Semplice eliminazione di fluorescenza di fondo nel tessuto cerebrale umano formalina per microscopia di immunofluorescenza

Un problema comune nella microscopia a immunofluorescenza è la presenza di fluorescenza di fondo endogena che può interferire con il segnale. In molti casi, questa autofluorescenza può rendere i risultati non interpretabili. In questo protocollo dimostreremo come rimuovere l'autofluorescenza da campioni di tessuto cerebrale umano utilizzando il fotosbiancamento con una lampada da scrivania a LED commerciale.

I principali vantaggi di questi metodi sono i significativi risparmi sui costi rispetto alle tecniche attuali senza sacrificare l'efficacia e l'assenza di composti esogeni introdotti nel campione. Prima di iniziare, preparare soluzioni stock di soluzione salina tris-tamponata, TBS e azoturo di sodio al 10%. Per ogni tre vetrini da microscopio di dimensioni standard che si desidera elaborare, sarà necessaria una singola piastra di Petri quadrata da 100 millimetri per 100 millimetri come camera per vetrini.

Per ogni camera di vetrino, preparare 50 millilitri di azide allo 05% in TBS aggiungendo 25 millilitri di azide di sodio al 10% a 50 millilitri di una volta TBS. Creare un'impalcatura per sollevare la camera di scorrimento in modo che la testa della lampada possa essere inserita al di sotto. Per una capsula di Petri quadrata da 100 millimetri, è possibile tagliare un contenitore per alimenti in plastica di dimensioni simili.

È possibile utilizzare tutto ciò che può sollevare in modo sicuro la camera del vetrino senza impedire alla luce di raggiungere i campioni. Acquista una lampada da scrivania a LED al fosforo bianco e rimuovi eventuali diffusori o plastica opaca che coprono la sorgente luminosa. Orientare l'array di LED verso l'alto.

A tale scopo si consiglia una lampada con un collo flessibile. Costruire una copertura a cupola riflettente per l'apparecchio illuminando l'interno di una scatola abbastanza grande da coprire le camere di scorrimento e l'impalcatura con un foglio di alluminio. Per una singola camera, è possibile utilizzare una scatola di puntali per pipette da un millimetro.

Per questo video, il tessuto cerebrale circonico frontale orbitale FTLD-T umano fissato in formalina è stato sottoposto al pretrattamento di fotosbiancamento. Le procedure di preparazione dei tessuti e di colorazione degli ammino possono variare in base alla fonte, alla fissazione e all'inclusione delle sezioni di tessuto. In una cella frigorifera, in una cella frigorifera o in un frigorifero a quattro gradi Celsius, posizionare la lampada sotto l'impalcatura e la camera del campione sopra l'impalcatura.

Riempire la camera del campione con 50 millilitri di azide TBS. Immergere sezioni di tessuto spesse 10 micrometri montate su vetrini da microscopio in vetro standard nella camera del campione utilizzando una pinza pulita. Coprire l'apparecchio con la cupola riflettente e accendere la lampada a LED.

Lasciare sbiancare i campioni per 48 ore. Questo tempo di incubazione può variare, a seconda dell'intensità della lampada e della quantità di materiale autofluorescente nel tessuto. Dopo il pre-trattamento di fotosbiancamento, i vetrini possono essere immunocolorati con un protocollo standard per il tessuto specifico e le proteine di interesse.

A scopo dimostrativo, il tessuto cerebrale FTLD-T è stato colorato per la tau fosforilata utilizzando anticorpi secondari coniugati ad Alexa 488 e Texas Red. Il DAPI è stato utilizzato come controcolorante nucleare. Preparare 500 millilitri di tampone per il recupero dell'antigene, 500 millilitri di Triton X-100 allo 0,025% in TBS, 10 millilitri di albumina sierica bovina all'1%, BSA, in TBS e due millilitri di soluzione bloccante, costituita da siero di capra aggiunto a BSA TBS.

Eseguire il recupero dell'antigene immergendo i vetrini fotosbiancati nel tampone di recupero dell'antigene in un raccoglitore di vetrini. Riscaldare il collettore a 90 gradi Celsius per 30 minuti. Una volta rimosso il collettore dal trattamento termico, è importante lasciare raffreddare la camera a temperatura ambiente per 30 minuti.

La rimozione immediata delle guide causerà l'essiccazione delle sezioni. Prepara la tua miscela di anticorpi primari secondo le raccomandazioni del produttore. In questo caso, l'anticorpo anti-fosfo PHF tau p-serina 202 più treonina 205 AT8 è stato diluito uno su 100 con BSA TBS e lasciato in ghiaccio.

