Name: Protocollo generico per lottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Scopri un metodo iterativo per ottimizzare i mezzi di coltura microbici utilizzando la progettazione sperimentale basata su Kriging e la tecnologia dei microbioreattori. Questo approccio accelera lo sviluppo dei bioprocessi.

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L'attività scientifica del centro di scienza di bioeconomia era sostenuto finanziariamente dal Ministero dell'innovazione, scienza e della ricerca nell'ambito della BioSC NRW-Strategieprojekt (n. 313/323-400-002 13). Gli autori ringraziano il Ministero dell'innovazione, scienza e ricerca della Renania settentrionale-Vestfalia e Heinrich Heine University Düsseldorf per una borsa di studio a Lars Freier entro la biotecnologia industriale di Cluster CLIB-Graduate. Ulteriori finanziamenti è stato ricevuto dal programma di spazi di abilitazione "Helmholtz Innovation Labs" dell'Associazione Helmholtz tedesco per sostenere la "microbica Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab".

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il carattere generico del protocollo presentato permette vari adattamenti, ad esempio, per studiare altri espressione microbica ospita9,47,48,49,50, 51, o per ottimizzare altre proprietà della proteina dell'obiettivo, come le obbligazioni di pattern o bisolfuro di glicosilazione. Il protocollo inoltre devono essere adattati per l'attrezzatura di laboratorio disponibili. L'integrazione di un sistema MBR permette di aumentare il throughput sperimentale, che consente un grande risparmio nel tempo. Tuttavia, quando sostituisce completamente strumentati e controllabile bioreattori di sistemi MBR, scalabilità dei risultati deve essere considerata8,37,52,53. L'utilizzo di metodologie DOE e modellazione matematica aiuta a massimizzare il contenuto informativo dei dati di misurazione rispetto l' oggettiva studiati54 da un'efficiente pianificazione sperimentale e interpretazione di dati basati su modello15.
Modifiche al metodo Accanto a multi-purpose ed espandibile robotica manipolazione dei liquidi sistemi come quello utilizzato in questo studio, va ricordato che ci sono parecchi più piccolo liquido sistemi disponibili in commercio che sono in grado di eseguire questa operazione e possono essere inseriti all'interno di movimentazione di banchi di lavoro a flusso laminare. Se nessun sistema di pipettaggio automatizzato è disponibile, composizioni di diversi media secondo il disegno DOE possono essere realizzate anche pipettando manuale utilizzando pipette mono e/o multi-canale. Poiché la preparazione manuale è più soggetto a errori e richiederà un lavoro altamente concentrato per un tempo abbastanza lungo, si consiglia di preparare un numero inferiore di composizioni di diversi media.
A seconda delle capacità del sistema MBR autonomo, varierà il corrispondente protocollo di coltivazione. Ad esempio, se non è disponibile alcuna misurazione online di formazione di biomassa, può essere sufficiente a misurare la concentrazione di biomassa dopo il completamento dell'esperimento di crescita. In combinazione con monitoraggio on-line il pH e l'ossigeno disciolto, che viene implementato in diversi sistemi MBR, la saturazione di crescita può essere determinata in modo sicuro. In linea di principio, gli esperimenti di crescita possono essere condotti in MTPs da solo collocato all'interno di agitazione incubatori, senza l'uso di un sistema MBR. In questo caso, le condizioni di corretta coltivazione necessario garantire: (1) ossigeno limitato coltivazioni possono essere evitato utilizzando MTPs con geometrie adatte, in combinazione con adeguata agitazione frequenze e scuotendo diametri, ad esempio, Piazza 96 o 24 profonda piatti ben operato a 1.000 giri/min a tiro di 3 mm o a 250 rpm a passi di 25 mm, rispettivamente. D'importanza, più basso i tassi di trasferimento di ossigeno massimo realizzabile, minore sarà la fonte principale di carbonio deve essere concentrata. Come accennato in precedenza, per questo studio, l'uso di 10 g/L glucosio era idoneo a prevenire la limitazione di ossigeno per le condizioni di coltivazione impiegato; (2) il campionamento delle culture MTP per quantificazione biomassa e prodotto dovrebbe essere ridotto al minimo. Ogni volta che il MTP è rimosso dall'incubatrice agitazione, trasferimento di ossigeno sarà immediatamente ripartizione che può provocare condizioni di coltivazione sfavorevole; (3) nel parere degli autori, l'uso dei lettori MTP come dispositivi di coltivazione non è raccomandato come questi dispositivi non sono stati sviluppati per questo scopo. Ad esempio, agitazione meccanica sono stati costruiti per la miscelazione occasionale di micropiastre dopo l'aggiunta del reagente e così, spesso mancanza di robustezza per lunghe percorrenze di agitazione continua durare per giorni. Inoltre, non può essere realizzato sufficienti input di alimentazione necessario per colture microbiche in questi lettori. L'integrazione delle letture di densità ottica in breve intervalli di tempo richiede arresto del movimento d'agitazione, conseguente a ripetuti periodi di prescrizione di ossigeno. Inoltre, evaporazione in tali sistemi su periodi lunghi coltivazione sarà falsare i risultati. Per maggiori dettagli sull'argomento sorprendentemente complesso sull'utilizzo MTPs per colture microbiche, si rimanda il lettore alla letteratura citata22,23,24,25,26 e bibliografia citata.
Ulteriori considerazioni Per fasi di ottimizzazione iterativa di Speed-up, si consiglia di selezionare con attenzione il metodo analitico per la quantificazione del prodotto. Veloci e semplici metodi dovrebbero essere preferiti al costo di precisione e accuratezza, come la strategia di disegno sperimentale iterativo tollera sperimentale inesattezza. Tuttavia, i risultati finali devono essere verificati contro metodi di quantificazione del prodotto sufficientemente precise ed accurate che potrebbero essere più complicati. In generale, un'attenta valutazione e il processo decisionale circa le procedure di studio richiedono impegno all'inizio dello studio, ma pagare a lungo termine, dopo i metodi di routine sono stati stabiliti.
Si consiglia di definire un esperimento di riferimento che è rispetto a tutti gli esperimenti durante l'ottimizzazione. Cioè, le concentrazioni medie applicate componente così come uscita misurata è normalizzato tramite dividendo per i valori di riferimento. In questo modo, ciascuno applicato e il valore misurato può essere interpretato come la x-piega del valore di riferimento. Per tener conto delle variazioni tra le piastre, cinque esperimenti di riferimento vengono eseguiti su ogni piatto. Il valore medio dei risultati misurati viene utilizzato per la normalizzazione.
Non può generalmente essere garantito che il mezzo sviluppato è anche ottimo per altri ceppi. Tuttavia, il mezzo migliore probabilmente sarà anche appropriato per coltivare ceppi di espressione con piccole differenze genetiche, per esempio, quando produrre varianti di enzima con singolo amminoacido sostituzioni ottenuti da (studi di mutagenesi anche se per effetto di metabolismo cellulare e l'espressione eterologa prestazioni55,56, sono state descritte anche singole mutazioni puntiformi). In questo caso, il protocollo presentato può essere un primo passo, seguito da protocolli per espressione high-throughput screening57. Se il protocollo viene utilizzato per lo sviluppo medio con successiva scala-fino a coltivazioni di fed-batch, il supporto ottimizzato deve essere verificato per le corrispondenti condizioni di bioprocessi, come clone campagne a Microscala di screening identificato diversi top interpreti per diverse strategie d'alimentazione e coltivazione media52,58. Inoltre, l'introdotto KriKit36 generalmente possono contribuire alla ottimizzazione migliorata bioprocessi olistico.Solo di recente, le abilità di strumento sono estesi per supportare anche ottimizzazione multi-obiettivo40, che può essere importante per l'ottimizzazione di entrambi i processi a Monte e a valle59,60.

