+report--a+new+piezoelectric+ridge+expansion+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">Piezoelectric surgery in implantology: a case report--a new piezoelectric ridge expansion technique.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 358-365 (2000).</li>
<li>Vercellotti, T., De Paoli, S., Nevins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+piezoelectric+bony+window+osteotomy+and+sinus+membrane+elevation%3A+introduction+of+a+new+technique+for+simplification+of+the+sinus+augmentation+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">The piezoelectric bony window osteotomy and sinus membrane elevation: introduction of a new technique for simplification of the sinus augmentation procedure.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 6, 561-567 (2001).</li>
<li>Vercellotti, T., Podesta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthodontic+microsurgery%3A+a+new+surgically+guided+technique+for+dental+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Periodontics+Restorative+Dent%22%5BJournal%5D)">Orthodontic microsurgery: a new surgically guided technique for dental movement.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 325-331 (2007).</li>
<li>Stubinger, S., Stricker, A., Berg, B. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4646478/">Piezoelectric surgery in implant dentistry.</a> Clin Cosmet Investig Dent. 7, 115-124 (2015).</li>
<li>Basheer, S. A., Govind, R. J., Daniel, A., Sam, G., Adarsh, V. J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Piezoelectric+and+Rotary+Osteotomy+Technique+for+Third+Molar+Impaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Contemp+Dent+Pract%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction.</a> J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).</li>
<li>Pavlikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0901502711002232">Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).</li>
</ol>

Non ci sono nessun informazioni integrative.

