Sviluppo di un modello preclinico umano di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico co-coltivati con linee cellulari di cancro al seno
September 13th, 2017
Questo protocollo descrive lo sviluppo di un in vitro umano modello preclinico di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico in coltura con linee cellulari di cancro al seno per simulare l'interazione cellula-osteoclasto cancro. Il modello potrebbe essere utilizzato per avanzare la nostra comprensione della formazione di metastasi ossea e migliorare le opzioni terapeutiche.
L'obiettivo generale di questo modello preclinico umano in vitro di osteoclastogenesi derivato da monociti del sangue periferico, o PBMC, coltivati con linee cellulari di cancro al seno è quello di imitare le interazioni degli osteoclasti delle cellule tumorali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle metastasi ossee sugli effetti dell'interazione tra cellule tumorali e cellule ossee all'interno del microambiente osseo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un modello preclinico completamente umano.
Inoltre, questo metodo può fornire informazioni sulle metastasi ossee. Può anche essere applicato allo studio di altri meccanismi patologici legati all'osso, come l'osteoporosi. Gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà a causa della variabilità tra i donatori sani e nella selezione della densità cellulare PBMC appropriata.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto hanno bisogno di vedere le nostre fasi di selezione e semina PBMC richiedono una certa esperienza manuale prima di poter raggiungere la competenza. Iniziare diluendo almeno 20 millilitri di sangue intero da donatore sano in EDTA con un rapporto di uno a uno in PBS. Dopo aver mescolato accuratamente, dividere la soluzione di sangue in aliquote da 30 millilitri in provette coniche da 50 millilitri.
Applicare con cura 15 millilitri di terreno di separazione dei linfociti sul fondo di ciascuna provetta. Separare le celle mediante centrifugazione a gradiente di densità. E tirare la cella mononucleare bianca contenente buffy coat in un nuovo tubo da 15 millilitri.
Lavare le cellule raccolte due volte in 20 millilitri di PBS per lavaggio, seguito da lisi dei globuli rossi con cinque millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi per tre-cinque minuti, su ghiaccio. Arrestare la reazione con 20 millilitri di PBS e raccogliere i globuli bianchi mediante centrifugazione. Risospendere il pallino e completare l'alfa M-E-M per il conteggio.
Quindi, piastrate le cellule a una concentrazione di sette punti, cinque volte 10, per cinque PBMC per centimetro quadrato in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti per la loro incubazione a 37 gradi Celsius e al cinque percento di CO2. Dopo circa tre ore, rimuovere il surnatante, i detriti, le cellule non attaccate e gli eritrociti non lisati dalle colture. E aggiungi un terreno fresco, integrato con MCSF.
Quattordici giorni dopo la semina, lavare le cellule due volte con PBS e fissarle in paraformaldeide al quattro percento per 20 minuti a temperatura ambiente. Eseguire la colorazione della trappola secondo le istruzioni del produttore. Le cellule osteoclaste saranno TRAP positive con almeno quattro nuclei.
Conta manualmente le cellule simili agli osteoclasti al microscopio con un ingrandimento 10X. Per la differenziazione degli osteoclasti indotta dalle cellule tumorali, quando le cellule tumorali raggiungono la confluenza del novanta per cento, vengono staccate mediante tripsinizzazione e seminate su inserti porosi di quattro micrometri di punto zero a una concentrazione quattro volte 10 rispetto alle tre cellule per centimetro quadrato in MEM alfa fresco. Il giorno successivo, posizionare gli inserti seminati su colture cellulari mononucleate indifferenziate piastrate in un giorno in alfa M-E-M completo e cambiare il terreno ogni due o tre giorni.
Quindi, 11 giorni dopo l'inizio della co-coltura, trasferire gli inserti in una nuova piastra contenente il reagente appropriato per l'analisi a valle desiderata. Le cellule del cancro al seno possono sostenere l'osteoclastogenesi, poiché il numero di osteoclasti nei pozzetti indotti dalle cellule tumorali è simile a quello ottenuto nei pozzetti di controllo del fattore di crescita positivo. Il numero di osteoclasti osservati in tutte le colture si riduce tuttavia quando le cellule vengono trattate con un farmaco antitumorale.
È interessante notare che le aree superficiali degli osteoclasti maturi derivate dai fattori di crescita sono più grandi di quelle indotte dalle cellule tumorali. Questo effetto non è osservato nelle colture trattate con farmaci antitumorali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sette, otto ore, se eseguita correttamente.
Dopo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori analisi a valle come l'analisi dell'espressione genica, il Western Blot, l'analisi in immunofluorescenza o l'ELISA per rispondere a ulteriori domande sulle interazioni cellula tumorale/cellula ossea o sui meccanismi farmacologici antitumorali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle metastasi ossee per studiare il microambiente osseo, in un modello preclinico completamente umano. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come co-coltivare i monociti, sottoporsi alla differenziazione con le cellule tumorali.
