Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di purificare e isolare le cellule endoteliali primarie del cervello suino al fine di creare un modello di barriera emato-encefalica in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della barriera emato-encefalica, come la somministrazione di farmaci, la permeabilità, il traffico di recettori, nonché la tenuta e la polarità del BB. Il vantaggio principale di questo modello è l'elevata resa di cellule endoteliali cerebrali primarie che possono essere utilizzate per creare un modello di barriera emato-encefalica in vitro con un alto TEER e una bassa permeabilità. Per iniziare questa procedura, posizionare i cervelli in un banco a flusso sterile e lavarli delicatamente con un litro di PBS in un becher posto sul ghiaccio.

Quindi, rimuovere con cura le meningi da ciascun cervello usando una pinza a punta fine. Usando un bisturi, raschiare via la materia grigia dal cervello uno alla volta e trasferire il materiale isolato in piastre di Petri contenenti 20 millilitri di DMEM/F-12 poste sul ghiaccio. Per la frammentazione iniziale, far passare il materiale della materia grigia attraverso una siringa da 50 millilitri senza l'ago.

Ripeti la procedura per tutti i cervelli e metti insieme il materiale di materia grigia raccolto. Trasferire il materiale isolato della materia grigia con il terreno DMEM/F-12 nel tubo di macinazione di un omogeneizzatore di tessuti portatile. Omogeneizzare il materiale facendo otto colpi su e giù con un pestello sciolto, seguiti da otto colpi su e giù con un pestello stretto.

Successivamente, isolare i capillari filtrando l'omogeneizzato utilizzando un flacone con tappo blu da 500 millilitri con portafiltro e rete filtrante da 140 micron. Collocare i filtri contenenti capillari in piastre di Petri con una soluzione digestiva. Successivamente, incubare le piastre di Petri a 37 gradi Celsius per un'ora su un agitatore orbitale a 180 giri/min, oppure mescolarle delicatamente ogni 10 minuti.

Dopo un'ora, lavare via i capillari dai filtri con sospensione dalla capsula di Petri. Quindi, dividere la sospensione dalle tre piastre in due tubi da 50 millilitri e fermare la digestione aggiungendo 10 millilitri di DMEM/F-12 a ciascun tubo da 50 millilitri. Centrifugare le sospensioni cellulari a 250 volte g, quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Successivamente, aspirare i surnatanti e risospendere ogni pellet in 10 millilitri di DMEM/F-12. Quindi, aggiungere altri 20 millilitri di DMEM/F-12 a ciascun tubo. Per ottimizzare le condizioni per l'attacco dei PBEC, aggiungere una soluzione di rivestimento al pallone T-75, ottenendo le concentrazioni finali di collagene quattro a 150 microgrammi per millilitro e fibronectina a 50 microgrammi per millilitro e con acqua distillata, assicurandosi che la soluzione copra l'intera superficie.

Successivamente, scongelare i capillari in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Per rimuovere il mezzo di congelamento, ruotare i capillari verso il basso a 250 volte g, quattro gradi Celsius, per sette minuti. Successivamente, aspirare con cura il surnatante e risospendere il pellet in uno o due millilitri dell'aliquota da 10 millilitri.

Successivamente, trasferire la sospensione capillare nel pallone T-75 rivestito e inclinare delicatamente il pallone per garantire una distribuzione uniforme sulla superficie. Posizionare il pallone T-75 a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione notturna, preparare 10 millilitri di terreno di crescita PBEC, integrato con puromicina a quattro microgrammi per millilitro per un pallone T-75 ed eseguire un cambio di terreno.

Quindi, preparare gli inserti della membrana permeabile per la semina PBEC rivestendoli con collagene IV a 500 microgrammi per millilitro e fibronectina a 100 microgrammi per millilitro e acqua distillata. Tripsinizzizzare le cellule aggiungendo due millilitri di soluzione di tripsina-EDTA al pallone T-75 e posizionarlo a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, per cinque-sette minuti. Per staccare le cellule endoteliali cerebrali, picchiettare delicatamente il lato del pallone T-75 con la punta delle dita.

Successivamente, trasferire la soluzione cellulare in una provetta da 15 millilitri e far girare le cellule endoteliali cerebrali mediante centrifugazione a 250 volte g, quattro gradi Celsius, per sette minuti. Successivamente, rimuovere con cura il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di terreno. Quindi, aggiungere altri due millilitri di terreno per portare il volume totale a tre millilitri.

Conta il numero di cellule manualmente utilizzando una camera di conteggio delle cellule o un sistema di conteggio automatico delle cellule. Per la cocoltura senza contatto, trasferire gli inserti nei pozzetti che contengono astrociti, che sono stati rinfrescati con terreno di crescita degli astrociti il giorno prima. Il giorno successivo, sostituire il fluido sugli inserti della membrana permeabile contenenti PBEC.

Quindi, aspirare con cura il terreno dai pozzetti e aggiungere 750 microlitri di terreno di differenziazione a ciascun pozzetto. Successivamente, aspirare con cura il terreno dagli inserti e aggiungere 500 microlitri di terreno di differenziazione per inserto. Quindi, aggiungere i restanti 750 microlitri di terreno di differenziazione a ciascun astrocita.

Successivamente, incubare le cellule con terreno di differenziazione a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, fino al giorno successivo. Il giorno dopo aver stimolato le cellule con il mezzo di differenziazione, preparare il sistema della camera di misurazione della resistenza tissutale per le misure TEER risciacquando la camera due volte con acqua bidistillata, una volta con etanolo al 70% per cinque minuti e altre due volte con acqua bidistillata. Quindi, collegare la camera al sistema, aggiungere quattro millilitri di DMEM/F-12 alla camera di misurazione della resistenza tissutale e lasciarla a temperatura ambiente per circa 30 minuti.

Successivamente, eseguire le misurazioni TEER posizionando con cura gli inserti nella camera di misurazione della resistenza tissutale. Di seguito sono riportate le immagini al microscopio a contrasto di fase di PBEC, colture e astrociti visualizzate nell'arco di cinque giorni. I frammenti capillari purificati il primo giorno della coltura iniziale hanno mostrato la presenza sia di capillari che di cellule contaminanti, che dopo il cambio di media il secondo giorno e un ulteriore giorno di crescita, hanno mostrato una selezione per i PBEC, iniziando la loro crescita dai frammenti capillari.

I monostrati confluenti di PBEC sono stati solitamente raggiunti dal quarto al sesto giorno, momento in cui i PBEC hanno mostrato una morfologia a forma di fuso ed erano allineati longitudinalmente. Gli astrociti di ratto seminati nei pozzetti inferiori normalmente proliferavano negli strati confluenti entro cinque giorni e venivano utilizzati per modelli di cocoltura senza contatto dopo due settimane di crescita. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette ore.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare la somministrazione di farmaci e il traffico di recettori nelle cellule endoteliali cerebrali strette e polarizzate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare un modello di barriera emato-encefalica in vitro che può essere utilizzato per nuovi studi che non possono essere condotti in vivo.