La tecnologia moderna gene ricombinante consente l'ampio uso di enzimi tecnici per varie applicazioni nell'industria farmaceutica, zootecnia, chimica organica e1,2,3di trasformazione alimentare. La produzione di enzimi tecnici allo stato sfuso è un argomento importante per la biotecnologia industriale e per la produzione di proteine ricombinanti ottimizzato ed entrambi colare e ingegneria di bioprocess è necessaria. Per la generazione di ceppi ingegnerizzati in modo efficiente produzione, librerie genetiche differenti sono disponibili, ad esempio, per equilibrato gene expression4 o secrezione aumentata efficienza5.
Glutamicum del corinebatterio è un importante produttore di aminoacidi alla scala industriale6,7 e rappresenta un host attraente espressione non convenzionali per la produzione di secrezione di proteine ricombinanti8 ,9. Sia il generale secretiva (Sec) e la via di twin-arginina traslocazione (Tat) sono presenti in c. glutamicum e sono state applicate correttamente per proteina ricombinante secrezione10. Vasta esperienza nell'ingegneria dei bioprocessi per quanto riguarda la produzione dell'amminoacido a scala industriale, come pure la capacità di secernere proteine g/L importi11 e grande robustezza relativa disomogeneità di bioprocessi trovato in larga scala coltivazioni12,13, effettuare c. glutamicum un organismo piattaforma promettente per la produzione di secrezione delle proteine eterologhe in scala industriale.
Ottimizzazione media nutrizione è noto per migliorare la produzione di proteine ricombinanti con sistemi microbici14,15,16,17 e di conseguenza, la regolazione del mezzo composizione è un passo gratificante in bioprocessi sviluppo per quanto riguarda la produttività ottimale18,19,20,21. Intense ricerche sull'applicazione delle piastre di microtitolazione (MTPs) per coltura microbica22,23,24 ha spianato la strada per lo sviluppo e la progettazione di MTPs per coltura microbica25 ,26 e lo sviluppo di sistemi basati su MTP microbioreactor (MBR) con monitoraggio on-line e ambientale controllo27,28. MBR permettono un significativo aumento della velocità effettiva coltivazione sperimentale. Inoltre, sono disponibili per bioprocessi microbica ottimizzazione29,30,31, sistemi MBR derivanti da altri tipi di bioreattori, ad esempio, bolla colonne o agitata serbatoio reattori, 32.
In generale, gli studi di ottimizzazione beneficiano della maggiore velocità effettiva sperimentale, che diventa ancora più potente in combinazione con metodologie DOE, ad esempio per valutare le interazioni tra le variabili di progetto o ridurre gli spazi di ricerca alto-dimensionali. Di conseguenza, l'uso combinato di sistemi MBR, automazione di laboratorio e DOE ha dimostrato di essere un metodo efficace nella biotecnologia8,16,33,34,35.
Un protocollo per l'ottimizzazione dei media è presentato combinando automazione di laboratorio state-of-the-art, tecnologia MBR con monitoraggio online di processo e progettazione sperimentale/analisi dati basati su Kriging. La metodologia di Kriging è implementata in una Toolbox di MATLAB ("KriKit") che può essere scaricato e utilizzato gratuitamente carica36. Come esempio di applicazione, massimizzazione della produzione di proteine (GFP) secretiva ﬂuo verde con c. glutamicum è mostrato ottimizzando la composizione del terreno minimo CgXII. Titolo GFP è stato scelto come l'obiettivo di ottimizzazione come esso può essere facilmente quantificato e ampiamente si applica come proteina di modello per lo studio del MBR sistemi37,38,39.
Il quadro presentato è diviso in quattro fasi, che sono illustrati nella Figura 1. I passaggi sono indicati da cornici di casella e corrispondono alle sezioni del protocollo. Il primo passo (Figura 1A) è di definire gli obiettivi di progetto e di determinare i metodi richiesti. La combinazione di metodologie DOE, tecnologia MBR e automazione di laboratorio consente un aumentare il throughput sperimentale che richiede potente elaborazione di dati. Il secondo passo (Figura 1B) mira a rilevare le variabili design sensibile (cioè, componenti medie) con alta influenza sull'obiettivo ottimizzazione. Questo porta ad un ridotto numero di variabili di progetto di interesse. Il terzo passo (Figura 1) comprende un'ottimizzazione iterativa per una ricerca più dettagliata del rapporto funzionale tra le restanti variabili di progetto e l'obiettivo di interesse. Utilizzando il set di dati successivamente estesi, l'approccio di Kriging è applicato per prevedere il risultato sperimentale alle posizioni non misurati. Il ciclo iterativo si arresta non appena il modello Kriging predice un'ottimale o altopiano con sufficiente precisione. I risultati sono verificati nel quarto passaggio (Figura 1), a partire da un'ulteriore analisi di sensibilità intorno l'optimum identificato. Se inizialmente, insensibile componenti si trovano ad per essere insensibili anche nella regione ottima, è ragionevole supporre che questo vale durante la procedura di ottimizzazione iterativa nel terzo passo. In seguito, si consiglia di verificare i risultati di ottimizzazione di applicazione dei metodi ortogonali, come un saggio di attività o SDS-Page.
Il carattere generico del protocollo presentato consente facile adattamento di attrezzature di laboratorio diversi, altri host espressione e proteine bersaglio di scelta, così come ulteriori bioprocessi variabili come la temperatura di valore o coltivazione di pH.Inoltre, altri obiettivi di ottimizzazione come tasso di produzione di proteina, resa specifica o qualità del prodotto possono essere scelti per adattarsi l'ambito di altri studi di ottimizzazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Figura 1 : Flusso di lavoro di studio di ottimizzazione. I quattro riquadri corrispondono alle sezioni del protocollo, "Concepire the studio e definizione di metodi" (sezione 1), "Sensitivity Analysis" (sezione 2), "Ottimizzazione iterativa" (sezione 3) e "Convalida" (sezione 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>BioLector</td><td>m2p-labs</td><td>G-BL-100</td><td></td></tr><tr><td>Flowerplate</td><td>m2p-labs</td><td>MTP-48-BOH</td><td>Per la coltivazione nel dispositivo BioLector</td></tr><tr><td>Foglio sigillante</td><td>m2p-labs</td><td>F-GP-10</td><td>Sigillatura sterile per Flowerplate</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>2016b</td><td></td></tr><tr><td>KriKit</td><td>Forschungszentrum J&uuml; lich</td><td>n/a</td><td>Disponibile gratuitamente, è richiesta l'installazione di MATLAB</td></tr><tr><td>Robot di pipettaggio Janus</td><td>Perkin Elmer</td><td>n/a</td><td>Include l'installazione del software "WinPrep"</td></tr><tr><td>Micropiastra a pozzetti profondi a 12 colonne</td><td>E& K Scientific</td><td>EK-2034</td><td>Contenitore per soluzioni stock medie</td></tr><tr><td>Micropiastre a 96 pozzetti, trasparente, F-bottom</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>Per il dosaggio delle proteine Bradford</td></tr><tr><td>&micro; micropiastre trasparenti a 96 pozzetti, corpo nero, fondo F trasparente</td><td>Greiner</td><td>655087</td><td>Per la misurazione della fluorescenza in surnatanti privi di cellule</td></tr><tr><td>Ricerca su pipette&nbsp; più pipette multicanale</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>Facilita la manipolazione manuale dei liquidi con micropiastre</td></tr><tr><td>TruPAG&nbsp; Gel prefabbricati</td><td>Sigma</td><td>PCG2002</td><td>Per l'analisi SDS-Page di supernanti privi di cellule</td></tr><tr><td>Bradford Reagente</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td><td>n/a</td><td>n/a Trasporta</td> il <td>plasmide pEKEx2 con fusione del gene GFP e del peptide del segnale PhoD da B.subtilis come inserto di espressione. Il plasmide fornisce resistenza alla kanamicina. Descritto e pubblicato da Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&ndash; 42 (2007)</td></tr></tbody></table>

