RGB e Imaging spettrale radice per pianta Phenotyping e ricerca fisiologica: messa a punto sperimentale e protocolli di Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere informazioni complete sulle radici delle piante che crescono in rizocasse riempite di suolo, combinando diversi metodi di imaging. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della fenotipizzazione e dell'allevamento vegetale, come il contributo di diverse architetture radicali a una migliore resistenza allo stress abiotico. Il vantaggio principale di questo approccio è che combina l'imaging RGB per l'architettura radicale e l'imaging iperspettrale per la funzionalità radicale.

La potenzialità dell'uso dell'immagine iperspettrale per le radici si estende a un'ampia gamma di parametri della rizosfera, poiché le informazioni spettrali possono rivelare cambiamenti fisico-chimici su piccola scala indotti dalle radici delle piante. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di riempimento della rizobox devono essere eseguite con attenzione. In caso contrario, la crescita radicale e la visibilità delle radici risulteranno compromesse.

Avviare questa procedura preparando le scatole radicolari per il riempimento del substrato, come descritto nel protocollo testuale. Inumidire il terreno secco fino a un contenuto idrico gravimetrico di 0,108 grammi per grammo, aggiungendo 400 grammi di acqua a 3.705 grammi di terreno secco. Mescolare delicatamente il terreno e l'acqua per ottenere una distribuzione omogenea dell'acqua.

Disintegrare manualmente gli aggregati più grandi per mantenere la dimensione delle particelle inferiore o uguale a due millimetri. È fondamentale ottenere uno strato omogeneo di suolo accanto alla finestra di osservazione del gas, evitando interstizi d'aria. Le punte radicali delle piante si disidratano rapidamente quando crescono negli interstizi d'aria.

Anche la qualità dell'immagine spettrale per la mappatura dell'acqua risente negativamente. Riempire le rizocasse aperte con il terreno pre-umettato e compattarlo delicatamente utilizzando un foglio di polistirene per coprire il volume interno della cassetta, ottenendo così una densità apparente omogenea di 1,3 grammi per centimetro cubo. Aggiungere la quantità rimanente di acqua per raggiungere il contenuto idrico desiderato di 0,31 centimetri cubi per centimetro cubo, spruzzandola sulla superficie con un flacone spray.

Assicurarsi una dimensione ridotta delle gocce per evitare il degrado della struttura superficiale, nonché un bagnamento omogeneo. Mantenere la scatola su una bilancia durante la nebulizzazione per monitorare la quantità di acqua effettivamente aggiunta al substrato. Lasciare che l'acqua si ridistribuisca per 10 minuti, quindi premere il vetro sulla superficie e fissarlo con le guide laterali in metallo.

Il peso finale medio dei rizobox con substrato bagnato era di 17.818 più o meno 68 grammi. Dotare la stanza climatica di otto lampade LED che forniscono un'illuminazione omogenea di 450 micromoli per metro quadrato al secondo con picchi spettrali a 440 e 660 nanometri per una crescita ottimale delle piante. Dopo aver impostato i parametri ambientali in base alle esigenze della pianta e dell'esperimento, coprire la finestra di vetro con una piastra di legno per mantenere la zona radicale al buio ed evitare la crescita di alghe dovuta alla luce che penetra attraverso la superficie di vetro.

Quindi posizionare le scatole radicolari a un'inclinazione di 45 gradi utilizzando un adeguato telaio metallico. Questo massimizza la crescita radicale verso la superficie di vetro grazie al gravitropismo. Per l'acquisizione d'immagini radicolari RGB, illuminare la scatola radicolare mediante quattro tubi fluorescenti da 24 watt montati a una distanza di 80 centimetri dalla scatola radicolare.

Montare inoltre quattro lampade UV da 15 watt a 20 centimetri dal sistema di illuminazione alternativo della rhizobox, sfruttando l'autofluorescenza radicale in caso di basso contrasto tra la radice e lo sfondo del substrato di colore chiaro. Accendere le lampade UV e quindi posizionare la rhizobox da acquisire nel supporto della camera di acquisizione. Successivamente, acquisire due immagini per coprire la metà superiore e quella inferiore della rhizobox, con un'area di sovrapposizione di circa tre centimetri.

Acquisire ed elaborare le immagini RGB come descritto nel protocollo testuale. Infine, eseguire l'analisi delle immagini radicarie RGB acquisite e successivamente verificare la presenza di aree non corrispondenti. In tal caso, definire un'area di esclusione e riavviare l'analisi.

