Name: Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri un metodo ottimizzato per creare un modello in vitro della barriera emato-encefalica utilizzando cellule endoteliali cerebrali primarie di suino. Questo protocollo garantisce alta resistenza elettrica transendoteliale e bassa permeabilità per studi di farmacologia.

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Gli autori vorrebbero riconoscere, Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen e Niels M. Kristiansen per assistenza tecnica, e la Fondazione di Lundbeck concedere numero R155-2013-14113.

Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi.

Purificazione e la proliferazione di pBEC
Durante la procedura di purificazione, fasi critiche includono la rimozione rapida ed efficace dei meninges e separazione della sostanza bianca e grigia, che è importante per la resa di purificazione e la purezza e per la corretta creazione del modello. Per il presentato in vitro BBB modello utilizzando pBECs, abbiamo migliorato e semplificato di una procedura di purificazione basata su meccanica omogeneizzazione della materia grigia isolato, fil...

Struttura cellulare e la funzione della barriera sangue - cervello
All'interfaccia del sistema nervoso centrale e circolatorio (CNS), la BBB agisce come un sito di regolamentazione chiave per controllo omeostatico del microambiente CNS, che è essenziale per la funzione adeguata e la protezione del sistema nervoso. Il sito della BBB è le cellule endoteliali che allineano il lume del vaso sanguigno. Nei capillari del cervello, le cellule endoteliali formano complesse giunzioni intercellulari strette e modelli di espressione fortemente polarizzata di particolare afflusso e deflusso trasportatori garantiscono un trasporto molecolare altamente specifico tra il sangue e il cervello 1. I componenti strutturali dei complessi stretta della giunzione includono le proteine dalla famiglia occludin e claudin, zonula occludens (ZO) proteine, cingulin e associati di molecole di adesione giunzionale (marmellate). 5 Claudin è particolarmente importante nella restrizione giunzionale paracellulare. Induzione e il mantenimento di questo caratteristico fenotipo endoteliale BBB coinvolgono interazioni dinamiche con le cellule circostanti, compreso i periciti, astrociti, neuroni e le membrane dello scantinato, che insieme con cervello endothelial cellule forma il neurovascular unità (NVU)2,3. I meccanismi coinvolti in queste interazioni non sono ancora completamente chiari, ma includono scambio di segnali chimici fra le cellule, che consente la modulazione della permeabilità BBB a breve termine e induce a lungo termine BBB caratteristiche4. Astrociti soprattutto sono conosciuti per contribuire al fenotipo endoteliale delle cellule del cervello e sono una fonte di fattori regolatori quali neurotrophic glial-derivato fattore (che interessano cAMP intracellulare)5, fattore di crescita di base del fibroblasto6, idrocortisone7e per la β (TGF-β) di fattore di crescita trasformante8. L'effetto di TGF-β, tuttavia, è stato dibattuto9.
Da In Vivo In Vitro BBB
In vivo gli studi continuano a fornire preziose informazioni sulla biologia BBB. Tuttavia, modelli di coltura cellulare possono fornire ulteriori approfondimenti e costituiscono strumenti utili per comprendere gli aspetti molecolari e funzionali dettagliati della BBB in salute e malattia. Anche se le complesse interazioni tra i tipi di cella e costituenti della BBB sono difficili da raggiungere completamente in modelli in vitro , c'è stato, dal prima purificazione delle cellule endoteliali cerebrali e l'applicazione di questi in mono-culture 10 , 11 , 12, ampio sviluppo delle procedure di purificazione e le condizioni di crescita della BBB cellulari modelli di cultura, con conseguente maggiore somiglianza con la barriera in vivo . I modelli BBB comunemente usate in vitro sono basati su cellule primarie di origine roditore, suina e bovina e su linee cellulari immortalizzate. Ogni modello presenta diversi vantaggi e svantaggi. Per la scelta di modello e confronto, marcatori di convalida come espressione di enzimi BBB, trasportatori, recettori e proteine strutturali vengono utilizzati per creare panoramiche del corrente affermati modelli1.
Obiettivo del protocollo