protocollo generico per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di microbioreactor

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Un core business in biotecnologie industriali utilizzando fabbriche di produzione microbica delle cellule è il processo iterativo di ceppo ingegneria e ottimizzazione delle condizioni di bioprocessi. Un aspetto importante è il miglioramento di medium di coltivazione per fornire un ambiente ottimale per la formazione microbica del prodotto di interesse. È ben accettato che la composizione media può influire notevolmente le prestazioni complessive di bioprocessi. Ottimizzazione media nutrizione è noto per migliorare la proteina ricombinante produzione con sistemi microbici e, quindi, questo è un gratificante passo nello sviluppo di bioprocessi. Tuttavia, ricette molto spesso standard multimediali sono tratti dalla letteratura, poiché la progettazione su misura di medium di coltivazione è un compito noioso che richiede tecnologia microbioreactor per una velocità effettiva coltivazione sufficiente, analitica rapida del prodotto, così come supporto di robotica lab per abilitare affidabilità nelle operazioni di gestione dei liquidi. Inoltre, metodi matematici avanzati sono necessari per analizzare razionalmente i dati di misura e in modo efficiente progettazione di esperimenti paralleli come raggiungere contenuto informativo ottimale.
Il carattere generico del protocollo presentato consente facile adattamento alla strumentazione di laboratorio diversi, altri host espressione e proteine bersaglio di interesse, così come ulteriori parametri di bioprocessi. Inoltre, altri obiettivi di ottimizzazione come tasso di produzione di proteina, resa specifica o qualità del prodotto possono essere scelti per adattarsi l'ambito di altri studi di ottimizzazione. Il Toolbox di Kriging applicata (KriKit) è uno strumento generale per progettazione di esperimenti (DOE) che contribuisce alla ottimizzazione migliorata bioprocessi olistico. Supporta anche ottimizzazione multi-obiettivo che può essere importante nell'ottimizzare processi upstream e downstream.

