Name: Semplice eliminazione di fluorescenza di fondo nel tessuto cerebrale umano formalina per microscopia di immunofluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 31 s
Description: Scopri come eliminare l'autofluorescenza di fondo nel tessuto cerebrale umano mediante fotobleaching con una lampada LED commerciale. Questo metodo economico migliora la chiarezza dei risultati di immunofluorescenza senza introdurre composti esogeni.

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Questo studio è stato sostenuto in tutto o in parte dal consorzio canadese di neurodegenerazione e invecchiamento (CCNA), l'Istituto canadese di Health Research (CIHR), la società di ALS del Canada (Canada ALS) e la società di Alzheimer del Canada (ASC). Gli autori vorrei ringraziare Luca Sultan e Andrew Reid della Maritime cervello tessuto banca per fornire tessuti cerebrali FTLD, Giordano di Milano dal programma del Targeting spazio-temporali e amplificazione della radiazione risposta (STTARR) e suoi affiliati agenzie per il tessuto incorporamento e servizi e l'avanzata ottica microscopia Facility (AOMF) per la fornitura di strumenti di microscopia di sezionamento di finanziamento. Kevin Hadley è ringraziato per la revisione critica del manoscritto.

Nota: il lavoro presentato è stato effettuato in conformità alle norme internazionali, tra cui la conferenza internazionale sull'armonizzazione (ICH), il Consiglio per internazionale organizzazioni di Medical Sciences (CIOMS) e i principi della dichiarazione di Helsinki. Uso di tessuti umani è stato con l'approvazione della University Health Network Research Ethics Board. I campioni di cervello umano sono stati raccolti come parte della banca del tessuto cerebrale marittimo. Al momento della raccolta, il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti.
 1. costruzione di photobleaching apparecchi e soluzioni <ol><li>preparare soluzioni di riserva.
	<ol><li>Preparare 1 L di 1 x soluzione di soluzione fisiologica tamponata stock (1 x TBS) (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7.4) sciogliendo 8,77 g di NaCl e 6,06 g di Tris base in 800 mL di ddH 2 O e regolare il pH a 7.4 utilizzo HCl. portare il volume a 1 L e autoclave. < / li > <li>preparare 10% (stock x 200) sodio azide sciogliendo 1 g di sodio azide in 10 mL di ddH 2 O (10%, 200 x stock).</li>
	</ol></li> <li>Per diapositive di formato standard 1-3, utilizzare una piastra Petri singolo 100 x 100 mm trasparente, quadrato come una camera di diapositiva. Per una camera singola diapositiva, è possibile aggiungere 0,25 mL di Stock in 200 di azoturo di sodio x a 50 mL di 1 x TBS per ottenere una soluzione di TBS azide 0.05%. Pila 2-3 camere di diapositiva verticalmente per elaborare ulteriori diapositive. Preparare un ulteriore 50 mL di soluzione di azide-TBS per ogni camera.</li>
	<li>Creare un'impalcatura per elevare la camera diapositiva tale che una testa della lampada può andare bene sotto.
	Camera di diapositiva di <ol><li>per un 100 x 100 mm, tagliare le aperture nella parte inferiore e i lati di un 100 mm x 100 mm x 30 mm plastica contenitore e invertire il contenitore. Garantire le aperture laterali sono grandi abbastanza per montare una sorgente di luce LED e garantire l'apertura inferiore è abbastanza grande, tale che la luce dalla sorgente di luce raggiunge la camera di campionamento senza impedimento.</li>
		<li>Applicare nastro isolante al patibolo per aumentare l'aderenza tra il patibolo e la camera/benchtop del campione. Utilizzare qualsiasi materiali alternativi per costruire l'impalcatura fintanto che si eleva in modo sicuro la camera di diapositiva senza ostacolare la luce di raggiungere il campione.</li>
	</ol></li> <li>Rimuovere qualsiasi diffusori o plastici opachi dalla lampada di scrittorio che può ostacolare la luce LED raggiungano direttamente il campione (se possibile) e orientare verso l'alto la matrice di LED. Posizionare la camera dell'impalcatura e far scorrere sopra la matrice di LED. Utilizzare una lampada con un collo flessibile per una facile manipolazione.</li>
	<li>Costrutto una cupola riflettente coprire per l'apparato di rivestimento interno di una scatola abbastanza grande da coprire la camera di diapositiva e il patibolo con carta stagnola. Utilizzare una casella di punta di pipetta da 1 mL per una camera singola o un 150 mm x 150 mm x 150 mm cartone per più verticalmente impilati chambers.</li>
</ol> 2. Photobleaching pre-trattamento delle sezioni del tessuto Nota: preparazione di tessuti sezione può variare a seconda dell'origine del tessuto e la fissazione e l'incorporamento di metodi utilizzati. Qui, il tessuto cerebrale (orbitofrontal gyri) da un caso di FTLD-T è stato risolto per ~ 2 giorni in formalina, eseguire attraverso un gradiente di saccarosio, incorporata in OCT e tagliare a µm 10 sezioni spesse utilizzando un criostato.