La chirurgia può essere modificata cambiando la punta chirurgica. Ci sono molti formati differenti della punta che possono essere applicati al manipolo. Modificare le dimensioni o la forma della punta si tradurrà in finestre di dimensioni diverse. Oltre la punta di 4 mm, abbiamo anche provato una punta di 3 mm e trovato che ha anche funzionato bene. Anche con irrigazione con ghiaccio freddo ACSF, non eravamo in grado di ottenere buoni risultati con le punte che erano troppo strette (circa 0,25 mm) a causa di vibrazioni concentrate causando troppo calore e bruciare l'osso conseguenti danni al sottostante dura. Non abbiamo provato la moltitudine di altri suggerimenti che sono disponibili, e ci aspettiamo che altri laboratori possono trovare nuove applicazioni per questi consigli diversi. Mentre la chirurgia è relativamente semplice, abbiamo trovato che ci sono diversi passaggi che potrebbero richiedere la risoluzione dei problemi. Il primo è che la punta vibra produce un sacco di turbolenza in ACSF, che diminuisce la visibilità e produce difficoltà nell'accertare la profondità dell'osso dell'osso assottigliamento passo della chirurgia. È consigliabile che se è troppo difficile vedere quanto l'osso è sottile, prenditi una pausa per asciugare il cranio e la finestra applicando un tampone di cotone sterile al lato dell'osso. Non applicare il tampone di cotone direttamente alla finestra, dal momento che la superficie ruvida è dannoso per osso sottile. Dopo aver controllato la profondità, è necessario riapplicare ACSF e continuare con la chirurgia. Abbiamo anche trovato che se c'è danno al dura, è solitamente dovuto il chirurgo mettere troppa pressione sulla punta. Tenendo il manipolo più delicatamente e applicare meno forza probabilmente risolverà questo problema. Se il chirurgo è forzatamente raschiando la punta sull'osso, esso causerà una pausa nell'osso sottile e danneggiare il cranio. Infine, se dopo aver assottigliamento dell'osso, il sottostante dura contuso, è probabilmente dovuto il calore in eccesso dalle vibrazioni. Aumento del tasso di flusso ACSF risolverà questo problema.
La limitazione principale di FASORE è che il manipolo può sottile dell'osso, ma non è possibile rimuovere tutte le ossa sopra la dura madre. La punta rivestita di diamante ha piccoli urti ruvide. Lo sfregamento serviva per fluidificare il cranio sarebbe carteggiare la dura madre e causare sanguinamento se esso venisse utilizzato per rimuovere tutte le ossa. Così, per rimuovere lo strato sottile restante è necessaria l'applicazione del forcipe. Mentre ci è dibattito continuo su se la formazione immagine attraverso un cranio sottile produce meno proliferazione di microglia e astrociti reattivi e meno infiammazione, in alcuni casi una finestra con nessun osso restante è preferita, ad esempio, per fornire una maggiore profondità di imaging3 .
Abbiamo ottimizzato la preparazione di finestra cranica per multiphoton imaging in topi. FASORE è, a nostra conoscenza, la prima applicazione della tecnica piezoelettrica per chirurgia cranica roditore finestra per imaging ottico. Troviamo che l'uso della chirurgia piezoelettrica in topi condivide i vantaggi di velocità aumentata e diminuita eventi avversi segnalati anche in esseri umani7,8,9,10. L'utilizzo del dispositivo piezoelettrico è provocato da interventi chirurgici più veloce (Figura 2A) e meno eventi avversi di sanguinamento rispetto ad una rotativa ad alta velocità trapano (Figura 2B). Abbiamo anche trovato, all'interno del nostro laboratorio, che FASORE era più facile per i chirurghi di nuovi da imparare rispetto agli approcci tradizionali alla chirurgia cranica finestra. Vantaggi di velocità e facilità d'uso sono probabilmente diverse fra i chirurghi. Preparazioni di cranio sottili richiedono in genere 30-45 min per fluidificare l'osso con un trapano e bisturi2, mentre l'approccio FASORE richiede in genere meno di 10 min.
Abbiamo trovato che in windows preparata con FASORE potremmo immagine transitori di calcio nei neuroni piramidali di livello 4 nella corteccia di motore che era stato transfected con virus adeno associato codifica l'indicatore di calcio JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). Inoltre abbiamo trovato che, rispetto a una finestra cranica cranio sottile preparata con un trapano rotativo e bisturi, l'imaging regione era più grande, mentre un cranio sottile preparato con un trapano rotativo e bisturi ha una finestra di imaging 20 µm di diametro2 . Con FASORE, siamo stati in grado di sottile rapidamente un'area di 3-4 mm. Questo è simile alla finestra di imaging segnalata con porte4. Questa finestra più grande conserva il vantaggio della rappresentazione rapida segnalato per windows cranio sottile preparata con un trapano odontoiatrico e bisturi. Inoltre, la finestra preparata con FASORE può essere imaged immediatamente, al contrario di rimozione dell'osso tradizionale windows che può richiedere settimane per guarire prima che la finestra può essere ottimamente ripreso3.
Questa tecnica può essere applicata per lo studio delle alterazioni del flusso sanguigno nei vasi sotto la dura madre. Un importante studio futuro è quello di confrontare il immunoreactivity di FASORE con altri metodi di finestra cranica. Questo sarebbe importante per determinare se il FASORE produce meno infiammazione rispetto a metodi esistenti. Ci auguriamo che la tecnica chirurgica piezoelettrica documentata qui permetterà altri labs eseguire windows cranica e utilizzare correttamente multifotonica imaging in vivo.
Assicurarsi che il manipolo è impostato a vibrare l'impostazione più bassa e che il ACSF è essere irrigato a una velocità costante. Il freddo di ghiaccio che ACSF deve essere applicato costantemente o si sarà riscaldare e danneggiare la dura madre. Abbiamo trovato che ACSF deve essere applicato a una velocità di almeno 1 mL/min. utilizzare una siringa tenuto in mano, o utilizzare una pompa peristaltica, piuttosto che l'irrigazione integrato nel manipolo. Il sistema di irrigazione nel manipolo espelle ACSF con troppa forza e produce troppa turbolenza, che significativamente alterare la visibilità.

