RGB e Imaging spettrale radice per pianta Phenotyping e ricerca fisiologica: messa a punto sperimentale e protocolli di Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere informazioni complete sulle radici delle piante che crescono in rizobox riempite di terreno combinando diversi metodi di imaging. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fenotipizzazione e del miglioramento genetico delle piante, come il contributo delle diverse architetture radicali, a una migliore resistenza agli stress abiotici. Il vantaggio principale di questo approccio è che combina l'imaging RGB per l'architettura di root e l'imaging iperspettrale per la funzionalità di root.

Il potenziale dell'utilizzo dell'imaging iperspettrale per le radici si estende a un'ampia gamma di parametri della rizosfera perché le informazioni spettrali possono rivelare cambiamenti fisico-chimici su piccola scala introdotti dalle radici delle piante. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di riempimento del rizobox devono essere eseguite con attenzione. In caso contrario, la crescita e la visibilità delle radici saranno influenzate negativamente.

Iniziare questa procedura con la preparazione delle rizobox per il riempimento del substrato come descritto nel protocollo di testo. Pre-bagnare il terreno asciutto a un contenuto gravimetrico di acqua di 0,108 grammi per grammo aggiungendo 400 grammi di acqua per 3.705 grammi di terreno asciutto. Mescolare delicatamente il terreno e l'acqua per ottenere una distribuzione omogenea dell'acqua.

Interrompere manualmente gli aggregati più grandi per mantenere la dimensione delle particelle inferiore o uguale a due millimetri. È fondamentale ottenere uno strato omogeneo di terreno vicino alla finestra di osservazione del gas evitando vuoti d'aria. Le punte delle radici delle piante si disidratano rapidamente, crescendo nelle fessure d'aria.

Anche la qualità spettrale dell'immagine per la mappatura dell'acqua è influenzata negativamente. Riempire il terriccio pre-bagnato nelle scatole rizometriche aperte e compattarlo delicatamente utilizzando un foglio di polistirene per coprire il volume interno della scatola, ottenendo così una densità apparente omogenea di 1,3 grammi per centimetro cubo. Aggiungere la quantità d'acqua rimanente per raggiungere il contenuto d'acqua target di 0,31 centimetri cubi per centimetro cubo spruzzando sulla superficie con un flacone spray.

Garantire una goccia di piccole dimensioni per evitare il degrado della struttura superficiale e una bagnatura omogenea. Tenere la scatola in equilibrio durante la spruzzatura per monitorare la quantità di acqua effettivamente aggiunta al substrato. Lasciare ridistribuire l'acqua per 10 minuti, quindi premere il bicchiere sulla superficie e fissarlo con le guide metalliche laterali.

Il peso finale medio delle rizocasse con substrato bagnato era di 17.818 grammi più o meno. Equipaggia la camera climatica con otto lampade a LED che forniscono un'illuminazione omogenea di 450 micromoli per metro quadrato al secondo con picchi spettrali a 440 e 660 nanometri per una crescita ottimale delle piante. Dopo aver impostato i parametri ambientali in base alle esigenze della pianta e della sperimentazione, coprire la vetrata con una lastra di legno per mantenere la zona radicale al buio ed evitare la formazione di alghe dovute alla luce che penetra attraverso la superficie del vetro.

Quindi posizionare i rizobox con un'inclinazione di 45 gradi utilizzando un'adeguata struttura metallica. Questo massimizza la crescita delle radici verso la superficie del vetro a causa del gravitropismo. Per l'imaging radice, illumina il rizobox utilizzando quattro tubi luminosi fluorescenti da 24 watt collegati a una distanza di 80 centimetri dal rizobox.

Monta anche quattro tubi UV da 15 watt a 20 centimetri dall'illuminazione alternativa del rizobox utilizzando l'autofluorescenza della radice in caso di basso contrasto tra la radice e lo sfondo del substrato dai colori vivaci. Accendere le lampade UV e quindi montare il rizobox da rivisualizzare nel supporto della scatola di imaging. Quindi, scatta due immagini per coprire la metà superiore e inferiore di un rizobox con una sovrapposizione di circa tre centimetri.

Acquisire ed elaborare le immagini RBG come descritto nel protocollo di testo. Infine, eseguire l'analisi delle immagini radice RBG acquisite e successivamente controllare se ci sono regioni che non corrispondono. In questo caso, definire un'area di esclusione e riavviare l'analisi.