<ol><li>Freddo º c in un 4 camera, freddo armadietto o frigorifero, orientare la lampada sotto il patibolo e posizionare la camera di campione sul patibolo. Versare 50 mL di soluzione di azide-TBS nel pozzetto di misurazione.</li>
	<li>Submerge tessuto sezioni montate su vetrini standard nella camera di diapositiva contenente azide-TBS usando il forcipe pulito. Per più diapositive, assicurarsi che le diapositive vengono inserite nella camera di un singolo livello.</li>
	<li>Coprire l'apparecchio con la cupola riflettente, accendere la lampada a LED e incubare per 48 ore a 4 ° c.</li>
</ol> 3. Immunofluorescenza <ol><li>a macchiare il tessuto per tau fosforilata usando il colorante di contrasto DAPI e Alexa 488 - e anticorpi secondari coniugati Texas Red, preparare soluzioni per ricupero dell'antigene, la permeabilizzazione, il blocco e la primaria grippaggio dell'anticorpo.
	<ol><li>Preparare 500 mL di ricupero dell'antigene buffer (10 mM acido citrico, acido etilendiamminotetracetico di 2 mM, 0.05% Tween 20; pH 6,2) sciogliendo 0,92 g di acido citrico e 0,37 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in 500 mL di ddH 2 O. regolare il pH a 6.2 con NaOH e aggiungere 0,25 mL di Tween 20.</li>
		<li>Preparare 500 mL di 0.025% Triton X-100 in soluzione TBS (TBS-Triton) aggiungendo 0,125 mL di Triton X-100 a 500 mL 1 x TBS.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 1% albumina di siero bovino (BSA) in TBS (tampone BSA-TBS) sciogliendo 0,1 g BSA in 10 mL di TBS.</li>
		<li>Preparare una soluzione di blocco con l'aggiunta di 0,2 mL di siero di capra normale a 1,8 mL di 1% BSA/TBS.</li>
		<li>Per ogni diapositiva, preparare 150 µ l di soluzione di anticorpo primario (diluizione 1: 100) di pipettaggio 1,5 µ l di anti-phospho-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) anticorpo in 148,5 µ l di 1% BSA-TBS buffer e lasciare sul ghiaccio</li>
	</ol></li> <li>Per eseguire il ricupero dell'antigene, immergere i vetrini photobleached verticalmente in un collettore di diapositiva contenente 25 mL di tampone di ricupero dell'antigene. Fissare il collettore con nastro e/o stringhe tale che il collettore non rientra nel bagno di acqua. Scaldare il collettore in un bagno di acqua a 90 ° c per 30 min e consentire al collector raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti prima di rimuovere le diapositive. Non rimuovere le diapositive immediatamente come essa causerà le sezioni ad asciugarsi.</li>
	<li>Trasferire gli scivoli dal raccoglitore di ricupero dell'antigene in una vaschetta di colorazione riempita con 30 mL di TBS-Triton e lavare le sezioni per 5 minuti su agitatore orbitale con agitazione delicata. Ripetere il lavaggio una volta con fresco TBS-Triton. Stoppino via tampone in eccesso con un panno privo di lanugine e delineare il tessuto con una penna idrofobica. Fare attenzione a non per lasciare le diapositive asciugare.
	<ol><li>Per ogni diapositiva, bloccare il tessuto di pipettaggio 200 µ l di soluzione sul tessuto di blocco e porre il vetrino in una camera umidificata. Costruire la camera inserendo un portavetrini all'interno di una casella di punta della pipetta contenente un tovagliolo di carta bagnato. Incubare a temperatura ambiente per 2 h su una superficie piana. Garantire che la soluzione bloccante copre completamente il tessuto.</li>
	</ol></li> <li>Eliminare la soluzione bloccante tramite aspirazione e pipettare 100-150 µ l di soluzione di anticorpo primario sul tessuto. Assicurare un volume sufficiente di anticorpo è presente e che la sezione sia su una superficie piana per evitare la messa in comune di soluzione di anticorpo ad un lato. Incubare a 4 ° c durante la notte in una camera umidificata.</li>
	<li>Preparare la miscela di anticorpo secondario e il colorante di contrasto DAPI nucleare.
	<ol><li>Per ogni diapositiva, preparare 150 µ l di miscela di anticorpo secondario (diluizioni 1: 100) con l'aggiunta di 1,5 µ l di anti-topo di capra Alexa 488 e 1,5 µ l di anti-topo di capra Texas Red a 147 µ l di BSA-TBS e lasciare sul ghiaccio.</li>
		<li>Preparare 0,1 µ g/mL DAPI colorante di contrasto di diluizione seriale. Mescolare accuratamente la soluzione di riserva e diluire 1 µ l di stock 5 mg/mL DAPI nel 999 di TBS per fare 1 mL di soluzione di 5 µ g/mL. Per ogni diapositiva, diluire 3 µL 5 µ g/mL di soluzione con 147 µ l di TBS a una concentrazione finale di 0.1 µ g/mL. 
		Attenzione: DAPI è un noto agente mutageno e deve essere maneggiato con cura.</li>
	</ol></li> <li>Rimuovere l'anticorpo primario dall'aspirazione. Immergere i vetrini in un vetro colorazione barattolo contenente 30 mL di TBS-Triton e lavaggio per 5 min con miscelazione delicata su agitatore orbitale. Ripetere la fase di lavaggio con fresco TBS-Triton. Stoppino via l'eccesso TBS-Triton e pipettare 100 a 150 µ l di miscela di anticorpo secondario per ogni diapositiva.
	<ol><li>Assicurarsi che il tessuto è completamente coperto dalla miscela dell'anticorpo. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente nella camera umidificata al buio.</li>
