Name: Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Scopri come analizzare l'attività della DNA polimerasi a livello di singolo nucleotide usando elettroforesi su gel di acrilammide e imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso. Questo metodo consente l'osservazione precisa delle modifiche del DNA.

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Questo lavoro è stato supportato da Research Corporation per l'avanzamento scientifico (Cottrell College Scholar Award n. 22548) e da TriLink Biotechnologies (ResearchReward Grant #G139).

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
<li>Chen, T., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+polymerase+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Directed polymerase evolution.</a> FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).</li>
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<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
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<li>Taylor, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysts+from+synthetic+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysts from synthetic genetic polymers.</a> Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).</li>
<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
<li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2%27-Modified+Sugar+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li>
<li>Rosenblum, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+discovery+of+new+combinations+of+mutant+DNA+polymerases+and+modified+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates.</a> Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).</li>
<li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li>
<li>Joyce, C. M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity%3A+kinetics%2C+structure%2C+and+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints.</a> Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
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<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression%2C+purification%2C+and+enzymatic+characterization+of+full-length+Thermus+aquaticus+DNA+polymerase+and+a+truncated+form+deficient+in+5%27+to+3%27+exonuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.</a> PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, abbiamo descritto un test per caratterizzare la sintesi di DNA polimerasi-mediata di M-DNA. Utilizzando primer di DNA con etichetta vicino infrarosso, e utilizzando l'elettroforesi del gel di poliacrilammide denaturante per risolvere diverse dimensioni oligonucleotidi, possiamo ottenere risoluzione di singolo nucleotide su oligonucleotidi, consentendo la misurazione precisa di sintesi. Questi approcci possono essere usati per misurare l'attività complessiva dell'enzima (sezione 2.1) o per misurare i parametri di Mic...

DNA polimerasi eseguire accurata ed efficiente sintesi di DNA e sono essenziali per mantenere l'integrità genomica. La capacità di sintetizzare centinaia di nucleotidi al secondo senza fare errori fa anche strumenti essenziali di DNA polimerasi in biologia molecolare e biotecnologie. Tuttavia, queste proprietà anche limitano le applicazioni per substrati M-DNA; in linea generale, naturale polimerasi del DNA non possono sintetizzare molti potenzialmente preziosi substrati di M-DNA, probabilmente dovuta alla alta pressione selettiva contro l'uso di substrati non standard in vivo. Molti gruppi hanno sviluppato approcci evoluzione diretto per generare la polimerasi del DNA mutante capace di M-DNA sintesi1a,2,3,4,5; questi sforzi hanno ampliato l'utilità biotecnologica del DNA6,7,8.
Per valutare la capacità della polimerasi del DNA mutante di sintetizzare M-DNA, abbiamo9,10e gli altri11,12,13 in genere utilizzano misurazioni in vitro del DNA attività della polimerasi, che sono descritte in questo manoscritto. In questi esperimenti, la polimerasi del DNA sono co-incubate con un primer con etichettato/modello duplex e nucleosidi trifosfato substrati; i prodotti sono valutati mediante elettroforesi in gel. A seconda della specifica domanda sperimentale, polimerasi del DNA mutante, modificate gli iniettori, modelli modificati, o trifosfati del nucleoside modificato possono essere utilizzato, consentendo la valutazione biochimica sistematica dell'attività dell'enzima mutante.
Storicamente, questi saggi hanno fatto affidamento su un'etichetta radioattiva 5' per tenere traccia di sintesi del DNA; più comunemente, sono stati utilizzati 32P e 33P; tipicamente, etichettatura è realizzato utilizzando T4 polinucleotide chinasi11. Tuttavia, a causa della durata limitata nel tempo e il costo relativamente elevato di etichette radioattive e del loro smaltimento sicuro, il nostro gruppo utilizza invece un fluoroforo vicino infrarosso sintetico 5' DNA contrassegnato. Utilizzando un costo relativamente basso vicino infrarosso gel imager, abbiamo osservato i limiti di rilevazione simile ai precedenti studi utilizzando etichette radioattive (dati non pubblicati). Abbiamo riprodotto con successo passato osservazioni9, e non abbiamo osservato alcuna grande differenza quantitativa con costanti di tasso precedentemente misurato (dati non pubblicati).
Per analizzare la dimensione del DNA e quindi, nella misura della sintesi del DNA, ci basiamo su metodi di elettroforesi del gel di poliacrilammide sviluppati originariamente per di sequenziamento Sanger14 prima dell'avvento di elettroforesi capillare15. La distanza di separazione o di mobilità può essere utilizzata come una misura di peso molecolare; grande formato, i gel di poliacrilammide verticali può raggiungere la risoluzione di singolo nucleotide, consentendo l'osservazione quantitativa di oligonucleotidi di DNA di lunghezza variabile.
Collettivamente, questi esperimenti sono un metodo affidabile per la caratterizzazione della polimerasi. A causa del tempo natura sensibile delle reazioni, la preparazione e la cura è necessaria per ottenere risultati riproducibili. Ulteriormente, mentre il gel dell'acrilamide è un modo molto efficace per misurare la sintesi del DNA, così come numerose altre reazioni modificazione di DNA, con risoluzione di singolo nucleotide, può essere tecnicamente difficile. Il protocollo qui speriamo che consentirà agli utenti di eseguire questi esperimenti, evitando gli errori più comuni.

