Name: Ingegneria tissutale corneale: Un In Vitro modello delle interazioni Stromal-nervo della Cornea umana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Scopri un modello 3D in vitro per studiare le interazioni tra cellule stromali corneali e neuroni nella matrice extracellulare naturale. Questo metodo aiuta a comprendere i meccanismi del danno e della rigenerazione del nervo corneale.

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Vorremmo estendere il nostro sincero grazie a Dr. Ben Fowler per il suo aiuto tecnico con gli esperimenti TEM.

Questo protocollo segue le linee guida del Comitato di revisione di Università di Oklahoma Health Sciences Center/istituzionale (IRB n. 4509). Tutte le parti del protocollo ha incontrato i principi della dichiarazione di Helsinki. Campioni corneali sono stati ottenuti dallo sviluppo nazionale e Research Institute (NDRI) e la banca degli occhi Lions di Oklahoma.
1. isolamento di cellule primarie
<ol><li>Al ricevimento dei campioni di tessuto cornea umana, trasferire i tessuti in un 21,5 cm2 capsula di Petri contenente 2 mL di soluzione tampone fosfato sterile di Dulbecco (DPBS) (1x).</li>
	<li>Raschiare e rimozione dell'epitelio corneale posizionando la cornea cupola a faccia in su. Per garantire la rimozione completa, grattare via lo strato epiteliale accuratamente con una lama di rasoio ad un angolo di 45°. Successivamente, capovolgere la cornea cupola a faccia in giù e raschiare accuratamente l'endotelio dallo stroma con una lama di rasoio ad un angolo di 45° per garantire la rimozione completa. Lavare il tessuto stromal con DPBS.</li>
	<li>Tagliare i tessuti stromali in piccoli pezzi, usando una lama chirurgica del numero 10, tenere i pezzi stromali bagnati a tutti i tempi con DPBS. Raccogliere pezzi stromal con pinze sterili e posto in un matraccio di cultura T25 senza mezzi di comunicazione (4 o 5 pezzi di tessuto di 2 x 2 mm per fiaschetta).</li>
	<li>Consentire gli espianti di aderire al fondo del matraccio a 37 ° C per circa 30-40 min. Una volta aderito, aggiungere lentamente il mezzo essenziale minimo di Eagle (EMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% antibiotico/Antimycotic al pallone senza disturbare gli espianti.</li>
	<li>Posizionare delicatamente il pallone nell'incubatore a 37 ° C, 5% CO2. Lasciare gli espianti indisturbato fino a quando le cellule iniziano a isolare e la migrazione nel pallone. Dopo circa 2-4 settimane, le cellule dovrebbero raggiungere la confluenza di 100%. Sulla confluenza di 100%, le cellule del passaggio rimuovendo i mezzi di coltura del tessuto e lavare le cellule con DPBS.</li>
	<li>Aggiungere tripsina alle cellule e quindi li Incubare a 37° C. Dopo circa 5 minuti, Mostra le cellule nell'ambito di microscopia per confermare che hanno staccato e poi fermare la proteolisi aggiungendo media fresco.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL per centrifugazione a 1.000 x g. eliminare il surnatante con attenzione senza disturbare il pellet e sospendere le cellule in EMEM fresco 10% FBS 1% antibiotico. Contare le celle e seme circa 1 x 106 cellule nel matraccio di cultura T75 per un'ulteriore espansione con EMEM fresco 1% FBS 1% antibiotico.</li>
</ol>2. primaria HCF cultura e costrutti 3D Assembly
<ol><li>Per assemblare 3D costrutti da espianti EMEM precedentemente coltivate in 10% FBS 1% antibiotico/Antimycotic, corridoio e conteggio HCF.</li>
	<li>Semi di circa 1 x 106 cellule/pozzetto di HCF primario su inserti di membrana in policarbonato con pori 0,4 µm dai costrutti 3D, insieme con 1,5 mL di EMEM fresco 10% FBS 1% antibiotico/Antimycotic nella parte superiore del costrutto. Aggiungere un altro 1,5 mL di stesso supporto nella parte inferiore di ogni costrutto.</li>
	<li>Dopo 24 h di semina delle cellule, della coltura delle cellule con EMEM 10% FBS 1% antibiotico/Antimycotic, stimolato con 0,5 mM acido 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic (vitamina C) da aggiungere 1,5 mL in alto a sinistra e 1,5 mL sul fondo di ogni costrutto.</li>
	<li>Mantenere le colture in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 per 3 settimane e fornire mezzi freschi ogni altro giorno durante l'intero periodo di studio. Nessun passaggio ulteriore è necessaria.</li>
</ol>3. differenziazione e co-colture delle cellule
<ol><li>Dopo 3 settimane, aggiungere 8 x 103 cellule/pozzetto di cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y sulla cima il 3D precedentemente assemblato costruisce contenente 1,5 mL di EMEM contenente 10% FBS, 1% antibiotico/Antimycotic e 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acido (vitamina C).<ol>
<li>Consentire le cellule di neuroblastoma SH-SY5Y a crescere sopra le cellule stromal di cornea per almeno 24 ore prima dell'inizio della differenziazione cellulare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avviare la differenziazione delle cellule SH-SY5Y stimolando le cellule con EMEM contenente 1% FBS e 1,5 mL di 10 µM acido retinoico in cima il costrutto. Aggiungere 1,5 mL di EMEM 10% FBS 1% antibiotico/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acido (vitamina C) alla parte inferiore del costrutto. Nota che l'acido retinoico va effettuata al buio.<ol>
<li>Continuare a coltivare le cellule in questa media di differenziazione per 5 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando le cellule raggiungono la fase di differenziazione, passare le cellule a 1,5 mL di terreno privo di siero contenente 2 nM di fattore neurotrophic cervello-derivato (BDNF) e 1% antibiotico/Antimycotic aggiunto ai EMEM, aggiungendo alla parte superiore del costrutto. Aggiungere 1,5 mL di EMEM 10% FBS 1% antibiotico/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acido (vitamina C) alla parte inferiore del costrutto. Si noti che il passo BDNF deve essere eseguito nel buio.</li>
	<li>Coltura delle cellule per 2 giorni aggiuntivi prima dell'elaborazione per qualsiasi ulteriore analisi come indicato nella tabella 1.</li>
</ol>