Sono necessari 150 microlitri di miscela di anticorpi per sezione. Dopo che le sezioni si sono raffreddate per 30 minuti, trasferire i vetrini dal raccoglitore di recupero dell'antigene in un barattolo di colorazione riempito con TBS Triton. Lavare i vetrini in questa soluzione per cinque minuti agitando delicatamente.

Svuotare e sostituire il TBS Triton per ripetere questa fase di lavaggio una seconda volta. Dopo il lavaggio, rimuovere i vetrini dal barattolo di colorazione e rimuovere il tampone in eccesso. Usando una penna idrofoba, disegna un contorno attorno al tessuto.

In questo modo si eviterà che le soluzioni fuoriescano dalla diapositiva. Fare attenzione a non lasciare che le diapositive si secchino. Bloccare il tessuto pipettando 200 microlitri di soluzione bloccante sui vetrini e posizionarli all'interno di una camera umidificata.

Questa camera può essere qualcosa di semplice come un rack per vetrini all'interno di una scatola di puntali per pipette contenente un tovagliolo di carta bagnato. Assicurarsi che l'intero campione di tessuto sia coperto con una soluzione bloccante. Incubare a temperatura ambiente per due ore.

Rimuovere la soluzione bloccata con l'aspiratore o la pipetta. Pipettare da 100 a 150 microlitri di miscela di anticorpi primari sui vetrini. Assicurarsi che l'intero campione sia coperto con una soluzione anticorpale e che le sezioni siano mantenute su una superficie piana per evitare ristagni irregolari di anticorpi.

Incubare con anticorpo primario a quattro gradi Celsius per una notte in una camera umidificata. Il giorno successivo, preparare la miscela di anticorpi secondari. In questo caso, l'anti-topo di capra Alexa 488 e l'anti-topo di capra Texas Red sono stati diluiti uno su 100 utilizzando BSA TBS.

Recuperare le sezioni di tessuto e rimuovere la soluzione di anticorpi primari mediante aspiratore o pipetta. Lavare i vetrini due volte in modo simile a quanto fatto in precedenza utilizzando un barattolo di colorazione riempito con TBS Triton per cinque minuti a ogni lavaggio. Dopo il lavaggio, rimuovere il tampone in eccesso.

Pipettare da 100 a 150 microlitri di soluzione di anticorpi secondari, assicurandosi ancora una volta che il campione di tessuto sia completamente coperto. Incubare per due ore a temperatura ambiente nella camera umidificata al buio. Preparare un colorante di contrasto DAPI da 0,1 microgrammi per millilitro in TBS secondo le raccomandazioni del produttore o la diluizione seriale.

Assicurarsi di mescolare accuratamente la soluzione madre DAPI a causa della possibile insolubilità. Recuperare i vetrini e rimuovere la miscela di anticorpi secondari. Lavare i campioni due volte, ma invece di utilizzare TBS Triton, utilizzare TBS semplice.

Aspirare o pipettare la soluzione di lavaggio rimanente e pipettare da 100 a 150 microlitri di colorante DAPI sulle sezioni di tessuto. Incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti. Recupera i campioni e lava tre volte con TBS semplice invece di due.

Dopo il lavaggio, rimuovere con cura la soluzione di lavaggio rimanente. Applicare il mezzo di montaggio. Completare il montaggio del vetrino coprendo i campioni con vetrini di copertura.

Evitare la formazione di bolle posizionando un bordo del vetrino di copertura verso il basso e abbassando molto lentamente il bordo opposto con una pinza. Lasciare asciugare il supporto di montaggio prima di riporlo a quattro gradi Celsius al buio. Le diapositive sono ora pronte per essere visualizzate.

Le impostazioni per la microscopia a fluorescenza variano a seconda dei fluorofori utilizzati per la colorazione e del microscopio. Accendi la lampada a fluorescenza, il microscopio e il computer e lascia che la lampada si riscaldi per 15 minuti. Posizionare i vetrini di tessuto colorati nel microscopio a fluorescenza.

Usa il campo chiaro per localizzare il tessuto a un ingrandimento di 10 volte. Una volta individuata una regione di tessuto adatta, aggiungere una goccia d'acqua sopra il vetrino coprioggetto del campione. Passa a una lente a immersione in acqua 20x.