Una caratteristica importante della BBB è barriera strettezza e alto TEER, ancora un gran numero di modelli disponibili non riflettono bene i livelli in vivo . Integrando il contributo di sviluppo e ottimizzazione da parecchi laboratori, l'obiettivo di questo protocollo è di presente un metodo per stabilire un alto TEER in vitro BBB modello basato su pBECs primario in MC con o senza ACM o in NCC con primario astrociti di ratto o di origine suina. Le procedure applicate e istituzione del modello includono gli sforzi per eliminare le cellule contaminanti e per migliorare la differenziazione delle pBECs in un fenotipo BBB. Questo lavoro ha provocato l'istituzione di modelli TEER ad elevate affidabilità, con permeabilità paracellulare basso e buona espressione funzionale di proteine giunzionali stretti chiave, trasportatori e recettori. Tuttavia, come gli astrociti sono un fattore che contribuisce al fenotipo endoteliale delle cellule del cervello, le tre diverse condizioni di cultura rappresentano tre diversi fenotipi delle cellule endoteliali cerebrali. Il modello di NCC è utile soprattutto per gli studi di alcuni meccanismi specializzati coinvolti nella scoperta della droga, gli studi sui trasporti e traffico intracellulare, oltre che per studio delle interazioni cellula-cellula, dove si trova la massima espressione delle caratteristiche BBB vantaggioso.
Origine e storia del protocollo
Il modello pBEC qui descritto si basa sul modello porcino sviluppato presso i laboratori di Eisai (Londra) da Dr. Louise Morgan e colleghi, che è basato su un successo precedenti cervello bovino delle cellule endoteliali modello13. Il metodo originale di preparazione delle cellule è una filtrazione di due fasi utilizzando nylon mesh per catturare i microvasi, seguiti da una fase subculturing per migliorare la purezza. Nello sviluppo del metodo precedente, tenuta ottimale del fenotipo e barriera BBB sono stati raggiunti dalla crescita in mezzo completato, tra cui ACM. Ulteriori modifiche al metodo sono state fatte da R. Skinner nel laboratorio del Prof N. Rothwell in Manchester Regno Unito14,15. Il metodo fu adottato dal laboratorio Abbott, KCL London, dove Patabendige reso significativamente più semplice preparare evitando l'uso di astrociti o ACM ed eliminando le cellule contaminanti quali periciti con con puromicina. Dai primi documenti ha confermato che il modello MC conservato diverse caratteristiche importanti in vivo BBB, tra cui efficace giunzioni strette, sistemi di trasporto di membrana e recettore transcitosi16,17 , 18 , 19 , 20. più tardi S. Yusof nuovamente testato co-coltura del astrocyte e trovato esso migliorato significativamente TEER, quindi questa è la variante preferita attualmente utilizzata nel laboratorio Abbott21. Il modello è stato correttamente trasferiti la Nielsen M. laboratorio a Aarhus, dove ulteriori modifiche sono state introdotte (questo protocollo), tra cui semplificando grigio importa estrazione, utilizzando solo una maglia filtrazione passaggio e un passaggio di rivestimento singolo filtro combinazione di collagene e fibronectina. La procedura applicata per l'isolamento dei astrocytes porcino (questo protocollo) era basata su protocolli sviluppati dal laboratorio T. Moos a Aalborg, descritto da Thomsen et al.22. Il TEER e altre proprietà del modello generato a Londra e Aarhus sono simili, che presta fiducia alla nozione che il modello viene prontamente trasferito tra i laboratori e risponde bene a un'attenta osservazione e la razionalizzazione dei passaggi del metodo. Infatti, S. Yusof ora ha stabilito il modello MC in un paese tropicale (Malesia)23, che ha coinvolto ulteriore adeguamento per le condizioni locali e fonti di tessuto.
Vantaggi rispetto ai metodi alternativi e attualmente stabilito modelli
Rispetto alle cellule endoteliali cerebrali di origine bovina e del roditore, pBECs forniscono il vantaggio di avere un tasso più basso di perdita del fenotipo in vivo BBB dopo isolamento24. Inoltre, sono in grado di formare barriere endoteliali relativamente strette, anche quando coltivate in MC (800 Ω cm2)16 rispetto ai livelli comunemente segnalati per monostrati di linee cellulari quali bEND.5 e bEND.3 (50 Ω cm2) pBECs 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30e cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32e cerebrali primari cellule endoteliali del mouse (100-300 Ω cm2)SS = "xrif" > 33,34,35,36 e ratto (100-300 Ω cm2)37,38. Tuttavia, il TEER ha mostrato dipendenza sulle procedure di purificazione e di cultura. Nella maggior parte dei casi, l'aggiunta di ACM o di co-coltura con i astrocytes Mostra effetti differenziazione le cellule endoteliali e un aumento nella strettezza