Ingegneria tissutale corneale: Un In Vitro modello delle interazioni Stromal-nervo della Cornea umana

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di studiare le interazioni cellulari tra le cellule stromali corneali umane e le cellule neuronali nella loro matrice extracellulare naturale. Il protocollo può essere ampliato per studiare le malattie e le distrofie corneali, come il cheratocono, la cheratopatia diabetica e la distrofia di Fuchs. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia della cornea umana, identificando i meccanismi sottostanti e i difetti nelle interazioni nervose dello stroma durante una specifica malattia corneale o distrofia.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule possono secernere la propria matrice extracellulare in vitro che fornisce un modello migliore e più accurato del tessuto corneale umano in vivo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie corneali, perché la valutazione delle interazioni cellula-cellula e matrice extracellulare garantirà una rappresentazione accurata del tessuto corneale e consentirà uno sviluppo di farmaci più mirato. Ora, questo metodo può fornire informazioni sul danno e la rigenerazione del nervo corneale.

Può essere applicato anche ad altri sistemi, come lo screening e lo sviluppo di farmaci. Al ricevimento dei campioni di tessuto corneale umano, trasferire i tessuti in una capsula di 21,5 centimetri quadrati contenente due millilitri di soluzione salina sterile tamponata con fosfato di Dulbecco. Posizionare la cupola corneale a faccia in su e utilizzare una lama di rasoio con un angolo di 45 gradi per raschiare lo strato epiteliale.

Quindi, capovolgi la cupola corneale a faccia in giù e raschia accuratamente l'endotelio dallo stroma. Lavare il tessuto stromale con DPBS. Mantieni i pezzi stromali bagnati con DPBS e usa una lama chirurgica numero 10 per tagliare i tessuti stromali in piccoli pezzi.

Utilizzare una pinza sterile per trasferire i pezzi stromali in un pallone di coltura T25 senza terreno. Lasciare che gli espianti aderiscano al fondo del pallone a 37 gradi Celsius per circa 30-40 minuti. Dopo aver tagliato con precisione il tessuto stromale, trasferire con cura il pallone nell'incubatrice.

È importante attendere da 30 a 40 minuti, quindi aggiungere i media lentamente. Questo passaggio è fondamentale per consentire la completa aderenza degli espianti, e prevenirne il distacco. Una volta aderito, aggiungere lentamente al pallone il Minimum Essential Medium di Eagle, contenente il 10% di siero fetale bovino e l'1% di antibiotico-antimicotico, senza disturbare gli espianti.

Posizionare delicatamente il pallone nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Lasciare gli espianti indisturbati fino a quando le cellule iniziano a isolarsi e a migrare nel pallone. Dopo circa due o quattro settimane, le cellule dovrebbero raggiungere il 100% di confluenza.

Dopo la confluenza al 100%, far passare le cellule rimuovendo il terreno di coltura tissutale e lavando le cellule con DPBS. Aggiungere la tripsina alle cellule, quindi incubare a 37 gradi Celsius. Dopo circa cinque minuti, osservare le cellule al microscopio ottico per confermare che si sono staccate.

Arrestare la proteolisi aggiungendo terreno fresco e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le provette a 1000 x g per pellettare le cellule. Rimuovere il surnatante con cautela senza disturbare il pellet e sospendere le celle in un terreno fresco.

Dopo aver eseguito un conteggio delle cellule, seminare circa una volta per 10 nelle sei cellule nel pallone di coltura T75 con terreno fresco per un'ulteriore espansione. Per assemblare il costrutto 3D, prima passare e contare i fibroblasti corneali umani, quindi seminare circa una volta 10 per i sei HCF su un inserto di membrana in policarbonato con pori da 0,4 micron. Aggiungi 1,5 millilitri di terreno fresco sulla parte superiore del costrutto.

Quindi pipettare altri 1,5 millilitri dello stesso terreno sul fondo di ciascun costrutto. Dopo 24 ore, aggiungere 1,5 millilitri di terreno, integrato con 0,5 millimolari di vitamina C nella parte superiore e inferiore di ciascun costrutto. Incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre settimane, aggiungendo terreno fresco contenente vitamina C a giorni alterni.

Questo stimolerà le cellule a secernere e assemblare la propria matrice extracellulare. Dopo tre settimane, aggiungere otto volte 10 alle terze cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y sulla parte superiore dei costrutti 3D precedentemente assemblati. In questa fase è fondamentale calcolare il numero esatto di cellule e attendere 24 ore prima di iniziare la differenziazione cellulare.

Dopo 24 ore di incubazione, avviare la differenziazione cellulare SH-SY5Y stimolando le cellule con 1,5 millilitri di EMEM con il 10% di FBS e 10 di acido retinoico micromolare. Quindi aggiungere 1,5 millilitri del terreno contenente vitamina C sul fondo del costrutto. L'acido retinoico è sensibile alla luce, quindi questo passaggio dovrebbe essere eseguito al buio.

Dopo cinque giorni, quando le cellule raggiungono la fase di differenziazione, aggiungere 1,5 millilitri di terreno privo di siero contenente due nanomolari BDNF e l'1% di antibiotico-antimicotico alla parte superiore del costrutto. Aggiungere un terreno fresco integrato con vitamina C sul fondo del costrutto. Coltivare le cellule per altri due giorni prima di elaborarle per ulteriori analisi.

Questa è un'immagine al microscopio elettronico a trasmissione ad alto ingrandimento del costrutto 3D autoassemblato che mostra la membrana in policarbonato e le cellule stromali corneali posizionate sulla parte superiore. Questa immagine mostra le cellule neuronali differenziate sedute in cima, che mostrano una disposizione delle cellule stromali-neuronali. Le frecce nell'immagine mostrano le cellule neuronali.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sempre umido il tessuto corneale, durante il taglio degli espianti e di mantenere sterili gli strumenti chirurgici e le lame. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare e utilizzare questo modello in vitro per studiare le interazioni cellulari tra le cellule stromali corneali umane e le cellule neuronali nella loro matrice extracellulare naturale. Non dimenticare che lavorare con BDNF, acido retinoico e lame chirurgiche può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare indumenti protettivi adeguati.