Rigenerazione di microelettrodi oro allinearono attrezzata per un analizzatore in tempo reale delle cellule

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rigenerare le piastre elettroniche commerciali equipaggiate per un analizzatore di celle in tempo reale, o RTCA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della rigenerazione dei chip monouso a base di oro, inclusa la rigenerazione dei piani elettronici utilizzati in RTCA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la procedura di rigenerazione può essere condotta utilizzando reagenti di laboratorio delicati e prontamente disponibili con bassa tossicità.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a utilizzare il Real-Time Cell Analyzer, che costa chip basati sull'oro. Iniziare questa procedura con l'incubazione e la proliferazione delle cellule A549 in una piastra di coltura cellulare come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 150 microlitri di terreno cellulare a ciascun pozzetto di incubazione della piastra elettronica L8. Lasciare la piastra per 30 minuti nella cappa di biosicurezza per l'equilibratura.

Dopo 30 minuti, inserire manualmente la piastra elettronica L8 nel Real-Time Cell Analyzer nell'incubatore a CO2 a 37 gradi Celsius. Quindi, avviare il programma operativo Real-Time Cell Analyzer sul computer. Nella pagina di configurazione del modello di esperimento predefinito, selezionare Modello esperimento e assegnare un nome al test in esecuzione.

Nella pagina di layout, selezionare i pozzetti corrispondenti inclusi nell'esperimento e inserire le informazioni come il tipo di cellula, il numero e i nomi dei farmaci nelle caselle di modifica. Nella pagina di pianificazione, aggiungere i passaggi sperimentali, quindi selezionare il tempo di esecuzione di ogni passaggio e l'intervallo di acquisizione dei dati in tempo reale. Fare clic su Avvia per misurare l'impedenza di fondo del supporto.

Il file dell'esperimento verrà salvato. I dati risultanti verranno sottratti automaticamente. Nella pagina del grafico, aggiungi i pozzetti e verrà mostrato il grafico dell'indice della cella temporale.

Per l'esperimento di proliferazione cellulare, fare prima clic sul pulsante di pausa per mettere in pausa il programma. Quindi estrarre la piastra elettronica e aggiungere 100 microlitri di tampone di sospensione cellulare A549 per pozzetto a temperatura ambiente. Lasciare la piastra per 30 minuti nella cappa di biosicurezza per consentire alle cellule di depositarsi sul fondo dei pozzetti di incubazione.

Inserire manualmente la piastra elettronica nella stazione di analisi delle celle in tempo reale. Quindi fare clic sul pulsante di avvio per continuare l'esperimento. Nella pagina del tracciato, l'analizzatore registra continuamente i valori dell'indice delle celle, o curve, durante l'esperimento.

Al termine dell'esperimento, accedere alla pagina del tracciato e aprire il file dell'esperimento. Quindi selezionare tutti i pozzetti di incubazione testati e le curve dell'indice cellulare risultanti che possono essere mediate o normalizzate per l'ultima volta prima di aggiungere farmaci o cambiare terreno per ridurre le variazioni tra i saggi. Nella pagina di analisi dei dati, è possibile calcolare EC50 o IC50.

Dopo aver eseguito la valutazione della citotossicità del farmaco antitumorale come descritto nel protocollo di testo, estrarre la piastra elettronica contenente le cellule dalla stazione di analisi cellulare in tempo reale. Collocare la piastra elettronica usata in una cappa sterile di biosicurezza a temperatura ambiente e mescolare accuratamente il terreno di coltura utilizzando una pipetta. Quindi utilizzare una pipetta per aspirare l'intero terreno.

Sciacquare le piastre elettroniche con 200 microlitri di acqua deionizzata per tre volte a temperatura ambiente. Digerire le cellule rimanenti sulle piastre elettroniche con lo 0,25% di tripsina appena preparata per una o due ore in un incubatore a 37 gradi Celsius. Al termine della digestione, lavorare nella cappa di biosicurezza a temperatura ambiente per mescolare la soluzione di incubazione da cinque a 10 volte utilizzando una pipetta, quindi rimuovere la soluzione.

Sciacquare due volte le piastre elettroniche con 200 microlitri di acqua deionizzata. Quindi lavare due volte con 200 microlitri di etanolo al 100%, seguito due volte dallo stesso volume di etanolo al 75%. Infine, risciacquare due volte con altri 200 microlitri di acqua deionizzata.

Capovolgere la piastra elettronica su una garza sterile o carta velina per decantare l'acqua rimanente a temperatura ambiente. Quindi eseguire la sterilizzazione a raggi ultravioletti sulla piastra elettronica rigenerata per una o due ore nella cappa di biosicurezza a temperatura ambiente. Dopo aver utilizzato le piastre per la somministrazione di farmaci utilizzando materiale mesoporoso come descritto nel protocollo di testo, digerire le cellule rimanenti con tripsina come prima.