Non dimenticare che lavorare con campioni biologici e farmaci può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e camici da laboratorio.
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Panoramica
Questo protocollo descrive lo sviluppo di un modello preclinico umano in vitro di osteoclastogenesi da monociti del sangue periferico coltivati con linee cellulari di cancro al seno per imitare l'interazione tra cellule tumorali e osteoclasti. Questo modello può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti la metastasi ossea e migliorare le opzioni terapeutiche.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Osteoclastogenesi
- Metastasi ossea
- Interazioni tra cellule tumorali
Sfondo
- Il modello utilizza monociti del sangue periferico (PBMC).
- Mira a replicare le interazioni tra cellule tumorali e osteoclasti.
- Questa ricerca è significativa per comprendere le patologie legate alle ossa.
- La variabilità tra donatori sani può influenzare i risultati.
Obiettivo dello studio
- Imitare le interazioni tra cellule tumorali e osteoclasti.
- Indagare gli effetti di queste interazioni all'interno del microambiente osseo.
- Fornire informazioni sulla metastasi ossea e sulle condizioni correlate.
Metodi utilizzati
- Coltura di PBMC con linee cellulari di cancro al seno.
- Valutazione dell'osteoclastogenesi.
- Valutazione delle interazioni tra cellule tumorali e cellule ossee.
- Analisi della variabilità nella densità cellulare dei PBMC.
Risultati principali
- Il modello imita con successo le interazioni tra cellule tumorali e osteoclasti.
- Le intuizioni acquisite possono informare le strategie terapeutiche per la metastasi ossea.
- Le potenziali applicazioni si estendono ad altre malattie legate alle ossa.
- Le sfide includono la variabilità del donatore e la selezione della densità cellulare.
Conclusioni
- Questo modello preclinico umano è prezioso per studiare la metastasi ossea.
- Migliora la comprensione delle interazioni tra cellule tumorali nel microambiente osseo.
- Gli studi futuri possono sfruttare questo modello per applicazioni più ampie nella patologia ossea.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This fully human preclinical model enables mechanistic de-risking of osteoclastogenic pathways in bone metastasis by recapitulating cancer cell-osteoclast crosstalk in a physiologically relevant system. It supports target validation and assay development for anti-tumor therapeutics by providing quantitative readouts of osteoclast differentiation and function. The model enhances predictive confidence in lead identification by allowing direct observation of reciprocal interactions and downstream analysis of both cell types under drug treatment conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding tumor-induced osteoclastogenesis and pathway clarification in the bone microenvironment.
- Operational Value: Supports biological de-risking and functional target validation by modeling osteoclast differentiation from primary human monocytes under defined co-culture conditions.
- Scientific Value: Facilitates predictive confidence and portfolio triage by quantifying osteoclast formation in response to cancer cell stimuli versus growth factor controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized osteoclast differentiation from PBMCs using RANKL and MCSF.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via fixed cell density seeding (7.5×10⁵ PBMC/cm²) and timed differentiation (14 days) with TRAP-based osteoclast quantification.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by testing drug effects on osteoclastogenesis in both indirect (conditioned medium) and direct co-culture formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance modeling for osteoporosis and other bone conditions through adaptation of the osteoclastogenesis assay.
- Operational Value: Ensures translational continuity by using fully human cells, reducing species translation risk in preclinical-to-clinical extrapolation.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring changes in osteoclast number and surface area as pharmacodynamic biomarkers of drug efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for bone-targeted therapies and bone microenvironment modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cancer cell-derived factors in osteoclast activation and pathway clarification of RANKL-independent osteoclast induction mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized monocyte isolation, differentiation, and co-culture with breast cancer cell lines on permeable inserts for paracrine and juxtacrine signaling studies.
- Analytics: Provides quantitative osteoclast readouts via TRAP staining, multinucleated cell counting, and morphometric analysis (surface area) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling study of drug effects on the metastatic bone microenvironment using clinically relevant breast cancer cell lines.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for studying osteoclast modulation across multiple cancer types and bone pathologies beyond breast cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in osteoclast-cancer cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined PBMC isolation, seeding density, and cytokine supplementation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of drug effects on osteoclast formation and function, reducing late-stage biological risk in bone metastasis programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying osteoclastogenic potential of compounds and guiding advancement based on bone microenvironment modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, culture, and differentiation techniques, including PBMC separation and monocyte adherence.
- Depends on instrumentation for cell counting, centrifugation, microscopy (10X magnification for osteoclast counting), and incubation (37°C, 5% CO₂).
- Necessitates cross-team standardization of PBMC donor sourcing, cell density optimization (7.5×10⁵ PBMC/cm²), and co-culture timing (11 days post-cancer cell seeding) to minimize variability.
- Involves adaptation considerations when extending to non-breast cancer cell lines or alternative osteoclast stimuli beyond RANKL/MCSF.
- Includes practical limitations such as donor variability in osteoclast differentiation potential and the need for manual proficiency in PBMC seeding and co-culture setup.
