Protocollo generico per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor
15 dicembre 2017
Questo manoscritto descrive un approccio generico per la progettazione su misura di media di coltura microbica. Questa opzione è attivata da un flusso di lavoro iterativo che unisce Kriging sperimentale design e microbioreactor tecnologia per una velocità effettiva coltivazione sufficiente, che è supportata da robotica lab per aumentare affidabilità e velocità nella gestione dei mezzi liquidi preparazione.
L'obiettivo generale di questo flusso di lavoro iterativo che combina la progettazione sperimentale basata su Kringing e la tecnologia dei microbioreattori per una sufficiente produttività di coltivazione è quello di descrivere un approccio generico per la progettazione su misura di terreni di coltivazione microbica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo di bioprocessi microbici, come l'ottimizzazione dei terreni di coltivazione, le condizioni dei bioprocessi e la fenotipizzazione dei ceppi. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando ci siamo chiesti se i terreni di coltura ottimizzati per la produzione di piccoli metaboliti fossero anche i più adatti per la produzione di proteine eterologhe.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che accelera i tempi di sviluppo complessivi grazie a una combinazione intelligente di esperimenti e modellazione. A dimostrare questa procedura sarà Roman Jansen, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Inizia questa procedura con lo studio, l'ideazione e la definizione dei metodi come dettagliato nel protocollo del testo.
Sterilizzare le piastre a pozzetti profondi per la conservazione della soluzione madre su un tavolo di lavoro strofinando le piastre con etanolo al 70% e successivamente asciugandole in una cappa a flusso laminare. Iniziare la coltura dei semi inoculando 50 millilitri di terreno BHI contenente 25 milligrammi per litro di kanamicina con un'aliquota dalla banca cellulare di lavoro. Posizionare tutto il materiale da laboratorio necessario sul tavolo di lavoro robotizzato e versare le soluzioni stock nel materiale da laboratorio corrispondente.
Quindi, avviare il flusso di lavoro robotico per la preparazione dei terreni in modo che l'ultima fase, che è l'inoculazione, sia raggiunta in tempo per l'inizio della coltura delle sementi. Campionare la coltura dei semi dopo circa due ore per monitorare la crescita misurando la densità ottica a 600 nanometri o O-D-600. Continua a monitorare la crescita ad ogni ora.
Dopo circa cinque ore, la coltura raggiunge un O-D-600 tra le tre e le quattro e viene utilizzata per inoculare le colture principali. Posizionare la coltura dei semi sul tavolo di lavoro del gestore dei liquidi e continuare il protocollo di preparazione dei terreni. Sigillare le piastre per microtitolazione di coltivazione dopo l'inoculazione.
Quindi, posiziona la coltivazione sigillata M-T-P nel dispositivo Biolector. Quindi, avvia il protocollo di coltivazione predefinito. Se necessario, smaltire le soluzioni madre rimanenti secondo le norme di biosicurezza.
Quindi, semina la coltura dal tavolo di lavoro robotico. Pulire il materiale da laboratorio riutilizzabile prima di iniziare il protocollo di decontaminazione del gestore di liquidi. Arrestare le impostazioni cultura principali dopo un'esecuzione di 17 ore ed elaborare i dati come descritto nel protocollo di testo.
Per quantificare il titolo G-F-P, trasferire prima le sospensioni cellulari da tutti i pozzetti di coltivazione in provette di reazione prelabate. Quindi, centrifugare le sospensioni cellulari per 10 minuti alla massima velocità utilizzando una centrifuga da banco per ottenere il surnatante privo di cellule. Quindi, trasferire 200 microlitri di ciascun surnatante privo di cellule in un M-T-P nero a 96 pozzetti con fondo trasparente.
Leggere la fluorescenza specifica G-F-P a 488 nanometri per l'eccitazione e a 520 nanometri per la lunghezza d'onda di emissione utilizzando un apposito lettore di micropiastre. Dopo aver misurato la fluorescenza G-F-P, la micropiastra può essere utilizzata direttamente per la determinazione del contenuto proteico dei surnatanti liberi da cellule con protocolli standard come un test Bradford o B-C-A. Infine, procedi all'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.