Chirurgia cranica finestra per prepararsi roditori multifotonica imaging in vivo è diventata un'importante tecnica nell'ambito delle neuroscienze. La rimozione o l'assottigliamento dell'osso è necessario preparare il mouse per imaging ottico con un microscopio multifotonica. Questa chirurgia è eseguita rimuovendo completamente un'area dell'osso per esporre la sottostante dura1o fluidificando una regione dell'osso senza rimozione completa dalla dura2. L'approccio di cranio sottile può produrre meno infiammazione e attivazione della microglia3 ma fornisce una profondità minore di imaging, una dimensione di finestra di imaging più piccola (200 µm) e un periodo di tempo limitato durante il quale la finestra può essere imaged a causa di ricrescita ossea2 . L'aggiunta di una finestra di vetro lucido e rinforzato (porte) può aumentare le dimensioni imaging e il periodo di formazione immagine, ma è difficile da eseguire4.
Entrambi gli interventi attuali utilizzano un trapano rotativo ad alta velocità per sottile o rimuovere l'osso dal cranio. La tecnica di cranio sottile utilizza anche un bisturi dopo il trapano per fluidificare ulteriormente l'osso2. La tecnica di porte richiede il passaggio aggiuntivo di alta velocità di lucidatura con grana4. In un'alta velocità trapano rotativo, un'aria alimentata turbina o motore elettrico fa sì che la punta del trapano a girare ad alta velocità. Come Trapani rotativi sezione sia dell'osso che dei tessuti molli, esiste un rischio di danneggiare la dura madre e dei vasi sanguigni di fondo. Il successo della chirurgia dipende dalla abilità del chirurgo. Oltre a queste finestre preparate con metodi chirurgici meccanici, un metodo chimico di otticamente il cranio con diverse soluzioni di compensazione è stato sviluppato5,6. Tuttavia, poiché la chirurgia piezoelettrica è un metodo meccanico di chirurgia, nostri confronti qui sarà limitati ad altri metodi meccanici.
Dispositivi chirurgici piezoelettrici utilizzano vibrazioni ultrasoniche per abbattere osso mineralizzato senza danneggiare tessuti molli sottostanti e quindi offrono un approccio per sottile rapidamente una vasta area dell'osso. In un manipolo chirurgico piezoelettrico, la turbina è sostituita da una pila di dischi ceramici e quando viene applicata la corrente, i dischi vibrano a frequenze ultrasoniche. Le vibrazioni vengono trasferite attraverso il manipolo a diamante rivestiti suggerimenti per tagliare attraverso l'osso senza danneggiare tessuti molli, un vantaggio su Trapani rotativi che non discriminano tra i tipi di tessuto. La chirurgia piezoelettrica è stato originariamente sviluppata per l'uso nell'uomo di Tomaso Vercellotti e ha portato a miglioramenti nel dentale e cranio-maxilofacial chirurgia7,8,9,10,11 .
La chirurgia piezoelettrica è stata utilizzata per creare un'osteotomia in ratti Wistar e fu trovata da formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) e l'istologia per produrre molti meno danni rispetto a un tradizionale trapano odontoiatrico12. Gli autori hanno concluso che la chirurgia piezoelettrica era sicura per la rimozione dell'osso vicino tessuto cerebrale morbido. Mouse, tuttavia, hanno una dura più sottile che è danneggiato più facilmente, e che lo studio non si prepara windows per imaging ottico cronica. Formazione immagine cronica richiede che i vasi sanguigni non siano danneggiati e che non formano coaguli di sangue sotto la finestra. Danni al dura conducono ad infiammazione che causa la finestra verso il cloud, e attiva le microglia e la proliferazione di astrociti reattivi. Qui abbiamo ottimizzato la chirurgia piezoelettrica per topi creare sia sottile teschio e ossa completo cranica windows rimozione adatto per l'imaging cronica. Abbiamo confrontato questa tecnica chirurgica agli ambulatori cranica finestra preparato con un trapano rotante ad alta velocità.

<table><tbody><tr><td>Piezosurgery Touch</td><td>Mectron</td><td>5120062</td><td>Il modello Piezosurgery GP ha le stesse impostazioni</td></tr><tr><td>Punta piezochirurgica piatta circolare da 4 mm (# OT11)</td><td>Mectron</td><td>3370019</td><td>Questa punta era ideale per le nostre finestre, ma sono disponibili molte altre punte di diverse dimensioni.</td></tr><tr><td>Telaio stereotario</td><td>Kopf</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per mouse</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica per irrigazione.</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-77120-42</td><td>Facilita l'irrigazione e libera l'altra mano per fornire stabilità. L'irrigazione può essere eseguita a mano con una siringa, se necessario.</td></tr><tr><td>Avitene Ultrafoam</td><td>Bard-Davol</td><td>1050020</td><td>Importante per fermare immediatamente qualsiasi sanguinamento minore.</td></tr><tr><td>C& B Metabond</td><td>Parkell</td><td>S380</td><td>Molto più resistente del normale acrilico dentale.</td></tr><tr><td>Liquido cerebrospinale artificiale (ACSF)</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Puralube unguento oftalmico</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Topi</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Prairie Ultima microscopio multifotone</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td><td>UPENN Nucleo</td><td></td><td></td> vettoriale</tr></tbody></table>

piezo alta precisione d'ossa e la rimozione chirurgica (phasor): una tecnica di chirurgia finestra cranica migliorata in topi