Il protocollo introdotto è stato applicato per massimizzare il titolo di GFP secrete. In particolare, il titolo GFP dopo 17h di coltivazione è stato scelto come l'obiettivo di ottimizzazione. Rilevazione della fluorescenza online di GFP ammessi quantificazione semplice prodotto. Tuttavia, la normalizzazione del segnale GFP con dati da una coltura di riferimento è indispensabile per garantire la riproducibilità e la comparabilità dei risultati. Una pre-selezione di componenti multimediali è stata effettuata su una base razionale, come descritto nella sezione 1. Gli esperimenti sono stati effettuati seguendo le istruzioni della sezione 1: sono stati definiti i parametri delle procedure di laboratorio bagnato per lo studio di tutto assicurando la coerenza e la riproducibilità dei risultati.
Come descritto nella sezione 2, è stato effettuato un primo screening per l'identificazione di componenti rilevanti mostrano un impatto significativo sull'obiettivo ottimizzazione per lo studio ulteriore e più dettagliato. Il sistema MBR basati su MTP permette 48 esperimenti per essere eseguite in parallelo. Tenendo conto del massimo numero possibile di esperimenti paralleli su un MTP (48) e il numero totale di marche di supporti componenti (11) il 2IV11-6 frazionario progettare una scelta appropriata. Questo disegno sperimentale comprende 32 esperimenti e permette la stima dell'effetto principale per ciascuno dei componenti multimediali studiati. I restanti pozzetti di coltivazione (16) sono stati utilizzati per più ripetizioni di esperimenti con il mezzo di riferimento per valutare la riproducibilità ed effetti posizionali. Cioè, ogni esperimento è condotto una volta (non repliche), salvo l'esperimento di riferimento (cinque repliche).
La tabella 1 riassume i risultati dell'analisi di screening. Nella gamma di concentrazione considerata, variando la maggior parte dei componenti media non ha mostrato un effetto evidente sull'obiettivo. Componente di NH4+ Mostra un forte effetto negativo, mentre Ca2 + e Mg2 + mostrano la più forte tendenza positiva. L'effetto di Mg2 + non è significativo per l'attuale gamma di concentrazione, ma potrebbe essere per una più ampia gamma di concentrazione. Di conseguenza, è stato deciso di omettere NH4+ dal mezzo e per studiare l'effetto di Ca2 + e Mg2 + in ulteriori esperimenti.
Sezione 3 descrive la procedura di ottimizzazione iterativa che viene utilizzata per massimizzare il segnale di fluorescenza di GFP pur variando le concentrazioni di Ca2 + e Mg2 +. Nell'iterazione 1, è stato testato l'ipotesi che NH4+ può essere omesso. L'intervallo di concentrazione per Ca2 + e Mg2 + è stato adottato dall'analisi di screening. La concentrazione minima di NH4+ è stata impostata su zero e la concentrazione massima è stata adottata dall'esperimento lo screening. Nei seguenti esperimenti, le concentrazioni di componente sono state distribuite sopra un 3 × 3 × 3 griglia all'interno dell'intervallo di concentrazione definita, con conseguente 27 esperimenti. Durante tutte le colture, cinque repliche di medie di riferimento sono stati inclusi, che ha servito come standard interno e per garantire che si è verificato nessun effetti posizionali sopra il MTP. Per i restanti 16 pozzetti, le concentrazioni di NH4+, Ca2 +e Mg2 + sono state distribuite in modo casuale all'interno delle gamme data.
Figura 5 A Visualizza i risultati delle prime iterazioni. Le etichette dell'asse si riferiscono alle concentrazioni componente utilizzate nel mezzo di riferimento originale, indicato dalla x Ref. Le superfici blue rappresentano le interpolazioni Kriging che sono state calcolate utilizzando il software KriKit. Ogni superficie è associato un livello di concentrazione relativa per NH4+ (blu scuro: 0 x Ref, a scacchi: 1 x Ref, blu chiaro: 2 x Ref). Questa rappresentazione visiva rivela che è favorevole per omettere NH4+. Superfici di interpolazione mostrano anche gli effetti positivi di Mg2 + e Ca2 +, come tutti gli aerei aumento con concentrazioni crescenti.
Sulla base dei risultati dell'iterazione 1, si decise di espandere la concentrazione gamma di Ca2 + e Mg2 + raddoppiando le concentrazioni massime e spostando la finestra di progettazione sperimentale verso l'angolo superiore destro, vedere la Figura 5 B. all'interno di questa gamma, le concentrazioni sono state distribuite su una 6x6 griglia. Ciò garantisce una distribuzione uniforme sopra la gamma di piena concentrazione, portando a risultati ottimali di interpolazione Kriging. Figura 5 B Mostra la trama di interpolazione Kriging basata su dati combinati misurato in entrambe le iterazioni (puntini rossi e quadrati gialli). Per entrambi, Ca2 + e Mg2 +, continua l'effetto positivo delle loro concentrazioni aumentanti. Di conseguenza, la procedura è stata ripetuta raddoppiando la massima concentrazione e così, la finestra di progettazione sperimentale è stata spostata per esplorare i confini dell'angolo superiore destro.