<table><tbody><tr><td>Tris HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetilato BSA</td><td>Promega</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (i.e. DTT)</td><td>Research Products International</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (cioè EDTA) (soluzione 0,5M)</td><td>Sigma</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Acros</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>Arancione G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTP (riboNTP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTP (tutti gli altri NTP modificati)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>primer assortito</td><td></td></tr><tr><td>1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Sintesi</td> <td>personalizzateUtilizziamo il colorante IR700 che può essere acquistato come sintesi personalizzata. Tipicamente acquistiamo gli oligonucleotidi HPLC purificati. La sequenza è 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td></tr><tr><td>modello 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotecnologie</td><td>Sintesi personalizzate</td><td>Di solito acquistiamo gli oligonucleotidi purificati con HPLC. La sequenza è 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCTCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Research Products International</td><td>A11405</td><td>38,67% acrilammide e 1,33% bis-acrilammide</td></tr><tr><td>Tris/Borato/EDTA (TBE) solido</td><td>Research Products International</td><td>T22020</td><td></td></tr><tr><td>Urea ultrapura</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>Nastro in gel</td><td>CBS Scientific</td><td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto a molla bianco grande in polipropilene</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>Distanziali da 0,75 mm</td><td>CBS Scientific</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>Set di lastre di vetro dentate 33x42</td><td>CBS Scientific</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>Separatore a piastre a cuneo</td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>Pettine per elettroforesi su gel</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>Impianto per elettroforesi su gel</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>acqua</td><td></td><td></td> ultrapura <td>utilizziamo un sistema Milli-Q da</td></tr><tr><td>DNA polimerasi</td><td></td><td></td> <td>MilliporeLi prepariamo nel nostro laboratorio utilizzando protocolli pubblicati.</td></tr></tbody></table>

analisi di attività della polimerasi del dna usando il vicino infrarosso fluorescente dna con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su gel di acrilammide

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Per qualsiasi enzima, robusti, quantitativi metodi sono necessari per la caratterizzazione degli enzimi sia nativi che derivati dal. Per le polimerasi del DNA, sintesi del DNA possono essere caratterizzato usando un in vitro del DNA sintesi analisi seguito da elettroforesi in gel di poliacrilammide. L'obiettivo di questo test è quello di quantificare la sintesi di DNA naturale e di DNA modificato (M-DNA). Questi approcci sono particolarmente utili per la risoluzione dei oligonucleotides con risoluzione di singolo nucleotide, consentendo l'osservazione delle singole fasi durante la sintesi del oligonucleotide enzimatica. Questi metodi sono stati applicati per la valutazione di una matrice di proprietà biochimiche e biofisiche quali la misurazione delle costanti di tasso costante di singoli passaggi della sintesi del DNA, il tasso di errore della sintesi del DNA e affinità di legame del DNA. Utilizzando componenti tra cui, ma non limitatamente a, i trifosfati del nucleoside modificato (NTP), M-DNA, e/o mutante polimerasi del DNA, il relativo programma di utilità di substrato-DNA polimerasi coppie possono essere efficacemente valutate modificati. Qui, abbiamo dettaglio il dosaggio stesso, comprese le modifiche che devono essere fatte per ospitare contrassegno strategie quali DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso del DNA primer non tradizionali. Inoltre, abbiamo dettagliate passi fondamentali tecnici per colata di gel di acrilammide e in esecuzione, che spesso può essere tecnicamente impegnativo.