del endoteliale strati1. Tuttavia, con gli sforzi per ottimizzare le condizioni di coltura, solo i modelli basati su bovini hanno mostrato valori TEER paragonabili ai modelli basati su porcina (medie di 800 Ω cm2 in MC, fino a 2500 Ω cm2 in co-coltura Astrocita)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Come i modelli basati su primario cervello bovino cellule endoteliali hanno dimostrato grandi variazioni, sia tra e all'interno di laboratori14,45,46,47,48, riproducibilità potrebbe essere un problema. Nel modello pBEC segnalato qui, i laboratori che contribuisce hanno raggiunto TEER molto simile e valori di permeabilità paracellulare con bassa variabilità sia tra i laboratori che in. Quindi, dovrebbe essere possibile per altri laboratori di stabilire un modello affidabile con bassa variabilità utilizzando il metodo presentato qui. Oltre a formare strati endoteliali stretti, modelli con pBECs precedentemente sono stati convalidati dall'espressione di proteine di giunzione stretta, funzionale BBB trasportatori, recettori ed enzimi e comprovata idoneità per una gamma di studi15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Inoltre, inediti transcriptome dati sulle co-culture di pBECs mostrano un profilo previsto dei trasportatori BBB e recettori (risultati non pubblicati, Nielsen et al.).
Il modello BBB porcina basato presenta un ulteriore vantaggio come il genoma, anatomia, fisiologia, e progressione di malattia del maiale riflettono la biologia umana ad un grado più elevato rispetto ad altri modelli stabiliti dispone di60, che sono favorevoli per il industria farmaceutica. Come suini cervelli sono un comune sottoprodotto dell'industria della carne, essi costituiscono una fonte facilmente accessibile del cervello cellule endoteliali, riducendo al minimo il numero di animali necessari per gli esperimenti e fornendo una resa alta purificazione da un cervello porcino. Sebbene la purificazione e la coltivazione di cellule primarie è un po' laborioso e richiede competenze di normalizzazione nella creazione del modello, cellule primarie generare i modelli BBB più affidabili. Linee cellulari immortalizzate non possono essere un sostituto, come proprietà importanti come tenuta di barriera, profili di espressione del trasportatore e regolamento microambiente non riflettono i risultati sperimentali in vivo61, 62. in vitro modelli offrono il vantaggio di vivere-cella delle immagini con risoluzione superiore, rendendo possibile la visualizzazione di processi intracellulari consentendo un approccio di vicinanza alle cellule campionate o osservati, utilizzando obiettivi con ingrandimento maggiore e migliore qualità ottica63. Questo non è il caso per l'uso di microscopia del due-fotone in animali vivi. Inoltre, in vitro modelli offrono la possibilità a transfect cellule, permettendo la visualizzazione di proteine e di indagine dei loro traffici.
Applicazioni del modello
La funzione della BBB non è fisso e può essere modulata in modo dinamico in fisiologia e la patologia. In molte malattie neurologiche, compreso neurodegenerative, infiammatorie e infettive, rottura e aumento della permeabilità della BBB è osservato64,65,66,67 . Al fine di ridurre e prevenire la progressione della malattia e conseguenti danni, identificazione e caratterizzazione dei meccanismi molecolari che sono alla base della modulazione della BBB sono di grande importanza. In questo contesto, affidabile in vitro modelli sono molto richiesti dall'industria farmaceutica e inoltre svolgono i ruoli importanti nel predire la permeabilità BBB di droghe al sistema nervoso centrale. Qualsiasi modello in vitro che serve come uno schermo di permeabilità dovrebbe visualizzare una via paracellulare restrittive, una cellula fisiologicamente realistica architettura ed espressione funzionale del trasportatore meccanismi68. Dimostrato in precedenti studi16,17,57e di permeabilità paracellulare ed espressione delle proteine TJ e AJ qui, il modello presentato soddisfa tutti questi criteri ed è adatto per una gamma di BBB studi in entrambi normale fisiologia e nella patologia. I punti di forza del metodo di purificazione e coltivazione presentato includono una combinazione di semplicità e riproducibilità e la capacità di includere astrocytic influenza con un robusto e affidabile alto TEER in vitro BBB modello risultante. Per questo scopo, gli astrociti di porcino e ratto origine hanno dimostrato di aumentare il fenotipo BBB di pBECs in un modo simile22.