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

La microscopia multifotonica è stato ampiamente adattata per l'imaging di neuroni in vivo. Formazione immagine ripetuta richiede l'impianto di una finestra cranica o ripetute assottigliamento del cranio. Chirurgia cranica finestra viene in genere eseguita con un trapano rotante ad alta velocità, e molti ricercatori trovano stimolante per impedire che il trapano danneggiare il delicato dura e vasi sanguigni. Vasto e la pratica è necessaria per rimuovere l'osso senza danneggiare i tessuti sottostanti e quindi chirurgia cranica finestra può essere difficile, che richiede tempo e produrre danni ai tessuti. La chirurgia piezoelettrica, che viene ampiamente utilizzata per la chirurgia maxillo-facciale e dentale, utilizza le vibrazioni ad ultrasuoni per rimuovere l'osso senza danneggiare i tessuti molli. Abbiamo sviluppato un metodo applicando la chirurgia piezoelettrica per migliorare la chirurgia cranica finestra nei topi in preparazione per l'imaging multiphoton. Confronti all'interno del nostro laboratorio di trovano che il metodo richiede meno tempo di chirurgia e ha un tasso medio più basso delle complicazioni dovuto spurgo dural rispetto alla chirurgia cranica finestra con un trapano rotativo.

Prima di procedere con la chirurgia piezoelettrica, rimuovere qualsiasi residuo periostio dal cranio. Una volta che il cranio è opaca e liscia (Figura 1a), il chirurgo può iniziare la chirurgia piezoelettrica. Durante la rimozione dell'osso con la punta piezo vibrante, è fondamentale per irrigare il cranio con il ghiaccio freddo ACSF. Corretta irrigazione è raggiunto quando il fondo 1 mm della punta è sommerso in ACSF (Figura 1b). Senza irrigazione adeguata, l'osso sarà surriscaldare e danneggiare il cervello. Dopo il cranio è stato assottigliato fino alla profondità desiderata, scelta dal chirurgo, ci potrebbe essere qualche residuo sanguinamento da vasi sanguigni situati nell'osso. Al fine di cessare rapidamente tutte le emorragie, applicare un pezzo piccolo di 1 mm di schiuma di collagene imbevuto di ACSF per l'area della finestra. Lasciate che il collagene sedersi sul cranio per circa 30 s (Figura 1C). Dopo la rimozione della schiuma di collagene, la finestra apparirà traslucida, che permette la chiara visualizzazione dei vasi sanguigni nella dura. La dura madre sarà intatta senza lividi significativi. (Figura 1D). Se la dura madre appaia rossa e infiammata, è probabile a causa di vasi sanguigni rotti da troppa pressione applicata alla punta durante l'intervento chirurgico. Per proteggere la nuova finestra e prepararlo per l'imaging cronica, vetrino coprioggetti devono essere posizionato sull'area. Correttamente applicata vetrino coprioggetti delicatamente si siedono in cima alla finestra e non causerà alcun danno alla zona. Il vetrino coprioggetti devono coprire l'intera finestra. Se il vetrino coprioggetti sono correttamente applicato al cranio, la finestra rimarrà traslucida sotto il vetro. Tutti i vasi sanguigni nella dura sarà ancora visibile (Figura 1e). Dentale acrilico deve essere applicato intorno il vetrino coprioggetti aderire definitivamente alla superficie del cranio. I bordi del coprivetrino vetro devono essere coperti anche in acrilico dentale (Figura 1f).