Un'analisi di successo del gel di poliacrilammide di una caratterizzazione qualitativa della attività complessiva (descritto nella sezione 2.1, Figura 1) e della cinetica allo stato stazionario (descritto nella nota in conclusione del punto 2.1, Figura 2) sono mostrati. Un'analisi di infruttuoso del gel di poliacrilammide è anche mostrata (Figura 3).
<p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

Questo protocollo descrive la caratterizzazione della sintesi di DNA polimerasi di DNA modificato attraverso l'osservazione dei cambiamenti al DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso mediante elettroforesi su gel e gel di imaging. Gel di acrilammide sono usati per l'imaging ad alta risoluzione della separazione degli acidi nucleici breve, che migrano a velocità diverse a seconda delle dimensioni.

Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare l'attività della DNA polimerasi a livello di singolo nucleotide. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della DNA polimerasi, come ad esempio quali passaggi specifici della sintesi del DNA siano limitati da modifiche del DNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di osservare cambiamenti a livello di singolo nucleotide, permettendo un'osservazione precisa dell'attività della polimerasi.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di pianificare in anticipo. Molti dei passaggi sono sensibili al tempo. Per iniziare la procedura, preparare innanzitutto i tamponi, la miscela di duplex di DNA e il diluimento delle proteine come indicato nel protocollo descrittivo.Successivamente, impostare la temperatura di un bagno asciutto a 50 gradi Celsius. Aggiungere 24 microlitri della miscela duplex ricotturata in un tubo da microcentrifuga contenente 25 microlitri di dNTP 2X. Successivamente, trasferire 9,8 microlitri di questa miscela in un tubo da microcentrifuga contenente 20 microlitri di tampone di arresto arancione per preparare il controllo senza enzima.Quindi aggiungere 0,8 microlitri di enzima 50X alla miscela di dNTP duplex. Utilizzare una pipetta a volume elevato per mescolare accuratamente la soluzione. Incubare nel bagno a secco.Interrompere la reazione prelevando 10 microlitri di ciascuna miscela di reazione e aggiungendoli successivamente in un tubo da microcentrifuga contenente 20 microlitri di buffer di arresto arancione. Preparare la miscela di acrilamide per l'elettroforesi su gel come indicato nel protocollo testuale. Successivamente, lavare accuratamente due lastre di gel da 33 centimetri per 42 centimetri con sapone e acqua.Asciugare ogni lato delle piastre con tovaglioli di carta e quindi utilizzare salviette per compiti delicati per asciugare le aree rimanenti. Risciacquare le piastre asciutte con etanolo al 70% e strofinare nuovamente ciascuna con salviette per compiti delicati. Successivamente, passare una mano guantata sotto acqua deionizzata e quindi, utilizzando le dita bagnate, inumidire delicatamente alcuni distanziatori di 0,75 millimetri.Posizionare gli spessori lungo il bordo della piastra scanalata. Utilizzare salviette per attività per rimuovere qualsiasi goccia d'acqua che potrebbe essere schizzata sulle piastre. Unire le piastre e quindi utilizzare nastro per gel per coprire il fondo e i lati, lasciando la parte superiore scoperta.Assicurarsi che il nastro sia allineato uniformemente e sigillato bene. Con un rasoio, tagliare le estremità del nastro. Quindi aggiungere uno strato aggiuntivo di nastro alla base del gel.Dopo aver preparato i reagenti, procurarsi un flacone spray e rimuovere il imbuto appuntito. Utilizzando un cilindro graduato, aggiungere 125 millilitri di acqua. Quindi usare un pennarello indelebile per segnare il livello dell'acqua sulla parte esterna della bottiglia.Eliminare l'acqua. Successivamente, preparare gli anelli di sughero e il sandwich della piastra vicino a un lavandino, come indicato nel protocollo testuale. Posizionare la bottiglia spray vuota e le soluzioni di APS e TEMED preparate sull'altro lato del lavandino.Posizionare un pettine con il numero desiderato di pozzetti e quattro morsetti nelle vicinanze. Quindi aggiungere la soluzione di gel al 20% di acrilamide nella bottiglia con