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<li>Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+tear+production+in+patients+with+neurotrophic+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis.</a> Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).</li>
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<li>Karamichos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+Vitro+Model+for+Keratoconus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease.</a> J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Diversi studi si sono concentrati sullo sviluppo di vari modelli animali che possono aiutare a sviluppare una migliore comprensione delle malattie della cornea così come scoprire i trattamenti. Tuttavia, un notevole valore agli esseri umani da questi studi non è stato verificato. Ad oggi, vari modelli in vitro sono sviluppati e ampiamente studiati a causa della loro notevole importanza clinica. Il nostro modello precedentemente stabilito 3D in vitro è un innovativo sistema significativamente contribuisc...

Nel corpo umano, la cornea è il tessuto più densamente innervato. I nervi sono responsabili di varie sensazioni come touch, dolore, temperatura e hanno anche un ruolo essenziale nella guarigione delle ferite, lampeggiano i riflessi, tear produzione e secrezione5,6,7. Nella cornea, tronchi del nervo stromal derivano dal plesso limbal e immettere lo stroma cornea periferico radialmente. L'organizzazione di stromal del nervo è parallelo le lamelle collagene e ulteriore diramazione in fasci più piccoli come si procede verso il stroma superficiale5,8. Le fibre nervose ulteriormente penetrare lo strato epiteliale e così, lo stimolo è ampiamente sparso attraverso l'epitelio corneale e lo stroma. Di conseguenza, lo stimolo ha un ruolo essenziale nello stato sano e malato della cornea. In questo protocollo, riveliamo l'avanzamento di un modello di romanzo 3D in vitro , che è il primo del suo genere per simulare le interazioni di stromal-nervo in vivo . La linea di cellule SH-SY5Y era utilizzata per questo studio, in quanto è una delle linee più affermate, ben caratterizzate utilizzate per studiare la crescita neuronale. La linea di cellule SH-SY5Y è stato descritta per produrre sia aderente di substrato (S-type) e neuroblastic (tipo N) che le cellule possono subire transdifferenziazione9. Di conseguenza, anche se questa linea cellulare è derivata da una selezione di triple consecutive subclone di cellule di tipo N, che contiene anche un piccolo numero di cellule di tipo S in grado di subire il differenziamento in neuroni attraverso l'uso di retinoico acido e cervello-derivato neurotrophic factor9. Questo fornisce uno strumento che può portare a una migliore comprensione delle complicazioni corneale connesse con retinopatia diabetica (DM) e altre malattie oculari. A causa di difficoltà associate all'ottenimento e coltura neuroni da pazienti con malattia oculare, questo modello 3D in vitro fornisce notevoli implicazioni nello studio delle interazioni neuronali e segnalazione con lo stroma corneale.
Circostanze malate spesso colpiscono vari tessuti del corpo ad una scala molto grande, che porta ad una qualità della vita compromessa. Le distrofie oculare sono complicazioni comuni spesso associate a malattie sistemiche e portare alla perdita dell'acuità visiva o anche permanente della vista. Studi completi sono spesso essenziali per una migliore comprensione della condizione di malattia, come pure gli effetti a livello cellulare basale. Per studiare gli effetti di tali malattie, sono stati sviluppati vari modelli in vivo e in vitro con l'aiuto di applicazioni di ingegneria tissutale. Applicazioni di ingegneria del tessuto corneale hanno raccolto grande interesse in vari settori della scienza10,11,12,13,14, ma ci sono ancora notevoli limitazioni durante effettiva applicazione, tra