	</ol></li> <li>Eliminare la miscela di anticorpo secondario tramite aspirazione e trasferire la diapositiva in un vetro colorazione barattolo contenente 30 mL di TBS (nessun Triton). Lavare per 5 min con miscelazione delicata su agitatore orbitale. Ripetere la fase di lavaggio con TBS. fresco applicare 100 a 150 µ l di colorante di contrasto di 0,1 µ g/mL DAPI a ogni diapositiva e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Trasferire i vetrini di un vetro colorazione barattolo contenente TBS e lavare 3 volte con miscelazione delicata per 5 minuti ciascuno, utilizzando freschi TBS per ogni lavaggio. Tampone in eccesso assente stoppino.</li>
	<li>Applicare 3 gocce di mezzo di montaggio acquoso al tessuto. Usando il forcipe, abbassare delicatamente un coprioggetto in vetro pulito sul tessuto, iniziando con un bordo e lentamente abbassando l'altro bordo per evitare l'intrappolamento di bolle d'aria. Fare attenzione a non per rimuovere il vetrino coprioggetto se imaging immediatamente. In caso contrario, consentire il mezzo di montaggio a secco prima della conservazione a 4 ° c al buio.</li>
</ol> 4. Microscopia a fluorescenza <ol><li>Disabilita la lampada a fluorescenza, il microscopio e il computer e attendere che la lampada si riscaldi per 15 min. posto il tessuto macchiato i vetrini nel tavolino del microscopio di fluorescenza. Utilizzare il campo luminoso immagine per individuare il tessuto a 10 ingrandimenti.</li>
	<li>Applicare una goccia di ddH 2 O sulla superficie del vetrino coprioggetto e utilizzare un obiettivo di 20 x acqua immersione (NA = 1.0). Selezionare la scansione 4-linea aereo media impostazione. Impostare la dimensione del foro stenopeico 1 unità arioso che dà una fetta ottico di ~ 3 micron. Selezionare lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione laser per ogni fluoroforo in tracce separate per il miglior segnale. 
	Nota: Alexa 488: λ ex = 488 nm (laser ad argon) λ em = 493-570 nm; Texas Red: λ ex = 561 nm (laser di DPSS 561 nm), λ em = 601-635 nm; DAPI: λ ex = 405 nm (laser diodo 405), λ em = 410-507 nm.
	<ol><li>Regolare la potenza del laser e di ottenere le impostazioni per ottimizzare l'intensità del segnale per ogni traccia. Raccogliere l'immagine composita e salvare. Utilizzare le stesse impostazioni di laser per confrontare l'intensità di fluorescenza in un'altra diapositiva.</li>
	</ol></li> <li>Per la visualizzazione di intensità di fluorescenza in ogni canale, installare la macro di strumenti profilo RGB per ImageJ 10. Salvare la macro dalla pagina Web come file di testo (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). Selezionare il menu ImageJ plugin - &#62; macro - &#62; installare; Selezionare il file di testo per installare lo strumento di profili RGB.
	<ol><li>Aprire il file di immagine confocale in ImageJ e convertire le immagini composite da 3 pile a RGB procedendo come segue: immagine - &#62; colore - &#62; strumento di canale. Selezionare &#34; composito &#34; dal menu a discesa e controllare tutti i tre canali. Quindi, selezionare immagine - &#62; tipo - &#62; di colore di RGB.</li>
		<li>Selezionare l'icona di strumenti profilo RGB e tracciare una linea attraverso la sezione nell'immagine da profilare. Salvare i dati di intensità come un foglio di calcolo per la stampa.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Med%22%5BJournal%5D)">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).</li>
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<li>Duong, H., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multispectral+LED+array+for+the+reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A multispectral LED array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).</li>
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<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-emitting+diode+flashlights+as+effective+and+inexpensive+light+sources+for+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).</li>
<li>Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+neuropathology+of+frontotemporal+dementia%3A+insights+into+disease+mechanisms+from+postmortem+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies.</a> J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).</li>
<li>Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticobasal+degeneration%3A+a+pathologically+distinct+4R+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy.</a> Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il photobleaching e pre-trattamento dei tessuti descritto in questo manoscritto permette per l'efficace eliminazione di autofluorescenza utilizzando componenti normalizzati. Il protocollo descrive la formazione immagine di immunofluorescenza degli aggregati di tau fosforilata nel tessuto formalina-fisso cervello umano usando anticorpi secondari coniugati a Alexa 488 e Texas Red, con DAPI come una colorazione nucleare. Per applicare il metodo ad altri tessuti, si consiglia di eseguire un pre-trattamento di 48 h photobleac...