Figura 6 A dà una panoramica della procedura di ottimizzazione rimanenti. L'analisi del set di dati raccolti fino a iterazione 3 ha rivelato che una limitazione dell'effetto positivo di Mg2 +, cioè, una concentrazione ottimale gamma di Mg2 + è stata identificata. Si decise pertanto di ampliare ulteriormente la gamma di concentrazione solo per Ca2 + (iterazione 4). Questa procedura è stata ripetuta due volte (iterazione 5 e 6) fino a quando non è stata trovata una saturazione del segnale GFP. Questa saturazione è spiegata dalla precipitazione di sali di Ca per le concentrazioni applicate di Ca2 +, che non sono disponibili per le cellule.
Come risultati sperimentali sono sempre turbati dal rumore, l'interpolazione Kriging risultante appare irregolare e ispezione visiva potrebbe condurre a conclusioni false. Tuttavia, la gamma di concentrazione ottimale di componenti multimediali per il segnale GFP saturo può essere identificata attendibilmente con lo statistica z -test, che viene inoltre implementato in KriKit. Il test z -utilizza direttamente le intrinseche informazioni statistiche fornite da Kriging metodo, cioè, i valori di previsione e incertezze di pronostico. Figura 6 B Mostra l'altopiano identificato, come determinato e visualizzati utilizzando KriKit casella degli strumenti.Casella degli strumenti KriKit è liberamente disponibile36 e viene fornito con un dettagliato tutorial che spiega come utilizzare le sue caratteristiche.
Se vengono trovati più di due componenti rilevanti, visualizzazione 3D raggiunge il limite. KriKit fornisce diversi altri metodi di rappresentazione visiva possibile quali film o "trama di screening". Se il potenziale ottima si trova all'interno dell'intervallo di concentrazione definita, nuovi esperimenti automaticamente sono progettati utilizzando il miglioramento previsto40,46. Il disegno sperimentale basato sul miglioramento previsto è integrato nel pannello degli strumenti KriKit. Informazioni più dettagliate si trovano nella documentazione del software.
Dopo la procedura iterativa, è stata condotta una verifica dei risultati, come descritto nella parte D. La validità dell'ipotesi iniziale era controllata eseguendo un'analisi di sensibilità aggiuntivi utilizzando la composizione media ottimale. Cioè, tutti i componenti di media iniziale di interesse sono state varie, ma Ca2 + e Mg2 + sono stati impostati i livelli di concentrazione ottimale. In questo studio, le concentrazioni ottimali <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref e <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6,8 x Ref sono stati scelti. La tabella 2 Mostra i risultati dello screening convalida. Simile alla sensibilità iniziale di screening (cfr. tabella 1), NH4+ ancora ha una notevole influenza negativa e restanti effetti sono ancora trascurabili.
Grazie al facile accesso, il segnale di fluorescenza di GFP dalla sospensione di coltivazione è stato utilizzato per quantificare il titolo GFP extracellulare durante tutti gli esperimenti. Per motivi di verifica, fluorescenza GFP è stata convalidata contro altre misurazioni. Perché GFP è secreta via la via di Tat, il segnale di fluorescenza non può discriminare tra intra - ed extracellulare GFP. Così, coltivazioni sono state riprodotte utilizzando il mezzo di riferimento e il supporto ottimizzato. Oltre alla misura di fluorescenza da surnatanti di coltura senza cellula, contenuto proteico è stato quantificato dall'analisi di Bradford e (semi)-miglioramento qualitativo di GFP visualizzata da SDS-Page15. Misura risultante tutti i segnali erano approssimativamente raddoppiato per coltivazioni con mezzo ottimizzato rispetto alle medie di riferimento e convalidato i circa 100% di miglioramento delle prestazioni di secrezione del mezzo ottimizzato. Di conseguenza, la fluorescenza specifica GFP della sospensione di coltivazione può essere considerata una metrica adatta per l'obiettivo di ottimizzazione, vale a dire, il titolo GFP extracellulare.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Figura 2 : Screenshot dall'elenco per analisi di sensitività pipettaggio volume. Le voci nella prima colonna assegna un identificatore univoco a tutti i volumi di una riga; Questo identificatore è il MTP ben numero della coltivazione destinazione MTP sul piano liquido gestore, cfr . Figura 4C. Restanti colonne encode volumi per diverse soluzioni ("Sln-01" a "Sln-15") per essere dispensato. Il volume cumulativo di una riga corrisponde al volume finale di coltivazione del corrispondente bene. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Figura 3 : Screenshot dal liquido gestione software di controllo "WinPREP". Sinistra: Ordinato da riga comandi, tra cui un comando di trasferimento per ogni soluzione di riserva essere dispensato. Prima il comando finale per aggiunta di inoculo, è inserito un prompt utente affinché che la cultura di seme è posto al tavolo giusto in tempo. A destra: Disegno schematico del worktable, compresi l'attrezzatura di laboratorio di origine per variazione delle scorte (due piastre pozzi profondo con 12 pozzetti colonna-like), il trogolo di reagente per resto Stock, acqua e inoculo e la coltivazione di destinazione di preparazione media MTP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Figura 4 : Compilazione delle schermate dettagliate per l'installazione del pipettaggio di una soluzione di riserva. (A) comando per il pipettaggio di Stock in Fe da scartare. Labware fonte e origine ben all'interno sono contrassegnati sul piano di lettura telaio e colonna rossa della piastra pozzo profondo corrispondente. Labware destinazione e pozzi di destinazione all'interno sono contrassegnati dal telaio blu intorno e blu pozzi della coltivazione destinazione MTP. (B) Vedi esempio dettagliato su incarico di pipettaggio volumi per questo passaggio (soluzione Fe). Numero di destinazioni viene letto dall'elenco pipettaggio, quale ha 48 righe. I volumi di erogazione per tutti i pozzi di destinazione per la soluzione Fe è individuato nella colonna 4 l'elenco pipettaggio. Si noti che la prima colonna nell'elenco pipettaggio contiene gli identificatori e non volumi per essere trasferiti, Vedi Figura 2. (C) Dettagli sulla destinazione ben numerazione. Volumi scritti nella riga #1 dell'elenco pipettaggio corrispondente verranno essere pipettati in pozzo contrassegnato come #1 e così via. Wells #01, #08, #41 e #48 corrispondono a pozzi A01, A08, F01 e F08 per la codifica alfa-numerico, che è anche stampato in coltivazione MTP stessa. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Figura 5 : Risultati dalla prima iterazione dettagliati. (A) interpolazione Kriging basata su dati sperimentali di iterazione 1. Punti rossi indicano il set di dati. Per confronto, tutte le superfici di interpolazione tre sono sovrapposti in una trama (blu scuro: 0 x Ref, a scacchi: 1 x Ref, blu chiaro: 2 x Ref). Una rappresentazione alternativa dei risultati può essere trovata altrove15. (B) interpolazione Kriging basata sugli esperimenti eseguiti in iterazione 1 (punti rossi) e iterazione 2 (quadrati gialli).Parti dei dati presentati in questa figura sono stati precedentemente pubblicati15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Figura 6 : Rappresentazione dei risultati di ottimizzazione in modo iterativo raccolti. Kriging finale (A) modello di previsione. (B) Identificazione statistica dell'area ottima (rosso) basato sulla statistica z-test, che è fornito da KriKit. Riquadri indicano le fasi successive di progettazione iterativa ed esecuzione degli esperimenti. Parti dei dati presentati in questa figura sono stati precedentemente pubblicati15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Valore medio coefficiente normalizzato</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0,08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>-0,05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0,10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0,03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: risultati delle analisi di sensibilità. Valori del coefficiente che rappresenta l'effetto medio quando si aumenta la concentrazione del componente rispettivi media rispetto al valore di centro al suo valore massimo. Per ottimale disegni sperimentali, come trovato in letteratura standard e utilizzato qui, la deviazione standard rappresenta direttamente la variazione sperimentale a causa della replica dell'esperimento di riferimento. Valori del coefficiente sono stati normalizzati dal valore maxium (0,0422 per componente Ca2 +). Deviazione standard coefficiente normalizzato e assoluto è 0.54 e 0.0226, rispettivamente.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Valore medio coefficiente normalizzato</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0,52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI2 +</td>
			<td>0,69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0,51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0,45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: risultati delle analisi di sensibilità finale. Valori del coefficiente che rappresenta l'effetto medio quando si aumenta la concentrazione del componente rispettivi media rispetto al valore di centro al suo valore massimo. Come è stato utilizzato un disegno sperimentale Ottimo, la deviazione standard dipende solo la variazione sperimentale utilizzando la composizione media ottimizzata. Variazione sperimentale è leggermente aumentato rispetto la variazione utilizzando il mezzo di riferimento. Valori del coefficiente sono stati normalizzati dal valore maxium (0.0106 per componente Mn2 +). Deviazione standard coefficiente normalizzato e assoluto è 3.63 e 0.0385, rispettivamente.

