Una metodologia Standard per esaminare in loco mutagenicità in funzione della mutazione di punto riparazione catalizzata da CRISPR/Cas9 e SsODN in cellule umane

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di delineare un approccio fondamentale in una metodologia dettagliata per misurare l'eterogeneità genetica nel sito bersaglio in modo affidabile e robusto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'editing genetico, come ad esempio come analizzare e misurare la mutagenesi in loco. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di una metodologia standardizzata per la riparazione diretta dall'omologia o la correzione genica utilizzando oligonucleotidi a singolo filamento.

Per iniziare il protocollo, coltivare HTT11619 cellule in 25 millilitri di terreno precedentemente preparato per la coltura di cellule HTT116 in un pallone T-175. Aspirare il terreno e lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato di dulbecco o PBS, senza calcio e magnesio, quindi aspirare il PBS. Quindi, aggiungere la tripsina goccia a goccia al pallone T-175, utilizzando una pipetta da cinque millilitri.

Lasciare che le cellule si stacchino in un'incubatrice. Picchiettare il pallone per rimuovere le cellule, quindi spegnere le cellule con gli otto millilitri di terreno completo su tutta la superficie del pallone. Quindi pipettare la miscela su e giù più volte per rompere i grumi di cellule e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri.

Prima di far girare le cellule, prelevare 10 microlitri dal tubo conico da 15 millilitri e combinarlo con 10 microlitri di blu di tripano per contare le cellule, quindi pellettare le cellule. Trasferire 10 microlitri di cellule mescolate con blu di tripano nell'emocitometro e contare le quattro griglie intorno all'esterno. Per ogni piastra di 10 centimetri di cellule da sincronizzare, aggiungere cinque millilitri di terreno completo e sei micromolari di afidicolina.

Quindi, trasferire 100 microlitri di pellet di cella ri-sospeso su ciascuna piastra centimetrica e agitare delicatamente la piastra per mescolare. Incubare le piastre per sincronizzare le cellule al bordo G1S. Quattro ore prima del targeting, aspirare il terreno, lavare con PBS.

Aspirare il PBS e aggiungere cinque millilitri di terreno completo. Rimettere la piastra nell'incubatrice per quattro ore. Inserisci la sequenza genica mutante EGFP nel generatore online di Zane Labs e scegli le sequenze guida CRISPR che si legano in prossimità del sito bersaglio.

Mescolare l'RNA in concentrazioni molari uguali a 45 micromolari. Aggiungere 6,75 microlitri di 200 micromolari di RNA CR e 6,75 microlitri di 200 micromolari di RNA tracciante a una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere 16,50 microlitri di tampone IDT per ottenere un volume finale di 30 microlitri.

Quindi, scaldare la miscela a 95 gradi Celsius per cinque minuti, in una macchina per PCR. Lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente. Per ogni campione, diluire 2,22 microlitri di RNA CR in RNA tracciante e 2,78 microlitri di tampone IDT fino a un volume finale di cinque microlitri.

Diluire 1,67 microlitri di proteina Cas9 da un ceppo da 60 micromolari in 3,33 microlitri di terreno a basso contenuto di sieri, fino a un volume finale di cinque microlitri. Mescola cinque microlitri di proteina Cas9 con cinque microlitri di RNA complesso. Aspirare il terreno, lavare con cinque millilitri di PBS.

Aspirare il PBS e aggiungere un millilitro di tripsina preriscaldata a ciascuna piastra da 10 centimetri. Metti le piastre nell'incubatrice. Successivamente, picchiettare sulla piastra da 10 centimetri per assicurarsi che tutte le cellule siano state rimosse e quindi spegnerle con quattro millilitri di terreno completo, disperdendolo su tutta la superficie della piastra.

Pipettare su e giù più volte per rompere i grumi di cellule e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Mettere da parte 10 microlitri dal tubo conico da 15 millilitri e combinarli con 10 microlitri di blu di tripano per contare le cellule. Pellettare le celle centrifugando per cinque minuti a 125 x G a temperatura ambiente.