cui corneale dell'innesto respingimenti, infezioni e cicatrici10,11,12,13,14. Ci sono diversi studi che hanno sviluppato con successo e stabilite varie in vitro modelli3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. I modelli 3D in vitro sono i più promettenti e di grande interesse scientifico. Modelli 3D sono noti per meglio rispecchiare il in vivo eventi cellulari e fisiologiche che sono critici durante la fibrosi e ferita guarigione15,27,28,29. Questi modelli in vitro giocano un ruolo fondamentale nella ricerca di nuovi approcci terapeutici per il trattamento di diverse patologie tra cui le complicazioni corneali. Nonostante il ruolo critico dell'innervazione nelle funzioni corneale, piccoli sforzi compiuti per promuovere la proliferazione di nervo periferico all'interno di costrutti tessutale corneale2,3. Tuttavia, i costrutti di cella proposto 3D in vitro imitano il tessuto bersaglio al fine di conseguire la funzionalità del tessuto desiderato.
Mentre keratopathy diabetica è un'applicazione evidente per il modello descritto qui dovuto i difetti di un neurone, ci sono parecchie altre malattie corneali che possono beneficiare di un modello umano in vitro compreso le distrofie cheratocono e Fuchs. Il nostro modello 3D emerge da questa prospettiva e propone lo sviluppo di una rappresentazione in vitro del tessuto corneale per valutare la somministrazione di farmaci e la sicurezza dei nuovi farmaci oculari.

<table><tbody><tr><td>Campioni di tessuto corneale sano</td><td>NDRI</td><td></td><td>da donatori senza traumi oculari o malattie sistemiche</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione tamponata con fosfato (1X)</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Pinze sterili</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Fisherbrand Pinze per schegge a punta extra fine</td></tr><tr><td>Lame per rasoio a taglio singolo</td><td>Personna</td><td>270100</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi chirurgiche sterili No.10</td><td>Lama chirurgica per piume</td><td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s Terreno essenziale minimo</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>10% FBS è necessario per la preparazione dei terreni</td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico (100X)</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>1% Antibiotico-Antimicotico è necessario per la preparazione dei terreni</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina EDTA(1X)</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Inserti in membrana in policarbonato con 0,4-&mu; m pori</td><td>Corning Costar</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>Acido 2-O-&alfa;-Dglucopiranosil-L-ascorbico (Vitamina C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SMB00390-14</td><td>Per lo studio deve essere utilizzata una concentrazione di 0,5 mM</td></tr><tr><td>Blocco di cera</td><td>VWR</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y Cellule di neuroblastoma</td><td>ATCC</td><td>SHSY5YATCC CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3014-10UG</td><td>È necessario utilizzare la concentrazione finale di 10uM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-100MG</td> È <td>necessario utilizzare la concentrazione finale di 2nM</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>VWR-Alfa Aesar</td><td>67-68-5</td><td>DMSO sterile di grado ultra puro da utilizzare</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Coltura cellulare trattata EasYFlasks (T25)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-351</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Coltura cellulare trattata EasYFlasks (T75)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr></tbody></table>

ingegneria tissutale corneale: un in vitro modello delle interazioni stromal-nervo della cornea umana