La procedura dimostrata costituisce un ciclo di esperimenti, i risultati vengono utilizzati per progettare ulteriori cicli con il massimo miglioramento atteso del segnale GFP. Gli esperimenti di riferimento vengono inseriti in ogni round per analizzare la variabilità dei dati e rilevare i valori anomali sperimentali. Questo grafico di contorno fornisce una panoramica della procedura di ottimizzazione.
L'analisi del set di dati raccolti attraverso l'iterazione tre ha rivelato una limitazione dell'effetto positivo del magnesio, identificando un intervallo di concentrazione ottimale. Si è quindi deciso di espandere ulteriormente l'intervallo di concentrazione solo per il calcio nell'iterazione quattro. La procedura è stata ripetuta due volte nell'iterazione cinque e sei fino a quando non è stata trovata una saturazione del segnale GFP.
Questa saturazione è spiegata dalla precipitazione del sale di calcio per le concentrazioni di calcio applicate, che non sono disponibili per la cellula. La settima iterazione è stata utilizzata per esplorare i confini in modo più dettagliato. Gli intervalli di concentrazione ottimali dei componenti del fluido per il segnale G-F-P saturo possono essere identificati in modo affidabile con un test Z statistico.
Mostra il plateau identificato come determinato e visualizzato utilizzando la cassetta degli attrezzi del kit Kringing. La cassetta degli attrezzi del kit Kringing è disponibile gratuitamente e viene fornita con un tutorial dettagliato che spiega come utilizzare le sue funzionalità. La natura generica del protocollo presentato consente vari adattamenti, come lo studio di altri ospiti di espressione microbica o l'ottimizzazione di altre proprietà della proteina bersaglio, come il pattern di glicosilazione o i legami disolfuro.
L'integrazione di un sistema embrion aumenta la produttività sperimentale, il che consente un grande risparmio di tempo Quando si sostituiscono bioreattori completamente controllabili e influenti con sistemi amniar, è necessario considerare la scalabilità dei risultati. La modellazione matematica e la progettazione di esperimenti aiutano a massimizzare il contenuto informativo dei dati di misura rispetto all'obiettivo studiato.
Panoramica
Questo manoscritto descrive un approccio generico per la progettazione su misura di terreni di coltura microbica mediante un flusso di lavoro iterativo. Questo metodo combina la progettazione sperimentale basata sul kriging e la tecnologia dei microreattori per aumentare la produttività e l'affidabilità della coltivazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Sviluppo di bioprocessi microbici
- Progettazione sperimentale
- Tecnologia di bioreattori micro
Sfondo
- L'ottimizzazione dei mezzi di coltura è fondamentale per i processi microbici.
- La produzione di metaboliti di piccole dimensioni e la produzione di proteine eterologhe richiedono mezzi personalizzati.
- La combinazione di esperimenti con modellizzazione può accelerare i tempi di sviluppo.
- I sistemi robotici aumentano l'efficienza della manipolazione dei liquidi nella preparazione dei mezzi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per l'ottimizzazione dei terreni di coltura microbici.
- Esplorare la relazione tra la composizione del terreno e la produzione di proteine.
- Dimostrare il flusso di lavoro iterativo per la progettazione dei terreni.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un piano sperimentale basato sul kriging.
- Applicazione della tecnologia di microreattore per la coltivazione.
- Maneggiamento robotizzato dei liquidi per la preparazione dei mezzi di coltura.
- Analisi statistica per identificare le concentrazioni ottimali dei componenti del mezzo di coltura.
Risultati principali
- Identificazione di intervalli di concentrazione ottimali per i componenti del mezzo.
- Dimostrazione del processo iterativo che porta a un segnale G-F-P migliorato.
- Convalida dei risultati mediante test statistici Z.
- Adattabilità del protocollo a diversi ospiti microbici per l'espressione.
Conclusioni
- Il metodo presentato migliora significativamente la progettazione di terreni di coltura microbica.
- L'integrazione della robotica aumenta la produttività e l'efficienza.