Selezionare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione del laser appropriate per ciascun fluoroforo in tracce separate per ottenere il miglior segnale. Ulteriori dettagli sulle impostazioni e sulle lunghezze d'onda utilizzate sono disponibili nel manoscritto allegato. Regola le impostazioni di potenza e guadagno del laser per ottimizzare l'intensità del segnale per ogni traccia.

Una volta trovate le impostazioni e il campo visivo appropriati, salvare un'immagine composita contenente i dati di fluorescenza di ciascuna traccia. Per visualizzare l'intensità della fluorescenza in ciascun canale, installare la macro RGB Profile Tools per ImageJ. Apri il file immagine confocale lsm in ImageJ e converti le immagini composite dalle tre pile in RGB andando su Strumento Immagine, Colore, Canale.

Selezionare Composito e selezionare tutti e tre i canali. Quindi, vai su Immagine, Tipo e Colore RGB. Selezionate l'icona Strumenti profilo RGB e tracciate una linea attraverso la sezione dell'immagine da profilare.

In questo video sono stati descritti i passaggi per eseguire un pretrattamento di fotosbiancamento di campioni di tessuto per produrre fluorescenza di fondo. Questa procedura può essere aggiunta a qualsiasi protocollo standard di fluorescenza amminica prima del recupero dell'antigene e della colorazione amminica. L'apparecchio utilizzato per il fotosbiancamento è economico e facilmente reperibile, costituito da componenti standard.

I LED al fosforo bianco emettono luce su un ampio spettro di lunghezze d'onda, il che li rende particolarmente adatti per il fotosbiancamento ad ampio raggio. Utilizzando una lampada da tavolo a LED facilmente reperibile, i campioni di tessuto cerebrale FTLD-T umano non colorato sono stati fotosbiancati e sottoposti a imaging utilizzando le lunghezze d'onda che sarebbero appropriate se questi campioni fossero stati colorati con Texas Red e Alexa 488. I campioni non trattati hanno mostrato grandi quantità di autofluorescenza.

Al contrario, il fotosbiancamento ha comportato una riduzione significativa dell'intensità delle macchie di autofluorescenza che assomigliavano alla lipofuscina, nonché una generale fluorescenza di fondo. Per un'ulteriore convalida di questa tecnica, i campioni di tessuto cerebrale FTLD-T sono stati colorati per la tau iperfosforilata, una proteina che si ripiega e si accumula erroneamente in questa malattia come corpi di inclusione distinti. Sono stati applicati due diversi anticorpi secondari per distinguere meglio tra marcatura tau e fluorescenza non specifica.

In queste immagini composite, la colocalizzazione di Alexa 488 e Texas Red è mostrata in giallo, che rappresenta la proteina tau correttamente colorata. La comparsa di regioni rosse o verdi indica una fluorescenza non specifica o un quenching di uno dei cromofori. Nel campione di controllo non trattato, si può osservare un significativo segnale di fondo e non specifico, in particolare nel canale rosso del Texas.

Sia il pretrattamento di fotosbiancamento che l'applicazione di un quencher chimico determinano una riduzione del segnale di fondo. Se dividiamo i canali di fluorescenza e osserviamo le immagini con un ingrandimento maggiore, è possibile effettuare osservazioni più dettagliate. Il controllo non trattato possiede una fluorescenza di fondo su tutti i canali, nonché caratteristiche non specifiche, principalmente nel canale rosso del Texas, che hanno un'intensità simile alla marcatura specifica della tau.

Se i corpi di inclusione tau non avessero avuto una morfologia distinta e prevedibile, questi risultati del rosso del Texas avrebbero potuto essere interpretati erroneamente a causa della presenza di queste caratteristiche autofluorescenti. Il pretrattamento di fotosbiancamento abolisce completamente queste caratteristiche non specifiche del Texas Red, preservando la maggior parte dei segnali specifici del Texas Red e di Alexa 488. Il fotosbiancamento, tuttavia, sembra avere scarso effetto sulla fluorescenza di fondo DAPI.

Il quencher chimico ha ridotto la fluorescenza di fondo nel canale Alexa 488 con la stessa efficacia del photobleaching. Tuttavia, ha anche ridotto le intensità di fluorescenza sia del DAPI che del Texas Red, suggerendo la presenza di un certo quenching controproducente. La quantificazione di questi effetti può essere vista nei profili dei segnali.

Come puoi vedere, questo metodo produce immagini pulite prive di caratteristiche confondenti. Questo pretrattamento di fotosbiancamento può essere incorporato in qualsiasi protocollo standard di amminofluorescenza per rimuovere l'autofluorescenza e generare risultati inequivocabili e di alta qualità.