Questo manoscritto descrive un approccio generico per la progettazione su misura di media di coltura microbica. Questa opzione è attivata da un flusso di lavoro iterativo che unisce Kriging sperimentale design e microbioreactor tecnologia per una velocità effettiva coltivazione sufficiente, che è supportata da robotica lab per aumentare affidabilità e velocità nella gestione dei mezzi liquidi preparazione.

Protocollo generico per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

L'obiettivo generale di questo flusso di lavoro iterativo che combina la progettazione sperimentale basata su Kringing e la tecnologia dei microbioreattori per una sufficiente produttività di coltivazione è quello di descrivere un approccio generico per la progettazione su misura di terreni di coltivazione microbica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo di bioprocessi microbici, come l'ottimizzazione dei terreni di coltivazione, le condizioni dei bioprocessi e la fenotipizzazione dei ceppi. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando ci siamo chiesti se i terreni di coltura ottimizzati per la produzione di piccoli metaboliti fossero anche i più adatti per la produzione di proteine eterologhe.Il vantaggio principale di questa tecnica è che accelera i tempi di sviluppo complessivi grazie a una combinazione intelligente di esperimenti e modellazione. A dimostrare questa procedura sarà Roman Jansen, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Inizia questa procedura con lo studio, l'ideazione e la definizione dei metodi come dettagliato nel protocollo del testo.Sterilizzare le piastre a pozzetti profondi per la conservazione della soluzione madre su un tavolo di lavoro strofinando le piastre con etanolo al 70% e successivamente asciugandole in una cappa a flusso laminare. Iniziare la coltura dei semi inoculando 50 millilitri di terreno BHI contenente 25 milligrammi per litro di kanamicina con un'aliquota dalla banca cellulare di lavoro. Posizionare tutto il materiale da laboratorio necessario sul tavolo di lavoro robotizzato e versare le soluzioni stock nel materiale da laboratorio corrispondente.Quindi, avviare il flusso di lavoro robotico per la preparazione dei terreni in modo che l'ultima fase, che è l'inoculazione, sia raggiunta in tempo per l'inizio della coltura delle sementi. Campionare la coltura dei semi dopo circa due ore per monitorare la crescita misurando la densità ottica a 600 nanometri o O-D-600. Continua a monitorare la crescita ad ogni ora.Dopo circa cinque ore, la coltura raggiunge un O-D-600 tra le tre e le quattro e viene utilizzata per inoculare le colture principali. Posizionare la coltura dei semi sul tavolo di lavoro del gestore dei liquidi e continuare il protocollo di preparazione dei terreni. Sigillare le piastre per microtitolazione di coltivazione dopo l'inoculazione.Quindi, posiziona la coltivazione sigillata M-T-P nel dispositivo Biolector. Quindi, avvia il protocollo di coltivazione predefinito. Se necessario, smaltire le soluzioni madre rimanenti secondo le norme di biosicurezza.Quindi, semina la coltura dal tavolo di lavoro robotico. Pulire il materiale da laboratorio riutilizzabile prima di iniziare il protocollo di decontaminazione del gestore di liquidi. Arrestare le impostazioni cultura principali dopo un'esecuzione di 17 ore ed elaborare i dati come descritto nel protocollo di testo.Per quantificare il titolo G-F-P, trasferire prima le sospensioni cellulari da tutti i pozzetti di coltivazione in provette di reazione prelabate. Quindi, centrifugare le sospensioni cellulari per 10 minuti alla massima velocità utilizzando una centrifuga da banco per ottenere il surnatante privo di cellule. Quindi, trasferire 200 microlitri di ciascun surnatante privo di cellule in un M-T-P nero a 96 pozzetti con fondo trasparente.Leggere la fluorescenza specifica G-F-P a 488 nanometri per l'eccitazione e a 520 nanometri per la lunghezza d'onda di emissione utilizzando un apposito lettore di micropiastre. Dopo aver misurato la fluorescenza G-F-P, la micropiastra può essere utilizzata direttamente per la determinazione del contenuto proteico dei surnatanti liberi da cellule con protocolli standard come un test Bradford o B-C-A. Infine, procedi all'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.La procedura dimostrata costituisce un ciclo di esperimenti, i risultati vengono utilizzati per progettare ulteriori cicli con il massimo miglioramento atteso del segnale GFP. Gli esperimenti di riferimento vengono inseriti in ogni round per analizzare la variabilità dei dati e rilevare i valori anomali sperimentali. Questo grafico di contorno fornisce una panoramica della procedura di ottimizzazione.L'analisi del set di dati raccolti attraverso l'iterazione tre ha rivelato una limitazione dell'effetto positivo del magnesio, identificando un intervallo di concentrazione ottimale. Si è quindi deciso di espandere ulteriormente l'intervallo di concentrazione solo per il calcio nell'iterazione quattro. La procedura è stata ripetuta due volte nell'iterazione cinque e sei fino a quando non è stata trovata una saturazione del segnale GFP.Questa saturazione è spiegata dalla precipitazione del sale di calcio per le concentrazioni di calcio applicate, che non sono disponibili per la cellula. La settima iterazione è stata utilizzata per esplorare i confini in modo più dettagliato. Gli intervalli di concentrazione ottimali dei componenti del fluido per il segnale G-F-P saturo possono essere identificati in modo affidabile con un test Z statistico.Mostra il plateau identificato come determinato e visualizzato utilizzando la cassetta degli attrezzi del kit Kringing. La cassetta degli attrezzi del kit Kringing è disponibile gratuitamente e viene fornita con un tutorial dettagliato che spiega come utilizzare le sue funzionalità. La natura generica del protocollo presentato consente vari adattamenti, come lo studio di altri ospiti di espressione microbica o l'ottimizzazione di altre proprietà della proteina bersaglio, come il pattern di glicosilazione o i legami disolfuro.L'integrazione di un sistema embrion aumenta la produttività sperimentale, il che consente un grande risparmio di tempo Quando si sostituiscono bioreattori completamente controllabili e influenti con sistemi amniar, è necessario considerare la scalabilità dei risultati. La modellazione matematica e la progettazione di esperimenti aiutano a massimizzare il contenuto informativo dei dati di misura rispetto all'obiettivo studiato.