Microscopia di fluorescenza usando gli anticorpi proteine specifiche di targeting è abitualmente utilizzata per visualizzare le proteine di interesse nella coltura delle cellule e dei tessuti. È una complicazione importante per l'acquisizione di immagini nitide e definitive in immunofluorescenza autofluorescenza, che può essere causato in modo endogeno in tessuti di mammiferi, di età pigmento lipofuscin e di proteine come collagene ed elastina1, 2. Altre fonti di autofluorescence possono essere introdotto attraverso passaggi di preparazione del campione come aldeide fissazione3. Granelli di lipofuscin, composti principalmente da proteine oxidatively modificata e residui di degradazione dei lipidi, si accumulano nelle cellule longevi con età maggiore di2. Questo provoca difficoltà in imaging postmitotic tessuti come il cervello e muscoli cardiaci o scheletrici, come lo spettro di emissione di fluorescenza del lipofuscin è vasto e variabile, spesso in concomitanza con la lunghezza d'onda di emissione di fluorofori comune utilizzato per 4di etichettatura. Questi fattori rendono la formazione immagine del tessuto di cervello umano da casi di malattie neurodegenerative di manifestazione tardiva come degenerazione lobare frontotemporale (FTLD) particolarmente impegnativo.
Per ridurre l'autofluorescenza, abbiamo messo a punto una tecnica in cui si irradiano le sezioni di tessuto montata con una luce bianca che emettono array di diodi (LED) utilizzando una scrivania della famiglia lampada5. Questa semplice tecnica fornisce un'alternativa alle tecniche che utilizzano chimica quenchers come CuSO4 acetato di ammonio, o commercialmente disponibili tempra coloranti quali Sudan nero B e nero eriocromo T6. Ha anche un significativo risparmio di costi oltre multispettrali LED tecniche photobleaching lampada ed evita le complicazioni e gli artefatti generati da metodi di rimozione di autofluorescenza digitale come spettrale ONU-miscelazione7,8. Fosforo bianco LED hanno un ampio spettro di emissione, ad alta luminosità e basso costo di produzione, che li rende ideali come componente COTS per photobleaching una varietà di cromofori5,9.
In questo protocollo, dimostriamo la costruzione di un apparato di photobleaching utilizzando componenti accessibili e photobleaching di applicare a un caso di tessuto FTLD contenente inclusioni tau-positive (FTLD-T) utilizzando un anticorpo specifico per tau fosforilata. Dimostriamo l'effetto di photobleaching su imaging con etichetta fluorescente anticorpi che impiegano due cromofori comunemente utilizzati: Alexa 488 e Texas Red. L'effetto di photobleaching contro sezioni non trattate o quelli trattati con un quencher chimico commercio sono quantificati e rispetto. Questo pretrattamento photobleaching può essere incorporato in qualsiasi protocollo di colorazione di immunofluorescenza standard per rimuovere autofluorescence in un campione biologico.