Per le radici non classificate, aggiungere ulteriori classi di colore e riavviare l'analisi. Per gli elementi erroneamente classificati come radici, attivare o aumentare le opzioni di filtraggio dei detriti e dei bordi ruvidi. Eseguire l'acquisizione delle immagini determinando prima i tempi di integrazione della telecamera per la scansione del rhizobox e lo standard del bianco nel software della fotocamera.

Per fare ciò, aprire l'interfaccia grafica di imaging e spostare la fotocamera in una posizione del rizobox in cui sono presenti le radici. Regolare il tempo di integrazione della telecamera che punta un oggetto leggero in modo che circa l'85% dell'intera gamma dinamica della telecamera venga utilizzato sull'istogramma visualizzato dal software. Impostare correttamente il tempo di integrazione per i diversi substrati e tessuti radicali è fondamentale per sfruttare appieno la gamma dinamica della telecamera a infrarossi, evitando qualsiasi perdita di informazioni dovuta al superamento della sua portata.

Ripetere la procedura per lo standard del bianco spostando il sistema di posizionamento della telecamera in modo che miri allo standard del bianco prima di chiudere il software della fotocamera. Quindi, apri la GUI di imaging Matlab e inserisci tutte le impostazioni dalla scansione del rizobox corrente. Acquisisci gli standard di bianco e scuro prima di ogni esecuzione di imaging una volta al giorno.

Lo standard scuro rappresenta il rumore della telecamera, mentre lo standard bianco offre la massima riflettività. Questi dati sono necessari per la normalizzazione dell'immagine durante la pre-elaborazione. Definisci se viene scansionato l'intero rizobox o solo una parte di esso.

Per il caso in questione, vengono riprodotti interi rizobox. Quindi avvia la scansione. Per la misurazione spettrale del contenuto d'acqua, è necessario un rizometro di calibrazione.

Suddividi una rizocassetta in scomparti di cinque centimetri utilizzando fogli di polistirolo per riempirli di terra a diversi contenuti d'acqua. Scansiona il rizobox di calibrazione con le stesse impostazioni utilizzate per i rizobox piantati. Ad esempio, per combinare i tratti radicali e fuori terra, procurarsi il porometro fogliare per la misurazione della conduttanza degli stomi.

Equilibrare il dispositivo in base alle condizioni ambientali per almeno un'ora nella camera climatica. Prendi le misure da almeno tre foglie per pianta. Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa della crescita delle radici della cultivar di barbabietola da zucchero, Ferrara, basata sull'imaging RGB.

A 35 giorni dalla semina, le radici delle piante si sono allungate fino a raggiungere il fondo del rizobox. Alcuni assi radice nella parte superiore del rizobox non potevano essere segmentati dalle immagini RGB. La senescenza delle radici basali più vecchie cambia il loro colore in marrone.

Pertanto, la separazione tra queste radici e lo sfondo del suolo basata su una soglia di colore fallisce. Utilizzando l'imaging iperspettrale, la segmentazione si basa su diverse caratteristiche spettrali del primo piano della radice e dello sfondo del suolo. Ciò migliora il risultato della segmentazione.

Le differenze nella lunghezza della radice misurata rispetto a un'immagine di riferimento tracciata manualmente sono solo dell'1,5%Inoltre, l'imaging spettrale consente una mappatura precisa del contenuto d'acqua intorno alla radice per dedurre l'assorbimento d'acqua. Qui sono lo scheletro della radice è mostrato in nero. Le aree più chiare mostrano regioni di maggiore esaurimento dell'acqua vicino agli assi delle radici.

Mentre le aree blu più scure rappresentano regioni con un contenuto d'acqua del suolo più elevato al di fuori della portata delle radici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riempire correttamente le rizobox per garantire una crescita e una visibilità soddisfacenti delle radici. Questa è la base per l'imaging successivo e per i risultati rappresentativi della fenotipizzazione delle radici.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi per la classificazione spettrale come il clustering K-means o le macchine a vettori di supporto per ottenere informazioni approfondite sulle proprietà delle radici e della rizosfera come la senescenza e la decomposizione delle radici. Una volta stabilita, questa tecnica consente di fenotipizzare in modo completo i sistemi radicali e la risposta allo stress abiotico. Un set di 10 cultivar può essere caratterizzato con una durata sperimentale totale inferiore a tre mesi.