Produzione di geneticamente criceti dorati siriani di pronuclei iniezione del complesso CRISPR/Cas9
9 gennaio 2018
Pronuclei iniezione (PN) del cluster regolarmente intervallate brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) e sistema di CRISPR-collegato della proteina-9 nucleasi (CRISPR/Cas9) è un metodo altamente efficiente per produrre geneticamente criceti dorati siriani. Qui, descriviamo il protocollo dettagliato di PN iniezione per la produzione di gene knockout criceti con il sistema CRISPR/Cas9.
L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire agli spettatori procedure dettagliate per produrre criceti dorati siriani geneticamente modificati mediante iniezione pronucleare del complesso CRISPR/Cas9. Questo protocollo di iniezione pronucleare da noi sviluppato nel criceto dorato siriano rende possibile l'ingegneria genetica in questo modello animale. Tale tecnologia rappresenta un notevole contributo nel campo dello sviluppo di modelli animali.
Considerata l'elevata sensibilità degli embrioni di criceto all'ambiente, abbiamo sviluppato un protocollo unico di iniezione pronucleare per adattarsi alle particolari esigenze degli embrioni di criceto. Lo sviluppo di questa tecnica rappresenta un notevole passo avanti nella modellizzazione delle malattie umane, poiché per la prima volta è possibile produrre modelli di criceto geneticamente modificati. Per questo esperimento, un giorno prima dell'iniezione pronucleare (PN), preparare le piastre per la manipolazione dei zigoti e la goccia per l'iniezione PN sotto il coperchio di una piastra da 35 millimetri contenente mezzo HECM-9.
Coprire le gocce di mezzo con olio minerale. Per bilanciare le gocce e il mezzo HECM-9, incubare a 37,5 gradi Celsius durante la notte. Il giorno dell'iniezione di PN, preparare le capsule per il lavaggio degli embrioni utilizzando HECM-9.
Conservarli nell'incubatrice fino al momento dell'utilizzo. Per isolare le ovidutti, posizionare una femmina di criceto superovulata elettronicamente in posizione dorsale su un telo chirurgico. Pulire l'addome con etanolo al 70%.
Successivamente, tenere saldamente la pelle e lo strato muscolare addominale in corrispondenza della linea mediana ed effettuare un'incisione lungo l'estremità dell'addome. Per esporre gli organi addominali, praticare un'incisione nel peritoneo. Successivamente, utilizzare una pinzetta fine per afferrare uno dei corni uterini ed estrarre il tessuto dall'addome.
Separare l'utero dal mesometrio e dal tessuto adiposo. Eseguire il primo taglio tra l'ovidotto e l'ovaio e un secondo vicino alla giunzione ovidotto-utero, includendo una piccola parte dell'utero. Posizionare gli ovidotti nella stessa capsula di Petri.
Per raccogliere gli zigoti sotto il microscopio stereoscopico, utilizzare una pinzetta Dumont di numero cinque per afferrare il lato del corno uterino. Inserire un ago fatto in casa nel lume delle tube di Falloppio dall'estremità infundibolare. Successivamente, lavare la tuba con 300-400 microlitri di mezzo HECM-9.
Immediatamente dopo il lavaggio, raccogliere gli zigoti e lavarli due volte con HECM-9 nella piastra di manipolazione. A questo stadio di sviluppo, tutti gli zigoti devono essere privati delle cellule del cumulo corionico. Subito dopo, posizionare gli zigoti in un incubatore fino all'iniezione per evitare l'esposizione alla luce.
Per prepararsi all'iniezione, scongelare i RNP Cas9-sgRNA sul ghiaccio. Immediatamente prima dell'iniezione, caricare l'ago di iniezione con la soluzione di RNP posizionando l'estremità posteriore dell'ago nel tubo contenente la soluzione, permettendo così al liquido di riempire l'ago per azione capillare. Successivamente, riempire la pipetta portatore con olio minerale fino a circa tre millimetri della curvatura dell'ago. Posizionare il portatore nel microiniettore con la punta della pipetta portatore orizzontale rispetto al fondo della piastra.
Riempire la punta dell'ago con il mezzo mediante aspirazione. Quindi, posizionare l'ago di iniezione a un angolo compreso tra 10 e 15 gradi rispetto al portaaigo. Successivamente, identificare uno zigote e utilizzare l'ago portaaigo per applicare un'aspirazione delicata.
Il pronucleo maschile, leggermente più grande, e quello femminile dovrebbero preferibilmente trovarsi nello stesso piano focale e allineati parallelamente al supporto. Posizionando l'ago di iniezione alle tre in punto, penetrare la zona pellucida e il pronucleo maschile. Una volta che il pronucleo si rigonfia, ritirare rapidamente l'ago di iniezione per evitare che il nucleo aderisca all'ago e per non danneggiarlo.