<table><tbody><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Filofuro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Caledon Chimica di laboratorio</td><td>1506656</td><td></td></tr><tr><td>Azide di sodio</td><td>BioShop Canada</td><td>SAZ001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 100 mm x 20 mm Piatto Pitri</td><td>Sarstedt</td><td>82.9923.422</td><td>Tutti i componenti di photobleacher possono essere sostituiti in base alla disponibilità</td></tr><tr><td>Lampada da scrivania dimmerabile a LED da 6 W</td><td>DBPower</td><td>DS501</td><td>Tutti i componenti di photobleacher possono essere sostituiti in base alla disponibilità</td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2404</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico&nbsp;( EDTA)</td><td>BioShop Canada</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>BioShop Canada</td><td>SHY700.1</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>Haake Fisons</td><td>K15</td><td></td></tr><tr><td>Collettore di vetrini</td><td>FisherScientific</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo di colorazione</td><td>FisherScientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Bellco Glass</td><td>&nbsp; 7744-08115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7878</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>FisherScientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Aurion</td><td>905.002</td><td></td></tr><tr><td>Penna idrofobica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z672548-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-Tau (Ser202, Thr205) Anticorpo monoclonale (AT8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MN1020</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo di capra, Texas Red-X</td><td>ThermoFisher</td><td>T862</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo secondario anti-topo di capra, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio</td><td>ThermoScientific</td><td>28-600-42</td><td></td></tr><tr><td>Soverslip</td><td></td><td></td><td></td>in vetro</tr><tr><td>confocale Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Software di imaging ZEN 2012 Black Edition 11.0</td><td>Il software Zeiss</td><td>LSM710</td><td>accompagna il microscopio confocale</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>RGB Profile Tools macro</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt</td></tr><tr><td>Quencher chimico commerciale</td><td>Biotum</td><td>23007</td><td></td></tr></tbody></table>