Abbiamo trovato che la chirurgia piezoelettrica è in genere molto più veloce rispetto a una tradizionale finestra cranica, prendendo circa 10-12 min a chirurgia (Figura 2A). Abbiamo anche scoperto che c'erano meno complicazioni dovuto dura ecchimosi e sanguinamento come osservato dall'occhio (Figura 2B). Una finestra adeguatamente preparata vi permetterà multiphoton imaging di indicatori fluorescenti in neuroni corticali in vivo. Abbiamo scelto di immagine l'indicatore rosso del calcio JRGECO1a in corpi cellulari dei neuroni corticali di livello 4 (Figura 3A-3B). Abbiamo potuto osservare transitori del calcio in questi corpi delle cellule attraverso la finestra preparati utilizzando FASORE.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg"> Figura 1: la chirurgia piezoelettrica. (a) il cranio dopo che è stato preparato correttamente per FASORE. Tutto il tessuto periosteal è stato rimosso, lasciando una superficie liscia e pulita. (b) un'immagine rappresentativa del FASORE in corso. Parte inferiore 1 mm di vibrante punta chirurgica è sommerso in ghiaccio freddo ACSF. Il fluido viene applicato al cranio ad un tasso di 1 mL/min. Un leggero movimento circolare viene applicato al cranio e l'osso è assottigliata tramite vibrazioni ultrasoniche. (c) dopo il cranio è stato assottigliato, un pezzo circolare di 1 mm di schiuma di collagene bagnato freddo che ACSF si lascia riposare sulla finestra per interrompere qualsiasi micro sanguina dall'osso. (d), una finestra di successo con una dura traslucido vengono visualizzati tutti i vasi sanguigni intatti. Non c'è nessun danno visibile o ecchimosi sulla superficie del cervello. (e) un vetrino coprioggetti è posizionato sopra la finestra per proteggere la superficie del cervello. (f) dentale acrilico viene applicato al cranio per risolvere definitivamente il vetrino coprioggetti sopra la finestra. Scala bar 1 mm in tutte le immagini.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg"> Figura 2. Confronto del tasso di successo nella formazione per FASORE o dentali trapano chirurgia. (A) tempo medio per la chirurgia era inferiore per FASORE interventi chirurgici dentali del trivello (p < 0,05, due test t munito) n = 30 ambulatori per gruppo e media 10 interventi al chirurgo. (B) la percentuale di successo interventi chirurgici (definito come nessun danno visibile o sanguinamento al dura, come osservato dall'occhio del chirurgo attraverso l'obiettivo fissato a 350 zoom) era superiore per FASORE interventi chirurgici dentali del trivello (n = 30 ambulatori per ogni gruppo, uno test z munito). Barre di errore indicano SD
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg"> Nella figura 3. Imaging in vivo attraverso una finestra cranica multifotonica diluito con FASORE. (A) calcio transitori osservati con l'indicatore rosso del calcio JRGECO1a erano imaged in neuroni piramidali di livello 4 nella corteccia motoria murino in vivo. Barra della scala = 100 µm. (B), la stessa finestra ma diversa regione della corteccia di motore di livello 4. Headfixed mouse con finestra di 3mm preparato con FASORE. Barra della scala = 30 µm. Imaged con un microscopio multifotonica, obiettivo 40x, 1040 nm lunghezza d'onda di eccitazione.