<table><tbody><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Collagene IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / Basso glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina / Streptomicina</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Siero plasmaderivato (PDS)</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-89</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10-270-106</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>8-CPT-cAMP</td><td>Biolog</td><td>C010</td><td></td></tr><tr><td>RO 20-1724</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8279</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina solfato</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34896</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20,824,296</td><td>Miscelare la soluzione al 70 % dalla EtOH</td></tr><tr><td>DNAsi al</td> 96 % 1 <td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi CLS2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td> Realizzato con palloni <td>Elga System</td></tr><tr><td>T75</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Inserti Costar Transwell (inserti a membrana permeabili alle cellule)</td><td>Piastra Costar</td><td>CLS3401</td><td>a 12 pozzetti, diametro 12 mm, 0,4 &mu; m membrana in policarbonato</td></tr><tr><td>provette da centrifuga da 15 ml</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>provette da centrifuga da 50 ml</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>piastre Petri</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Fiale Cryo</td><td>Thermo Scientific</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>flacone da 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>159910/159920</td><td></td></tr><tr><td>bisturi</td><td>Swann-Morten</td><td>REF0211</td><td>Tipo 24</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore tissutale</td><td>Sigma</td><td>D9188</td><td></td></tr><tr><td>140 &mu; m filtri</td><td>MERCK</td><td>NY4H04700</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m filters</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di camere EndOhm</td><td>World Precision Instruments</td> Camera <td>ENDOHM-12</td><td>EndOhm per tazze di coltura da 12 mm</td></tr><tr><td>Sistema di elettrodi EVOM2</td><td>World Precision Instruments</td> Sistema di misurazione TEER <td>300523+STX100C</td> World Precision Instruments <td>con coppia di elettrodi rigidi STX-100C</td></tr><tr><td>Ago lungo</td><td>Sigma</td><td></td><td>Collegare a una siringa</td></tr><tr><td>Pinze curve a punta fine</td><td>KLS Martin</td><td>12-409-12-07</td><td></td></tr><tr><td>Pinza a punta larga</td><td>VWR</td><td>82027-390</td><td></td></tr><tr><td>Portafiltro</td><td>MERCK Milipore</td><td>Swinnex-47</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 50 ml</td><td>Braun</td><td>4617509F</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>Terumo</td><td>SSt20ESI</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-occludina</td><td>Abcam</td><td>ab31721</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anti-p120 Laboratori</td><td>di trasduzione</td><td></td> BD Anticorpo <td>catenina 610133 1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>anti-Claudina 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4502981</td><td>1:100</td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio d'asino coniugato con farina Alexa 568</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10042</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-topo d'asino coniugato con farina Alexa 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC100X250UC</td><td>0,15&micro; l/ml conc di lavorazione finale</td></tr><tr><td>Lucifero Giallo</td><td>Sigma</td><td>L0144</td><td>10 &micro; g/ml conc di lavoro finale</td></tr></tbody></table>