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Ingegneria tissutale ha guadagnato riconoscimento sostanza a causa della forte domanda per le sostituzioni di cornea umana con circa 10 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di perdita di visione corneale1. Per rispondere alla domanda di cornee umane vitali, progressi significativi nel tessuto di tridimensionale (3D) ingegneria è stato fatto2,3,4. Questi gamma di modelli di cornea da sistemi monostrato semplice ai modelli multilivello, che conduce a 3D equivalenti corneale di pieno-spessore2.
Tuttavia, l'uso di una cornea tessutale 3D nel contesto dei modelli di malattia in vitro studiato per data non ha somiglianza con la struttura multistrato 3D tessuto corneale, funzione e la messa in rete di diversi tipi di cellule (cioè, nervo, epitelio, stroma ed endotelio)2,3. Inoltre, la domanda per i modelli di tessuti in vitro cornea è aumentata nel tentativo di ridurre la sperimentazione animale per i prodotti farmaceutici. Così, modelli più sofisticati sono tenuti a corrispondere meglio sistemi ai requisiti fisiologici umani e lo sviluppo di un modello che è più rilevante per la popolazione di pazienti è assolutamente necessario. Dato che più tipi di cellule nella cornea sono colpiti da malattie e distrofie, quali cheratocono, cheratopatia diabetica e Fuchs, questo modello include un modello 3D co-coltura di fibroblasti corneali umani primari (HCF) da donatori sani e neuroni da la linea di cellule SH-SY5Y. Questo ci permette per la prima volta studiare le interazioni tra i due tipi cellulari all'interno del tessuto cornea umano. Crediamo che questo modello potrebbe potenzialmente sezionare i meccanismi di fondo connessi con le interazioni di stromal-nervo di patologie corneali che presentano danni del nervo. Questo modello 3D rispecchia la natura di base anatomica e fisiologica del tessuto corneale in vivo e utilizzabile in futuro come uno strumento per indagare i difetti corneali così come l'efficacia di vari agenti di screening prima sperimentazione animale.

Figura 1 è una dettagliata immagine rappresentativa del modello di lavoro 3D in vitro . Nella prima fase, le cellule sono isolate dalle cornee umane. Quindi, sono cresciuti su una membrana di policarbonato e stimolati con vitamina C per assemblare una matrice 3D auto-secreta. Questo sistema di costrutto 3D induce la sintesi di un multistrato cellulare in vivo-come matrice stromale. Successivamente, le cellule di neuroblastoma sono seminate i...

Questo protocollo descrive un romanzo tridimensionale in vitro modello, cui sono coltivate cellule stromal corneale e cellule neuronali differenziate insieme per assistere nell'esame e nella comprensione delle interazioni tra i due tipi cellulari.

Ingegneria tissutale corneale: Un In Vitro modello delle interazioni Stromal-nervo della Cornea umana

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di studiare le interazioni cellulari tra le cellule stromali corneali umane e le cellule neuronali nella loro matrice extracellulare naturale. Il protocollo può essere ampliato per studiare le malattie e le distrofie corneali, come il cheratocono, la cheratopatia diabetica e la distrofia di Fuchs. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia della cornea umana, identificando i meccanismi sottostanti e i difetti nelle interazioni nervose dello stroma durante una specifica malattia corneale o distrofia.Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule possono secernere la propria matrice extracellulare in vitro che fornisce un modello migliore e più accurato del tessuto corneale umano in vivo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie corneali, perché la valutazione delle interazioni cellula-cellula e matrice extracellulare garantirà una rappresentazione accurata del tessuto corneale e consentirà uno sviluppo di farmaci più mirato. Ora, questo metodo può fornire informazioni sul danno e la rigenerazione del nervo corneale.Può essere applicato anche ad altri

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Biologia dello sviluppo

Questo video dimostra una tecnica per generare un sistema modello di co-coltura tridimensionale di fibroblasti corneali umani primari e cellule neuronali differenziate. Questo sistema di co-coltura può essere utilizzato per studiare le interazioni stromale-nervo.