Poiché la pipetta viene utilizzata frequentemente negli esperimenti, la persona deve prestare attenzione per evitare di graffiare la punta e la superficie dei microchip. Sciacquare i microchip con 200 microlitri di acqua deionizzata una volta nella cappa di biosicurezza a temperatura ambiente. Quindi far lievitare i microchip con 200 microlitri di etanolo assoluto due volte a temperatura ambiente.

Quindi, sciacquare i microchip con 200 microlitri di etanolo al 75% una volta a temperatura ambiente. Aggiungere 250 microlitri di etanolo al 75% in ogni pozzetto e sigillare la piastra elettronica con la pellicola sigillante a temperatura ambiente. Dopo aver fatto girare la piastra elettronica a 114 volte G per due minuti, svuotare la piastra.

Capovolgere la piastra elettronica su una garza sterile o carta velina per decantare il liquido rimanente a temperatura ambiente. Ripetere i risciacqui con etanolo al 75% seguiti dalla centrifuga. Quindi eseguire la sterilizzazione a raggi ultravioletti sulla piastra elettronica rigenerata per una o due ore nella cappa di biosicurezza a temperatura ambiente.

Valutare le caratteristiche ottiche della superficie della piastra elettronica rigenerata smontando prima la parte inferiore del pozzo di incubazione come descritto nel protocollo di testo. Per valutare la vitalità delle cellule attaccate dopo l'assorbimento del farmaco antitumorale sulle piastre elettroniche fresche e rigenerate, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser per monitorare la fluorescenza spontanea delle molecole di DOX assorbite dalle cellule A549. Per registrare la fluorescenza spontanea della DOX assorbita dalle cellule, utilizzare un obiettivo a olio 63x e 485 nanometri come lunghezza d'onda di eccitazione.

Successivamente, valutare i comportamenti elettrochimici degli elettrodi rigenerati lucidando prima l'elettrodo d'oro e l'elettrodo di carbonio vetroso su una superficie simile a uno specchio con un illuminoimpasto su un panno lucidante. Quindi sonicare gli elettrodi in acqua per rimuovere eventuali particelle. Quindi, attiva l'elettrodo d'oro in acido solforico 0,5 molari.

Ottenere la spettroscopia di impedenza elettrochimica, o dati EIS, dell'elettrodo d'oro nudo e dell'elettrodo di carbonio vetroso in una soluzione di potassio-cloruro-elettrolita da 10 millimolari, contenente un ferocianuro di potassio millimolare. Ora, far cadere 10 microlitri di una sospensione cellulare sulla superficie dell'elettrodo d'oro nel GCE. Dopo aver aggiunto le celle, incubare l'elettrodo d'oro nel GCE in un incubatore a 37 gradi Celsius per tre ore prima di ottenere i dati EIS degli elettrodi modificati con le celle, come descritto nel protocollo di testo.

Per rigenerare gli elettrodi, immergere l'elettrodo d'oro nel GCE modificato con celle in tripsina allo 0,25% per 0,5-2 ore. Sciacquare delicatamente entrambi gli elettrodi con acqua quattro volte. Quindi, sciacquare delicatamente gli elettrodi con etanolo assoluto quattro volte.

Quindi, immergere l'elettrodo d'oro nel GCE in etanolo al 75% per circa cinque minuti. Dopo cinque minuti, sciacquare delicatamente il chip con etanolo al 75% quattro volte prima di ottenere i dati EIS degli elettrodi rigenerati, come descritto nel protocollo di testo. Per valutare l'efficienza di rigenerazione della lastra elettronica d'oro in array, sono state effettuate osservazioni microscopiche sia per le piastre elettroniche fresche che per quelle trattate.

Non è stata riscontrata alcuna differenza virtuale nelle proprietà ottiche della superficie del microchip. La troescenza delle molecole di doxorubicina viene utilizzata per valutare lo stato cellulare sui microchip d'oro prima e dopo la rigenerazione. L'omogeneità simile e la morfologia cellulare ben definita hanno dimostrato la riutilizzabilità dei chip.

Il protocollo di rigenerazione viene applicato per il vero test di proliferazione cellulare. Le curve di crescita ottenute da più pozzetti di incubazione di una piastra elettronica testata mostrano una buona consistenza, indicando il successo della rigenerazione del chip commerciale. Qui mostrata, la piastra elettronica rigenerata L8 è stata testata per la valutazione della citotossicità utilizzando materiali di silice mesoporosa.

L'indice cellulare del campione trattato con materiali mesoporosi è diminuito rispetto al controllo, indicando una leggera citotossicità dei materiali. L'ulteriore incapsulamento e rilascio del farmaco antitumorale doxorubicina da parte di materiali mesoporosi ha causato una drastica diminuzione della curva di crescita delle cellule A549. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente.

Durante l'esecuzione di questa procedura è importante ricordare che il tipo di tempo di digestione del lavello può variare da truciolo a truciolo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia confocale a scansione laser, o anche la spettroscopia, la spettroscopia di impedenza elettrochimica per rispondere a ulteriori domande come la valutazione dell'effetto di rigenerazione.