migliorato il metodo per la creazione di un in vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali porcine cervello

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

L'obiettivo di questo protocollo presenta una procedura ottimizzata per la purificazione e la coltivazione di pBECs e di stabilire in vitro barriera ematomeningea (BBB) modelli basati su pBECs in mono-cultura (MC), MC con medium condizionato di astrociti (ACM), e senza contatto co-coltura (NCC) con i astrocytes di suino o ratto origine. pBECs è stato isolato e coltivato da frammenti di vasi capillari dalle cortecce cerebrali di suini domestici 5-6 mesi di età. Questi frammenti sono stati purificati dal rimozione accurata di meningi, isolamento e omogeneizzazione della materia grigia, filtrazione, digestione enzimatica e centrifugazione. Per ridurre ulteriormente le cellule contaminanti, i frammenti capillari sono stati coltivati con contenenti con puromicina medio. Quando 60-95% confluenti, pBECs crescente dai frammenti capillari sono state attraversate per filtro a membrana permeabile inserisce e stabilita nei modelli. Per aumentare la tenuta di barriera e il fenotipo caratteristico BBB di pBECs, le cellule sono state trattate con i seguenti fattori di differenziazione: membrana permeante 8-CPT-cAMP (cAMP qui abbreviato), idrocortisone e un inibitore della fosfodiesterasi, RO-20-1724 (RO). La procedura è stata effettuata in un periodo di 9-11 giorni, e quando si stabilisce il modello di NCC, gli astrociti sono stati coltivati 2-8 settimane in anticipo. L'aderenza alle procedure descritte nel protocollo ha permesso la creazione di strati endoteliali con permeabilità paracellulare molto limitato, con il servizio NCC Mostra una resistenza elettrica media transendoteliale (TEER) 1249 ± 80 Ω cm di modello 2e permeabilità paracellulare (Papp) per Lucifero giallo di 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sec-1 (media ± SEM, n = 55). Ulteriore valutazione di questo fenotipo pBEC ha mostrato buona espressione della stretta proteine giunzionali claudin 5, ZO-1, occludina e adherens giunzione proteina p120 catenina. Il modello presentato può essere utilizzato per una serie di studi della BBB nella salute e nella malattia e, con la permeabilità paracellulare altamente restrittive, questo modello è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare.

Stabilimento di BBB In Vitro modelli
Nel metodo presentato, ottimizzato, la coltivazione di pBECs e l'istituzione del sistema di inserimento membrana permeabile con MC o senza ACM o NCC con i astrocytes (Figura 1) è stati effettuati per un periodo di 9-11 giorni (Figura 2). Per la selezione delle cellule endoteliali, una cultura iniziale di frammenti capillare pur...

L'obiettivo del protocollo è di presentare una procedura ottimizzata per la creazione di un modello in vitro barriera ematomeningea (BBB) basato sulle cellule endoteliali cerebrali primari porcina (pBECs). Il modello mostra un'elevata riproducibilità, alta tenuta ed è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare nella scoperta della droga.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di purificare e isolare le cellule endoteliali primarie del cervello suino al fine di creare un modello di barriera emato-encefalica in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della barriera emato-encefalica, come la somministrazione di farmaci, la permeabilità, il traffico di recettori, nonché la tenuta e la polarità del BB. Il vantaggio principale di questo modello è l'elevata resa di cellule endoteliali cerebrali primarie che possono essere utilizzate per creare un modello di barriera emato-encefalica in vitro con un alto TEER e una bassa permeabilità. Per iniziare questa procedura, posizionare i cervelli in un banco a flusso sterile e lavarli delicatamente con un litro di PBS in un becher posto sul ghiaccio.Quindi, rimuovere con cura le meningi da ciascun cervello usando una pinza a punta fine. Usando un bisturi, raschiare via la materia grigia dal cervello uno alla volta e trasferire il materiale isolato in piastre di Petri contenenti 20 millilitri di DMEM/F-12 poste sul ghiaccio. Per la frammentazione iniziale, far passare il materiale della materia grigia attraverso una siringa da 50 millilit

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Questo metodo descrive come isolare e immortalare cellule endoteliali microvascolari di cervello di topo. Descriviamo un passo-passo protocollo partire dalla omogeneizzazione del tessuto cerebrale, mineralizzazione, semina e immortalizzazione delle cellule. Di solito, ci vogliono circa cinque settimane per ottenere una omogenea, immortalato linea microvascolare delle cellule endoteliali.

Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Cervello Modello barriera

Questo video dimostra l'isolamento dei capillari dai cervelli suini freschi. Il processo prevede la rimozione delle meningi, l'isolamento della materia grigia dal tessuto cerebrale, l'omogeneizzazione e il filtraggio della materia grigia per isolare i capillari e, infine, l'utilizzo della digestione enzimatica per purificare ulteriormente i capillari.

Purificazione dei capillari da un cervello suino

Istituzione di modelli umani della barriera emato-encefalica (BBB) ​​può beneficiare la ricerca sulle condizioni del cervello connesse con il fallimento BBB. Descriviamo qui una tecnica migliorata per la preparazione di un modello BBB contatto, che consente coculturing di astrociti e cellule endoteliali cervello sui lati opposti di una membrana porosa.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

Lo scopo di questo studio era di convalidare la riproducibilità di un modello in vitro BBB coinvolge un singenici ratto co-coltura delle cellule endoteliali e astrociti. Il monostrato di cellule endoteliali presentato TEER alta e bassa permeabilità LY. Espressione di proteine ​​TJ specifici, sono state valutate le risposte funzionali ai infiammazione e la funzionalità dei trasportatori e recettori.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) sono interconnesse da specifiche proteine giunzionali che formano una barriera altamente regolata che separa il sangue e il sistema nervoso centrale (SNC), la cosiddetta barriera emato-encefalica (BBB). L'isolamento delle cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello murino, come discusso in questo protocollo, consente studi dettagliati in vitro della BEE.

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

Qui, descriviamo un modello murino in vitro della barriera emato-encefalica che fa uso della spettroscopia delle cellule di impedenza, con particolare attenzione alle conseguenze sull'integrità e la permeabilità delle cellule endoteliali in seguito all'interazione con le cellule T attivate.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

La barriera emato-encefalica umana previene selettivamente la penetrazione di molecole idrofile e patogeni nel cervello. Diverse patologie, tra cui meningite e delirio postoperatorio, sono associate a una maggiore permeabilità della barriera emato-encefalica. Qui, descriviamo un modello di coltura cellulare endoteliale per testare la permeabilità della barriera mediante attraversamento microbico.

Analisi della permeabilità della barriera sangue-encefalica attraverso l'attraversamento microbico attraverso le cellule endoteliali microvascolari

La barriera emato-encefalica (BBB) è un'unità neurovascolare multicellulare che regola strettamente l'omeostasi cerebrale. Combinando gli iPSC umani e le tecnologie organ-on-chip, abbiamo generato un chip BBB personalizzato, adatto per la modellazione delle malattie e le previsioni di penetrazione dei farmaci del SNC. Viene descritto un protocollo dettagliato per la generazione e il funzionamento del chip BBB.

Generazione di un chip di barriera emato-encefalica basata sull'iPSC umano

Questo protocollo descrive un metodo per stabilire un modello umano di barriera emato-encefalica (BBB) in vitro . Le cellule endoteliali e i periciti sono seminati su ciascun lato di un filtro inserto (compartimento sanguigno) e gli astrociti sono seminati nel pozzetto inferiore (compartimento cerebrale). Il modello caratterizzato è stato utilizzato per esperimenti di trasporto di nanoparticelle.

Un sistema di cellule a tripla coltura che modella la barriera emato-encefalica umana

La barriera emato-encefalica (BBB) ha un ruolo cruciale nel sostenere un ambiente cerebrale stabile e sano. La disfunzione della BBB è associata a molte malattie neurologiche. Abbiamo sviluppato un modello 3D derivato da cellule staminali della BBB per studiare la patologia cerebrovascolare, l'integrità della BBB e il modo in cui la BBB viene alterata dalla genetica e dalla malattia.

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica

Scopri un metodo ottimizzato per creare un modello in vitro della barriera emato-encefalica utilizzando cellule endoteliali cerebrali primarie di suino. Questo protocollo garantisce alta resistenza elettrica transendoteliale e bassa permeabilità per studi di farmacologia.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello (Video) | JoVE Journal

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

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