Per le radici non classificate, aggiungere ulteriori classi di colore e riavviare l'analisi. Per gli elementi classificati erroneamente come radici, attivare o aumentare le opzioni di filtraggio per detriti e bordi irregolari. Eseguire l'acquisizione delle immagini determinando innanzitutto i tempi di integrazione della fotocamera per la scansione del rhizobox e per lo standard bianco nel software della fotocamera.

A tal fine, aprire l'interfaccia grafica di acquisizione immagini e spostare la telecamera in una posizione del rizobox in cui siano presenti radici. Regolare il tempo di integrazione della telecamera puntando su un oggetto chiaro in modo che circa l'85% del range dinamico completo della telecamera venga utilizzato sull'istogramma visualizzato dal software. Impostare correttamente il tempo di integrazione per diversi substrati e tessuti radicali è fondamentale per sfruttare appieno il range dinamico della telecamera a infrarossi, evitando qualsiasi perdita di informazione dovuta al superamento del suo limite.

Ripetere il processo per lo standard bianco spostando il sistema di posizionamento della telecamera in modo da puntare lo standard bianco prima di chiudere il software della telecamera. Successivamente, aprire l'interfaccia grafica di imaging di Matlab e inserire tutte le impostazioni della scansione attuale della rizocassa. Acquisire gli standard scuro e bianco prima di ogni sessione di acquisizione immagini una volta al giorno.

Il campione scuro rappresenta il rumore della fotocamera, mentre il campione chiaro fornisce la massima riflettanza. Questi dati sono necessari per la normalizzazione delle immagini durante la pre-elaborazione. Definire se viene scansionata l'intera scatola radicale o solo una parte di essa.

Nel caso in esame, vengono acquisite immagini di interi rizobox. Quindi avviare la scansione. Per la misurazione spettrale del contenuto idrico, è necessario un rizobox di calibrazione.

Dividere un rizobox in compartimenti da cinque centimetri utilizzando fogli di polistirene per riempirli con suolo a diversi contenuti di acqua. Scansionare il rizobox di calibrazione con le stesse impostazioni utilizzate per i rizobox piantumati. A titolo di esempio, per combinare caratteristiche radicali e aeree, utilizzare il porometro fogliare per la misurazione della conduttanza degli stomi.

Equilibrare il dispositivo alle condizioni ambiente per almeno un'ora nella camera climatica. Effettuare le misurazioni su almeno tre foglie per pianta. Viene mostrata qui un'immagine rappresentativa della crescita radicale della coltivar di barbabietola da zucchero Ferrara, basata su imaging RGB.

A 35 giorni dalla semina, le radici delle piante si sono allungate fino a raggiungere il fondo della rizocassa. Alcuni assi radicali nella parte superiore della rizocassa non hanno potuto essere segmentati a partire dalle immagini RGB. La senescenza delle radici basali più vecchie ne modifica il colore, che diventa marrone.

Pertanto, la separazione tra queste radici e lo sfondo del suolo basata su una soglia di colore fallisce. Utilizzando l'immagine iperspettrale, la segmentazione si basa su diverse caratteristiche spettrali tra le radici in primo piano e lo sfondo del suolo. Ciò migliora il risultato della segmentazione.

Le differenze nella lunghezza radicale misurata rispetto a un'immagine di riferimento rilevata manualmente sono solo del 1,5%. Inoltre, l'imaging spettrale consente una mappatura dettagliata del contenuto di acqua intorno alla radice per dedurne l'assorbimento. Qui lo scheletro radicale è mostrato in nero. Le aree più chiare indicano regioni di maggiore deplezione di acqua in prossimità degli assi radicali.

Le aree blu più scure rappresentano regioni con un contenuto idrico del suolo più elevato, al di fuori della portata delle radici. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come riempire correttamente le rizocasse per garantire una crescita radicale soddisfacente e una buona visibilità. Questo costituisce la base per successivi imaging e risultati rappresentativi della fenotipizzazione radicale.

Una volta seguita questa procedura, è possibile eseguire altri metodi di classificazione spettrale, come il clustering K-means o le macchine a vettori di supporto, per ottenere informazioni approfondite sulle proprietà delle radici e della rizosfera, come la senescenza e la decomposizione radicale. Una volta stabilita, questa tecnica consente di fenotipizzare in modo completo i sistemi radicali e la risposta allo stress abiotico. Un insieme di 10 cultivar può essere caratterizzato con una durata sperimentale totale inferiore a tre mesi.