Aspirare il terreno e lavare con cinque millilitri di PBS. Pelare le celle centrifugando 125 x G per cinque minuti a temperatura ambiente. Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare in ciascuna cuvetta elettroporazione con gap di quattro millimetri.

Aggiungere 10 microlitri del complesso RNP a 100 microlitri di cellule, a una densità di 5 x 10 alla quinta cellula. Aggiungere due ODN micromolari a ciascun campione. Quindi, portare il rack a una macchina per elettroporazione.

Sbattere leggermente ciascuno dei campioni e posizionarli nella camera. Riposizionare il rack nella cappa e trasferire ogni campione in un pozzetto contenente due millilitri di terreno completo in una piastra a sei pozzetti. Incubare la piastra prima di controllare i livelli di correzione.

Aspirare il terreno e lavare le cellule con due millilitri di PBS. Sostituire il PBS con 500 microlitri di tripsina preriscaldata in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Posizionare le piastre nell'incubatrice.

Quindi, picchiettare la piastra per assicurarsi che tutte le cellule siano state rimosse e quindi spegnere con un millilitro di terreno completo disperdendolo su tutta la superficie del pozzetto. Passare le celle in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri e pellettare. Dopo aver pellettato le cellule, aspirare il terreno, quindi risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone FACS.

Elettroporare le cellule HTT11619 sincronizzate e rilasciate a una concentrazione di 5 x 10 alla quinta cellula per 100 microlitri, con il complesso RNP a 100 picomoli e 100 picomoli di 72 NTODN a 2,0 micromolari. Trasferire le cellule in una piastra a sei pozzetti e lasciarle recuperare per 72 ore. Successivamente, ordinare le cellule singolarmente in piastre a 96 pozzetti, utilizzando un selezionatore fac con un laser a 488 nanometri per EGFP plus minus.

Dai pozzetti che hanno una crescita, isolare il gDNA cellulare utilizzando un kit di isolamento del DNA disponibile in commercio. Amplifica le regioni che circondano la base target tramite PCR. Infine, eseguire l'analisi di sequenziamento del DNA sui campioni.

72 ore dopo l'analisi della citometria a flusso di incubazione, confermare la riparazione funzionale della proteina fluorescente verde. È stata osservata una risposta graduale alla dose all'aumentare dei livelli coordinati di RNP e 72NT. Una reazione di editing genico in assenza della particella RNP, ha corretto circa l'1% delle cellule bersaglio quando una concentrazione 10 volte superiore dell'oligonucleotide 72NT viene utilizzata nella reazione di editing genico a singolo agente.

Sono stati selezionati 16 cloni dei campioni positivi all'EGFP e l'integrità genetica che circonda il sito bersaglio è stata analizzata mediante sequenziatore di DNA. Tutte le 16 cellule EGFP positive contenevano lo scambio nucleotidico previsto nel sito bersaglio. 15 isolati clonali non verdi sono stati analizzati per l'eterogeneità nel sito target.

Non è stato osservato alcuno scambio di basi del DNA in circa la metà dei campioni. Il resto delle espansioni clonali esaminate, mostrava una popolazione eterogenea di mutazioni di delezione. La dimensione della delezione variava da una base a 19 basi.

CRISPR, Cas9 e molecole di DNA del donatore di oligonucleotidi a singolo filamento che lavorano in tandem possono portare alla riparazione precisa della mutazione puntiforme nel gene EGFP, come dimostrato in questo nuovo modello per la riparazione di mutazioni puntiformi, una via molecolare, in cui il DNA del donatore accede al modello di replicazione per la riparazione della base mutante. Un processo che abbiamo chiamato ExACT. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'editing genetico per esplorare il grado di eterogeneità nel sito bersaglio, come risultato dell'attività di editing genetico nelle linee cellulari.