Chirurgia piezoelettrica ha portato a miglioramenti in chirurgia maxillo-facciale e dentale umano. Abbiamo sviluppato un protocollo per ottimizzare la chirurgia piezoelettrica per chirurgia cranica finestra nei topi.

Piezo alta precisione d'ossa e la rimozione chirurgica (PHASOR): Una tecnica di chirurgia finestra cranica migliorata in topi

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

L'obiettivo generale di questo intervento chirurgico è assottigliare il cranio senza danneggiare i tessuti sottostanti e impiantare una finestra cranica adatta all'imaging. Questo metodo rappresenta un miglioramento rispetto alla chirurgia della finestra cranica e potrebbe consentire a un numero maggiore di chirurghi di eseguire tale tecnica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette interventi più brevi con una minore incidenza media di complicanze.Prima di iniziare l'intervento chirurgico, assicurarsi che tutti gli strumenti da utilizzare siano stati sterilizzati in autoclave per garantire l'asepsi. Anestetizzare il topo con isoflurano. Applicare un lubrificante oftalmico veterinario sugli occhi per prevenire l'essiccazione.Poi, pizzicare l'alluce posteriore per verificare la corretta profondità dell'anestesia. Successivamente, rimuovere i peli del cuoio capelluto applicando per tre minuti un gel depilatorio. Quindi, posizionare il topo anestetizzato nel telaio stereotassico su un tappetino riscaldante o su una coperta riscaldata con circolazione d'acqua regolata a 38 gradi Celsius.Assicurarsi che la maschera per l'anestesia sia posizionata correttamente. Somministrare buprenorfina per via sottocutanea per fornire analgesia preoperatoria. Quindi, disinfettare il cuoio capelluto con tre applicazioni alternate di clorexidina o Betadine e alcol al 70% utilizzando un applicatore con estremità di cotone.Infine, iniettare 100 microlitri di bupivacaina diluita al 50% in soluzione salina sotto il cuoio capelluto per fornire anestesia locale. Fissare una punta circolare sterile di quattro millimetri all'attacco dello strumento dell'unità per chirurgia piezoelettrica. La dimensione maggiore della punta contribuisce alla velocità dell'intervento chirurgico, poiché l'intera finestra può essere assottigliata contemporaneamente.Impostare l'unità di chirurgia piezoelettrica sulla vibrazione al livello più basso, poiché impostazioni più elevate potrebbero rompere i vasi sanguigni a causa di vibrazioni intense. Riempire una siringa da 10 millilitri con ACSF ghiacciato e tenerla in mano non impugnando il manipolo piezoelettrico. Applicare delicatamente la punta chirurgica vibrante al cranio con un leggero movimento circolare e assottigliare l'osso alla profondità desiderata per eseguire una preparazione a cranio sottile.Irrigare il cranio per evitare il surriscaldamento causato dalle vibrazioni ad alta frequenza, lasciando gocciolare l'ACSF dalla siringa sul cranio a un ritmo di un millilitro al minuto. Regolare delicatamente l'angolo dello strumento e modificare l'angolo della punta applicando pressione sul cranio per assottigliare il cranio in modo uniforme. Prestare attenzione a non assottigliare eccessivamente una singola sezione della finestra.Assicurarsi di regolare delicatamente l'angolo della manopola per assottigliare uniformemente il cranio. Controllare regolarmente il cranio per evitare di rimuovere troppo osso e danneggiare il tessuto sottostante. Posizionare un pezzo di spugna emostatica al collagene di un millimetro, inzuppato di ACSF freddo, sulla dura esposta.Lasciarlo agire sulla dura per circa 30 secondi per impedire lo sviluppo di microemorragie. Dopo aver posizionato lateralmente un coprioggetto di vetro di quattro millimetri sulla finestra sottile, utilizzare il retro di un piccolo applicatore in plastica o legno con estremità di cotone per applicare circa una goccia di colla cianoacrilica all'angolo della finestra. Usare quindi le punte delle pinzette per assicurarsi che il coprioggetto formi una sigillatura con il cranio.Infine, aggiungere 100 microlitri di acrilico dentale sul cranio per fissare il vetro di copertura. Mentre l'acrilico dentale è ancora morbido, utilizzare la punta di un bastoncino di legno rotto per rimuovere qualsiasi eccesso di acrilico che ostruisca la finestra di imaging. Al termine, rimuovere il topo dall'apparato chirurgico e collocarlo in una gabbia riscaldata per il recupero.Monitorare in continuazione fino a quando il topo ha riacquistato pienamente coscienza, valutata mediante mobilità, andatura e comportamento normali. Valutare gli animali due volte al giorno per tre giorni per rilevare segni di dolore post-operatorio, inclusi riduzione dell'attività, della toeletta, del consumo di cibo e acqua, comportamento di protezione o aumento dell'aggressività. Somministrare buprenorfina per via sottocutanea come analgesico dalle otto alle dodici ore dopo l'intervento chirurgico per tre giorni, come approvato nel nostro protocollo IACUC.Monitorare l'area della finestra per deiscenza, infiammazione e segni di infezione. Le transitorietà del calcio osservate con l'indicatore rosso del calcio jRGECO1a sono state immaginate nei neuroni puri del quarto strato della corteccia motoria di un topo con la testa fissata, mediante una finestra di tre millimetri preparata con PHASOR. Questa immagine è stata acquisita attraverso la stessa finestra, ma mostra una regione diversa del quarto strato della corteccia motoria.Come mostrato qui, il tempo per intervento chirurgico è risultato inferiore per il PHASOR rispetto agli interventi con trapano dentale, con significatività statistica indicata da P minore di 0,05 mediante un test T a due code. La percentuale di interventi chirurgici riusciti, definiti come assenza di sanguinamento o danni visibili alla dura, è risultata maggiore per il PHASOR rispetto al trapano dentale, valutata mediante un test Z a una coda. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 10 minuti se realizzata correttamente.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire diverse metodiche di imaging in vivo, inclusa l'immagine a fotoni multipli, per visualizzare i neuroni in vivo. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Piezo alta precisione d'ossa e la rimozione chirurgica (PHASOR): Una tecnica di chirurgia finestra cranica migliorata in topi

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