semplice eliminazione di fluorescenza di fondo nel tessuto cerebrale umano formalina per microscopia di immunofluorescenza

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

L'immunofluorescenza è un metodo comunemente utilizzato per visualizzare compartimenti subcellulari e per determinare la localizzazione delle proteine specifiche all'interno di un campione di tessuto. Un grande ostacolo per l'acquisizione di immagini di alta qualità immunofluorescenza è endogeno autofluorescenza del tessuto causato da pigmenti di invecchiamento quali lipofuscin o da processi di preparazione del campione comuni quali fissazione dell'aldeide. Questo protocollo descrive come fluorescenza di fondo può essere notevolmente ridotto attraverso photobleaching utilizzando array di diodi (LED) prima del trattamento di luminescente fosforo bianco con sonde fluorescenti. L'emissione ad ampio spettro di fosforo bianco LED consentono per lo sbiancamento di fluorofori tutta una serie di picchi di emissione. L'apparato di photobleaching può essere costruito da componenti normalizzati a bassissimo costo e offre un'alternativa accessibile a quenchers chimici disponibili in commercio. Un photobleaching di pretrattamento del tessuto seguito da immunofluorescenza convenzionale genera immagini gratis di sfondo autofluorescence. Rispetto stabilito quenchers chimico che ha ridotto la sonda come sfondo segnali, photobleaching trattamento non ha avuto effetto sull'intensità di fluorescenza sonda mentre efficacemente ridotto fluorescenza di fondo e il lipofuscin. Anche se photobleaching richiede più tempo per il pre-trattamento, maggiore intensità LED Array può essere usato per ridurre tempo photobleaching. Questo metodo semplice potenzialmente può essere applicato ad una varietà di tessuti, tessuti particolarmente postmitotic che si accumulano lipofuscin come il cervello e i muscoli cardiaci o scheletrici.

Il passo di pre-trattamento photobleaching può essere aggiunto per un protocollo di immunofluorescenza standard immediatamente prima di ricupero dell'antigene e immunostaining (Figura 1A). Il montaggio dell'apparecchiatura photobleaching può essere eseguito anche utilizzando vari, poco costosi, disponibile immediatamente componenti (Figura 1B). Lo spettro di emissione del fosforo bianco LED copre una vasta gamma di lunghezze d'on...

Sfondo autofluorescenza dei campioni biologici complica spesso tecniche di imaging basata sulla fluorescenza, particolarmente in tessuti postmitotic umani invecchiati. Questo protocollo descrive come autofluorescence da questi campioni possa essere efficacemente rimosse utilizzando una luce disponibile in commercio che emette luce a diodi fonte a photobleach il campione prima della colorazione.

Semplice eliminazione di fluorescenza di fondo nel tessuto cerebrale umano formalina per microscopia di immunofluorescenza

Immunofluorescence is a common method used to visualize subcellular compartments and to determine the localization of specific proteins within a tissue ...