pompetta fino al livello indicato. Contemporaneamente, aggiungere 120 microlitri di TEMED e 600 microlitri di APS alla soluzione di gel di poliacrilamide.Aggiungere rapidamente ulteriori 600 microlitri di APS. Chiudere immediatamente il flacone con il tappo e mescolare ruotando delicatamente. Successivamente, posizionare il sandwich della piastra nel lavandino.Iniziare a versare, applicando una pressione lenta e costante sulla bottiglia per garantire un flusso costante della soluzione del gel. Versare fino a quando il gel ha raggiunto la zona intagliata ed è leggermente in eccesso rispetto al bordo intagliato. Inclinare le lastre per rimuovere eventuali bolle d'aria.Quindi aggiungere il pettine dei pozzetti alla sandwich di piastra. Posizionare le mollette sul pettine in modo che premano verso il basso, consentendo una distribuzione uniforme dei pozzetti. Smaltire rapidamente qualsiasi soluzione di gel rimanente nella bottiglia a spruzzo in un contenitore adeguato per i rifiuti.Risciacquare con acqua deionizzata tre volte attraverso il beccuccio dello spruzzatore per pulire la bottiglia. Per iniziare, rimuovere tutte le clip dal sandwich della piastra. Utilizzando un rasoio, tagliare e rimuovere il nastro gel dagli orli.Pulire le superfici di vetro con tovaglioli di carta e acqua per rimuovere la maggior quantità possibile di residui di gel polimerizzato. Utilizzare un rasoio lungo i bordi per raschiare via qualsiasi gel rimanente. Successivamente, spingere uniformemente il pettine dei pozzetti su entrambi i lati per rimuoverlo.Utilizzando un rasoio, tagliare l'eccesso di gel lungo il bordo superiore del sandwich della piastra. Quindi effettuare un taglio lungo il bordo intagliato della piastra. Utilizzando una siringa e acqua deionizzata, risciacquare i pozzetti per rimuovere eventuali detriti.Assicurarsi che ogni pozzetto possa essere riempito d'acqua e non sia ostruito da eccesso di gel polimerizzato. Successivamente, posizionare il sandwich della piastra nell'apparecchio in modo che la piastra più lunga sia rivolta verso l'esterno mentre lo spazio intagliato sia rivolto verso l'interno. Fissare insieme il sandwich della piastra e la piastra di alluminio collegata all'apparecchio.Aggiungere ulteriori clip ai lati esterni della piastra per favorire una corsa uniforme. Aggiungere il buffer TBE utilizzando una quantità sufficiente a coprire le tacche alla base e i pozzetti nella parte superiore. Eseguire l'elettroforesi su gel a 50 watt per 20 minuti per riscaldare le piastre.Dopo di ciò, utilizzare una siringa e tampone TBE per pulire le pozzetti. Ripetere il lavaggio con la siringa più volte per assicurarsi che tutti i sali del tampone residui siano stati rimossi dai pozzetti. Successivamente, preparare le corsie più esterne su ciascun lato come indicato nel protocollo descritto nel testo.Aggiungere tre microlitri di formammide al 95% con blu di bromofenolo nelle apposite pozzette del gel. Caricare tutti i campioni e lasciarli sedimentare per un minuto. Dopo aver collegato l'apparecchiatura e la fonte di alimentazione, impostare la potenza tra 50 e 55 watt.Eseguire l'elettroforesi per circa tre ore o fino a quando il fronte del colorante blu di bromofenolo ha percorso almeno due terzi della lunghezza del gel. Successivamente, acquisire l'immagine del gel come descritto nel protocollo del testo. In questo studio viene sviluppato un saggio per caratterizzare la sintesi mediata da DNA polimerasi di DNA modificato.Una caratterizzazione qualitativa soddisfacente dell'attività complessiva mostra bande singole ben definite e regolari. L'attività viene valutata sia in base alla lunghezza dei prodotti sia alla frazione del primer marcato convertita in prodotti di dimensioni maggiori. Come si può osservare, E6 ed E5 sono gli enzimi più attivi, mentre E4 ed E1 sono i meno attivi.È possibile eseguire anche un'analisi quantitativa utilizzando la cinetica in condizioni di stato stazionario. Poiché vengono sintetizzati soltanto i prodotti N e N+1, l'evento singolo può essere quantificato con successo. La metodologia di base descritta può essere utilizzata anche per studiare numerose altre enzimi modificanti il DNA o l'RNA, oltre alle polimerasi.