L'efficienza del targeting genico per i geni STAT2 e RAG1 mediante il sistema Cas9/sgRNA viene valutata in base alla percentuale di nati vivi delle femmine riceventi e al numero di cuccioli nati vivi con le modifiche genetiche previste. I risultati del genotipaggio ottenuti mediante un saggio di polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione PCR, o PCR-RFLP, dei cuccioli mostrano l'efficienza del targeting genico. La corsia uno indica alleli modificati in modo biallelico, mentre le corsie tre e sette mostrano alleli modificati in modo monoallelico, o in maniera mosaicale.
Questa tecnologia ha aperto la strada ai ricercatori nello sviluppo di nuovi modelli di criceto geneticamente modificati per lo studio delle malattie umane. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come produrre criceti dorati della Siria geneticamente modificati mediante iniezione nel pronucleo del complesso CRISPR/Cas9.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo dettagliato per la produzione di criceti dorati siriani geneticamente modificati mediante il sistema CRISPR/Cas9 tramite iniezione nel pronucleo. Il metodo affronta le sfide uniche poste dagli embrioni di criceto, consentendo progressi nello sviluppo di modelli animali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria genetica
- Modelli animali
- Tecnologia CRISPR
Sfondo
- I modelli geneticamente modificati sono fondamentali per la ricerca sulle malattie.
- Gli embrioni di criceto sono particolarmente sensibili alle condizioni ambientali.
- Il sistema CRISPR/Cas9 consente una modifica genica precisa.
- Questo protocollo migliora la fattibilità della creazione di criceti knock-out.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile di iniezione nel pronucleo per i criceti.
- Facilitare la produzione di modelli di criceto geneticamente modificati.
- Contribuire alla modellizzazione delle malattie umane attraverso modelli animali avanzati.
Metodi Utilizzati
- Preparazione delle piastre per la manipolazione dei zigoti.
- Utilizzo del mezzo HECM-9 per l'iniezione nei pronuclei.
- Procedure dettagliate di iniezione nei pronuclei.
- Monitoraggio dello sviluppo embrionale dopo l'iniezione.
Risultati principali
- Produzione con successo di criceti knockout per geni.
- Stabilimento di un protocollo solido per studi futuri.
- Dimostrazione della fattibilità dell'ingegneria genetica nei criceti.
- Potenziale per contributi significativi alla ricerca biomedica.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato rappresenta un notevole progresso nell'ingegneria genetica.
- Apre nuove strade alla ricerca mediante modelli di criceto.
- Studi futuri potranno sfruttare questa tecnica per diverse applicazioni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
L'iniezione pronucleare del complesso CRISPR/Cas9 nei criceti dorati della Siria consente la generazione di modelli geneticamente modificati precedentemente inaccessibili alla ricerca e sviluppo biofarmaceutica. Questo progresso amplia lo strumentario traslazionale per la modellizzazione delle malattie, sostenendo studi preclinici più predittivi e la validazione degli obiettivi terapeutici. Il protocollo affronta le sfide specifiche della manipolazione degli embrioni di questa specie, aprendo nuove strade per la riduzione del rischio meccanicistica e la diversificazione del portafoglio di ricerca.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'interrogazione funzionale di geni bersaglio in un sistema mammifero con rilevanza fisiologica unica.
- Permette la riduzione dei rischi biologici consentendo la valutazione diretta degli effetti dell'eliminazione o dell'inserimento genico in vivo.
- Facilita una previsione affidabile nella selezione dei bersagli mediante manipolazione genetica robusta.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce modelli di criceto geneticamente modificati validati per lo screening fenotipico successivo.
- Standardizza i background genetici per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti riproducibili.
- Consente una valutazione quantitativa dell'efficienza della modifica genica mediante i risultati del genotipaggio PCR-RFLP.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Amplia il repertorio di modelli animali pertinenti alle malattie per l'allineamento traslazionale dei biomarcatori.
- Consente una continuità dalla scoperta genetica alla validazione preclinica in una nuova specie di roditore.
- Riduce le lacune traslazionali modellando i meccanismi delle malattie umane nei criceti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo colloca i criceti dorati della Siria come una nuova piattaforma per la generazione di modelli genetici, creando un ponte tra le fasi della scoperta iniziale e della ricerca preclinica.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi e studi meccanicistici mediante editing genico preciso.
- Screening: Fornisce modelli genetici ben definiti e riproducibili pronti per saggi e test di composti.
- Analisi: Offre risultati di genotipizzazione quantitativa per confrontare l'efficienza di targeting genico tra esperimenti diversi.
- Ricerca traslazionale: Allinea i modelli animali ai fenotipi delle malattie umane per migliorare la rilevanza preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riutilizzabile, adattabile a diversi bersagli genici e aree di patologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di manipolazione e iniezione degli embrioni per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate su avanzamento/cessazione fornendo modelli genetici in vivo robusti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio espandendo le opzioni di modelli per diverse aree terapeutiche.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in microiniezione e conoscenze della fisiologia riproduttiva del criceto.
- Richiede strumentazione precisa per la manipolazione degli embrioni e l'iniezione nei pronuclei.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di coltura degli embrioni e di genotipizzazione.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi bersagli genici o ceppi di criceto.
- La sensibilità degli embrioni impone limitazioni pratiche sulla produttività e sul controllo ambientale.