Un problema comune nella microscopia a fluorescenza immunologica è la presenza di fluorescenza di fondo endogena che può interferire con il segnale. In molti casi, questa autofluorescenza può rendere i risultati non interpretabili. In questo protocollo, illustreremo come rimuovere l'autofluorescenza da campioni di tessuto cerebrale umano utilizzando il fotobiancamento con una lampada da tavolo a LED commerciale.I principali vantaggi di questo metodo sono i notevoli risparmi economici rispetto alle tecniche attuali, senza compromettere l'efficacia, e il fatto che nessun composto esogeno viene introdotto nel campione. Prima di iniziare, preparare soluzioni madri di tris-buffered saline al 1x, TBS, e azide di sodio al 10%. Per ogni tre vetrini di dimensioni standard che si desidera processare, sarà necessaria una singola piastra di Petri quadrata da 100 millimetri per 100 millimetri come camera per vetrini.Per ogni camera da vetrino, preparare 50 millilitri di azide 0,05% in TBS aggiungendo 25 millilitri di azide di sodio al 10% a 50 millilitri di TBS 1x. Creare un supporto per sollevare la camera da vetrino in modo che sotto possa essere posizionata la testa di una lampada. Per una p

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Qui si descrive un metodo rapido e semplice per celle di immagine fluorescente in semi-densi fettine di cervello. Fissando, affettare, e otticamente compensazione tessuto cerebrale si descrivono le modalità standard di imaging epifluorescente o confocale può essere utilizzato per visualizzare le singole cellule e reti neuronali all'interno intatto tessuto nervoso.

Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

Microscopio multifotone di organi topo intero è possibile otticamente deselezionando l'organo prima di imaging, ma non tutti i protocolli di preservare il segnale fluorescente di proteine ​​fluorescenti. L'utilizzo di un metodo ottico di compensazione con etanolo a base di disidratazione e alcol benzilico: benzil benzoato di compensazione, mostriamo immagini ad alta risoluzione multiphoton di cervello di topo che esprime tutta la YFP.

Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

Lavare per rimuovere la paraffina, quindi reidratare il tessuto utilizzando concentrazioni di alcol decrescenti.

Rilevamento immunoistologico di agenti patogeni nel tessuto cerebrale

Questo protocollo di livello introduttivo descrive i reagenti, le attrezzature e le tecniche necessarie per completare la colorazione immunoistochimica del cervello dei roditori, utilizzando come esempio marcatori per microglia ed elementi neuronali.

Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni

Qui, forniamo un semplice, a basso costo, e in tempi rapidi protocollo fissiamo chimicamente tessuto cerebrale dei primati con acroleina fissativo, consentendo per la conservazione a lungo termine che è compatibile con pre-embedding immunoistochimica per microscopia elettronica a trasmissione.

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Descriviamo un metodo di colorazione rapida per eseguire l'imaging multispettrale sui tessuti congelati.

Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

Questo protocollo descrive un metodo per combinare l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) e l'immunoistochimica a fluorescenza (IHC) in sezioni cerebrali di topo sia fresche congelate che fisse, con l'obiettivo di ottenere FISH multimarca e segnale IHC di fluorescenza. IHC ha preso di mira le proteine citoplasmatiche e attaccate alla membrana.

Combinazione dell'ibridazione in situ a fluorescenza multiplex con immunoistochimica fluorescente su sezioni cerebrali di topo fresche, congelate o fisse

Questo protocollo descrive un approccio efficiente e riproducibile per gli studi istologici sul cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging.

Immunocolorazione fluttuante del cervello di topo

La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

Il presente protocollo fornisce una procedura passo-passo per la clearing ottica rapida e simultanea, la marcatura multi-round e la ricostruzione volumetrica 3D di decine di sezioni di cervello umano post-mortem combinando la tecnica di trasformazione tissutale corta (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) SHORT con l'imaging al microscopio a fluorescenza a foglio luminoso in un protocollo di routine ad alto rendimento.

Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala

Scopri come eliminare l'autofluorescenza di fondo nel tessuto cerebrale umano mediante fotobleaching con una lampada LED commerciale. Questo metodo economico migliora la chiarezza dei risultati di immunofluorescenza senza introdurre composti esogeni.

Semplice eliminazione di fluorescenza di fondo nel tessuto cerebrale umano formalina per microscopia di immunofluorescenza

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