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Screening per Funzionale non codificante Varianti genetiche Utilizzando Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e DNA-affinità precipitazioni Assay (DAPA)

Descriviamo qui un protocollo ottimizzato di saggi fluorescenti elettroforetiche Mobility Shift (Femsa) utilizzando purificati SOX-2 proteine ​​insieme con colorante fluorescente marcato sonde di DNA a infrarossi come un caso di studio per affrontare un'importante questione biologica.

Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

Polimeri semiflessibili visualizzano proprietà meccaniche uniche che sono ampiamente applicato da sistemi viventi. Tuttavia, gli studi sistematici sui biopolimeri sono limitati poiché proprietà quali la rigidità del polimero sono inaccessibili. Questo manoscritto descrive come questa limitazione è aggirata mediante nanotubi di DNA programmabili, permettendo studi sperimentali sull'impatto della rigidità del filamento.

Nanotubi di DNA come un Versatile strumento per lo studio di polimeri semiflessibili

Questo metodo permette la colorazione selettiva e quantificazione del DNA in gel immergendo il gel in un SYBR Green mi / Nitro blu di tetrazolio soluzione e poi esporla alla luce solare o una fonte di luce blu. Questo produce un precipitato visibile e quasi non richiede un equipaggiamento, che lo rende ideale per uso sul campo.

DNA che macchia il metodo basato su Formazan precipitazione indotta dall'esposizione alla luce blu

Questo protocollo descrive un saggio nonradioattivo per misurare l'attività della chinasi delle chinasi polinucleotide (PNKs) su piccoli substrati di DNA e RNA.

Analisi nonradioattiva per misurare la fosforilazione polinucleoide dei substrati piccoli nucleotidi

Le nanomacchine basate su DNAzyme possono essere utilizzate per il rilevamento altamente selettivo e sensibile degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la progettazione di nanomacchine basate su DNAzyme con un nucleo 10-23 utilizzando software libero e la loro applicazione nel rilevamento di un frammento di virus di Epstein-Barr come esempio.

DNAzyme 10-23 - Nanomacchine basate sul riconoscimento degli acidi nucleici

Qui viene presentato un protocollo per il dosaggio degli enzimi metabolizzanti degli acidi nucleici, utilizzando esempi di enzimi ligasi, nucleasi e polimerasi. Il test utilizza oligonucleotidi marcati in fluorescenza e non marcati che possono essere combinati per formare duplex che imitano i danni all'RNA e/o al DNA o gli intermedi di percorso, consentendo la caratterizzazione del comportamento enzimatico.

Utilizzo di oligonucleotidi sintetici modificati per il dosaggio degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici

Questo studio presenta un saggio FRET raziometrico semplice e di facile utilizzo per il rilevamento e la valutazione quantitativa dell'attività della DNasi e dimostra la sua applicazione nell'analisi di una nucleasi debole.

Valutazione dell'attività della DNasi mediante trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza raziometrica

Questo protocollo dimostra l'esecuzione di un saggio a singola molecola per la visualizzazione dal vivo dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG. Descrive (1) la preparazione di un substrato di DNA, (2) la purificazione dell'elicasi CMG di Drosophila melanogaster marcata in fluorescenza, (3) la preparazione di una cella a flusso microfluidico per la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) e (4) il saggio di svolgimento del DNA a singola molecola.

Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Questo protocollo delinea un saggio di replicazione del DNA a singola molecola basato su microscopia a fluorescenza, che consente la visualizzazione in tempo reale delle interazioni tra le DNA polimerasi e gli ostacoli come le strutture G-quadruplex.

Visualizzazione a fluorescenza a singola molecola della dinamica della DNA polimerasi ai G-quadruplex

Scopri come analizzare l'attività della DNA polimerasi a livello di singolo nucleotide usando elettroforesi su gel di acrilammide e imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso. Questo metodo consente l'osservazione precisa delle modifiche del DNA.

Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide (Video) | JoVE Journal

Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide

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