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Bioingegneria

Si descrive un metodo per la purificazione per affinità-tag di proteine ​​ricombinanti utilizzando liquido movimentazione robotica. Questo metodo è generalmente applicabile alla piccola scala purificazione di solubili His-tagged proteine ​​in una high-throughput formato.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

Fonte: Hemmerich, J., et al. Protocollo per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando la tecnologia automatizzata dei microbioreattori. J. Vis. Esp. (2017).Questo video dimostra l'uso di un microbioretore automatizzato per monitorare la crescita batterica e la secrezione di proteine fluorescenti in risposta a diverse formulazioni di mezzi. Un batterio geneticamente modificato che esprime una proteina fluorescente secretoria viene coltivato sotto selezione antibiotica...

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Questo protocollo di cinque giorni delinea tutte le fasi, attrezzature e software supplementare necessario per la creazione e l'esecuzione di un sistema di espressione TX-TL cell-free da zero efficiente Escherichia coli endogeno basato. Con i reagenti, il protocollo dura 8 ore o meno per impostare una reazione, raccogliere e elaborare i dati.

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Abbiamo progettato una apparecchiatura per le colture in continuo per l'uso con i sistemi optogenetic per illuminare le culture di microbi e regolarmente celle di immagine negli effluenti con un microscopio invertito. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo che le risposte dinamiche a illuminazione possono essere misurati per diversi giorni.

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Questo protocollo dettaglia i passaggi, i costi e attrezzature necessarie per generare e. coli-base di estratti cellulari e implementare in vitro reazioni di sintesi di proteine entro 4 giorni o meno. Per sfruttare la natura flessibile di questa piattaforma per vaste applicazioni, discutiamo le condizioni di reazione che possono essere adattate e ottimizzate.

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Qui, presentiamo una procedura dettagliata per eseguire un progetto di esperimento in un micro-bioreattore automatizzato seguito dal raccolto cellulare e dalla quantificazione delle proteine utilizzando una colonna di proteine A.

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Il controllo optogenetico del metabolismo microbico offre un controllo dinamico flessibile sui processi di fermentazione. Il protocollo qui mostra come impostare fermentazioni regolate dalla luce blu per la produzione chimica e proteica a diverse scale volumetriche.

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Questo protocollo fornisce un metodo per l'ottimizzazione globale sistematica di biosensori geneticamente codificati attraverso la generazione e la valutazione di librerie genetiche assistite dall'automazione. A ciò si aggiungono metodologie di progettazione dell'esperimento per semplificare la sperimentazione e consentire la selezione di componenti genetici per regolare i biosensori in base a risultati di progettazione specifici.

Campionamento efficiente dello spazio di progettazione di biosensori geneticamente codificati grazie alla progettazione di esperimenti e al flusso di lavoro di automazione

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standard ad alta produttività per lo screening dei microrganismi industriali. Consiste nella costruzione di una libreria mutante tramite mutagenesi ARTP, nell'esecuzione di screening positivo delle gocce con microfluidica automatizzata, e successivamente nella verifica dei risultati. L'affidabilità del flusso di lavoro è stata convalidata tramite lo screening di ceppi ad alta resa di B. coagulans .

Screening ad alta produttività dei mutanti di Bacillo coagulante iperproduttore di acido lattico L-lattico utilizzando una piattaforma microfluidica automatica a gocce

Scopri un metodo iterativo per ottimizzare i mezzi di coltura microbici utilizzando la progettazione sperimentale basata su Kriging e la tecnologia dei microbioreattori. Questo approccio accelera lo sviluppo dei bioprocessi.

Protocollo generico per lottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor (Video) | JoVE Journal

Protocollo generico per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor

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