- I risultati possono essere scalati e adattati per diverse applicazioni nella ricerca microbiologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo affronta la sfida biofarmaceutica dell'ottimizzazione dei mezzi di coltura microbica per la produzione di proteine eterologhe, una fase cruciale nello sviluppo di ceppi e nell'efficienza dei processi biotecnologici. Integrando un piano sperimentale basato sul kriging con la tecnologia dei microreattori e la manipolazione robotizzata di liquidi, il metodo accelera i cicli di ottimizzazione del mezzo colturale e migliora l'affidabilità predittiva nella formulazione del mezzo. Il flusso di lavoro generico e adattabile supporta le decisioni nelle fasi iniziali della scoperta, consentendo un'identificazione rapida, guidata dai dati, delle condizioni nutrizionali ottimali che aumentano il rendimento di proteine ricombinanti e la robustezza del processo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi degli effetti dei componenti del mezzo sulla produzione proteica per chiarire i requisiti biologici dell'espressione eterologa.
- Valore operativo: Permette lo screening rapido di formulazioni di mezzi per ridurre i rischi legati alla fattibilità del bersaglio prima del passaggio a scala maggiore.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi sul titolo di GFP come lettura riproducibile dell'efficienza di produzione proteica in diverse condizioni di mezzo.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro di coltivazione e rilevamento mediante automazione, migliorando la riproducibilità e la capacità analitica del saggio.
- Valore strategico: Prepara condizioni di mezzo validate per campagne di screening successive, riducendo la variabilità nella valutazione di composti o ceppi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Stabilisce un quadro trasferibile per l'ottimizzazione di ceppi microbici utilizzati nella produzione preclinica di proteine, sostenendo la coerenza tra le diverse fasi di sviluppo.
- Valore operativo: Consente il trasferimento agevole di terreni colturali ottimizzati dai processi di scoperta ai flussi di lavoro preclinici attraverso protocolli standardizzati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'ingegneria del ceppo all'identificazione del capostipite, in cui l'ottimizzazione del mezzo colturale influenza direttamente i livelli di espressione proteica e la fattibilità del processo a valle.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi sull'impatto dei nutrienti sulla resa proteica, consentendo una riduzione del rischio meccanicistica dei sistemi di espressione.
- Screening: Fornisce risultati di coltura standardizzati e riproducibili, adatti per piattaforme di screening ad alto rendimento.
- Analisi: Fornisce misurazioni della fluorescenza della GFP e della concentrazione proteica che permettono un confronto quantitativo tra diverse formulazioni di terreni di coltura.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità definendo condizioni di terreno riproducibili in modelli preclinici su scala più ampia.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo modulare e adattabile, applicabile in diversi progetti, ceppi ospiti e bersagli proteici, riducendo gli sforzi di sviluppo ridondanti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella progettazione dei mezzi di coltura attraverso esperimenti iterativi guidati da modellizzazione.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità grazie all'integrazione di sistemi robotici per la manipolazione dei liquidi e di microbioreattori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto collegando la composizione del mezzo di coltura al rendimento proteico, riducendo i rischi biologici in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi di ceppi e condizioni di mezzo di coltura basata sui risultati dell'ottimizzazione guidata dai dati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione sperimentale, nell'uso di microbioreattori e nei sistemi robotici di movimentazione liquidi.
- Presuppone l'accesso a piattaforme di microbioreattori (ad esempio, Biolector), lettori di piastre e attrezzature per la centrifugazione per la lavorazione del soprannatante.
- Necessita di un allineamento tra i vari team riguardo alle modalità di raccolta dati, agli standard di misurazione della GFP e ai protocolli di analisi statistica (ad esempio, test Z).
- Comporta la necessità di adattamenti qualora il protocollo venga trasferito ad altri ospiti microbici o ad altri bersagli proteici (ad esempio, proteine dipendenti da glicosilazione o da ponti disolfuro).
- I limiti pratici includono la necessità di esperimenti di riferimento ad ogni iterazione per individuare valori anomali e garantire l'affidabilità dei dati, come indicato nel flusso di lavoro iterativo.