Generazione di un modello 3D di co-coltura di fibroblasti e neuroni corneali umani

Riportiamo una tecnica per la realizzazione di micropockets all'interno membrane elettrofilate in cui studiare il comportamento delle cellule. In particolare, si descrive una combinazione di microstereolithography e elettrofilatura per la produzione di PLGA (Poly (lattide-co-glicolico)) dispositivi biomateriale corneali dotati microfeatures.

Combinazione di Microstereolithography e Electrospinning per la Produzione di Membrane Equipaggiato con nicchie per la rigenerazione della cornea

Una cultura primarie di cellule endoteliali corneali bovini è stato utilizzato per studiare il meccanismo di transizione corneale endoteliale-mesenchimale. Inoltre, un corneale endotelio modello cryoinjury ratto è stato utilizzato per dimostrare corneale endoteliale transizione-mesenchimali in vivo.

In vitro e in modelli in vivo per studiare transizione corneale endoteliale-mesenchimale

Un protocollo per un ex vivo modello di cultura di organo corneale utile per studi di guarigione della ferita è descritto. Questo sistema modello può essere utilizzato per valutare gli effetti degli agenti per promuovere la guarigione rigenerativa o tossicità della droga in un ambiente organizzato di pluricellulare 3D.

Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

Qui, viene presentato un protocollo passo-passo per la preparazione e la coltivazione di bottoni corneali divisi su porcini. Poiché questo modello di coltura organo-tipicamente coltivata mostra i tassi di mortalità cellulare entro 15 giorni, paragonabili alle cornee dei donatori umani, rappresenta il primo modello che consente la coltivazione a lungo termine di cornee non umane senza aggiungere dextran tossico.

Un modello di cultura dell'organo endoteliale porcina utilizzando i pulsanti corneali divisi

Qui, presentiamo un protocollo per staccare le cellule endoteliali corneali (CEC) dalla membrana di Descemet (DM) utilizzando un laser neodymium:YAG (Nd:YAG) come modello di malattia ex vivo per la cherata toropatia (BK).

Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale

Questo protocollo descrive i passaggi critici necessari per stabilire e coltivare colture di cellule endoteliali corneali da espianti di tessuto umano o o novino. Viene inoltre presentato un metodo per la subcultura delle cellule endoteliali corneali su biomateriali membranosi.

Crescita degli strati cellulari endoteliali umani e ovini sulle membrane biomateriali

Qui, vengono sviluppati modelli animali basati su topo e coniglio per il danno meccanico e chimico dell'epitelio corneale per lo screening di nuove terapie e del meccanismo sottostante.

Modelli animali ex vivo e in vivo per lesioni meccaniche e chimiche dell'epitelio corneale

Descemet's Stripping Only è una procedura sperimentale in cui i pazienti con guttae corneale centrale derivanti dalla distrofia corneale endoteliale di Fuchs hanno la membrana di Descemet spogliata per le cellule periferiche per rigenerare lo strato endoteliale. Presentiamo una nuova metodologia che simula il DSO nelle cornee umane distrofiche ex vivo con guarigione accelerata stimolata da eFGF1 (NM141).

Un modello di coltura di organi corneali umani dello stripping di Descemet solo con guarigione accelerata stimolata dal fattore di crescita dei fibroblasti ingegnerizzato 1

Il presente protocollo dimostra i diversi passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. Le cornee rigeneranti o completamente restaurate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari seguendo la procedura di ferita.

Studiare la rigenerazione dei tessuti senza cicatrici nelle cornee embrionali dei pulcini feriti

Qui proponiamo tre diversi metodi per danneggiare le fibre sensoriali che innervano la cornea. Questi metodi facilitano lo studio della rigenerazione degli assoni nei topi. Questi tre metodi, adattabili ad altri modelli animali, sono ideali per lo studio della fisiologia e della rigenerazione dell'innervazione corneale.

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

Scopri un modello 3D in vitro per studiare le interazioni tra cellule stromali corneali e neuroni nella matrice extracellulare naturale. Questo metodo aiuta a comprendere i meccanismi del danno e della rigenerazione del nervo corneale.

Ingegneria tissutale corneale: Un In Vitro modello delle interazioni Stromal-nervo della Cornea umana

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