Sviluppo di un modello preclinico umano di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico co-coltivati con linee cellulari di cancro al seno
13 settembre 2017
Questo protocollo descrive lo sviluppo di un in vitro umano modello preclinico di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico in coltura con linee cellulari di cancro al seno per simulare l'interazione cellula-osteoclasto cancro. Il modello potrebbe essere utilizzato per avanzare la nostra comprensione della formazione di metastasi ossea e migliorare le opzioni terapeutiche.
L'obiettivo generale di questo modello preclinico umano in vitro di osteoclastogenesi derivato da monociti del sangue periferico, o PBMC, coltivati con linee cellulari di cancro al seno è quello di imitare le interazioni degli osteoclasti delle cellule tumorali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle metastasi ossee sugli effetti dell'interazione tra cellule tumorali e cellule ossee all'interno del microambiente osseo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un modello preclinico completamente umano.
Inoltre, questo metodo può fornire informazioni sulle metastasi ossee. Può anche essere applicato allo studio di altri meccanismi patologici legati all'osso, come l'osteoporosi. Gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà a causa della variabilità tra i donatori sani e nella selezione della densità cellulare PBMC appropriata.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto hanno bisogno di vedere le nostre fasi di selezione e semina PBMC richiedono una certa esperienza manuale prima di poter raggiungere la competenza. Iniziare diluendo almeno 20 millilitri di sangue intero da donatore sano in EDTA con un rapporto di uno a uno in PBS. Dopo aver mescolato accuratamente, dividere la soluzione di sangue in aliquote da 30 millilitri in provette coniche da 50 millilitri.
Applicare con cura 15 millilitri di terreno di separazione dei linfociti sul fondo di ciascuna provetta. Separare le celle mediante centrifugazione a gradiente di densità. E tirare la cella mononucleare bianca contenente buffy coat in un nuovo tubo da 15 millilitri.
Lavare le cellule raccolte due volte in 20 millilitri di PBS per lavaggio, seguito da lisi dei globuli rossi con cinque millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi per tre-cinque minuti, su ghiaccio. Arrestare la reazione con 20 millilitri di PBS e raccogliere i globuli bianchi mediante centrifugazione. Risospendere il pallino e completare l'alfa M-E-M per il conteggio.
Quindi, piastrate le cellule a una concentrazione di sette punti, cinque volte 10, per cinque PBMC per centimetro quadrato in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti per la loro incubazione a 37 gradi Celsius e al cinque percento di CO2. Dopo circa tre ore, rimuovere il surnatante, i detriti, le cellule non attaccate e gli eritrociti non lisati dalle colture. E aggiungi un terreno fresco, integrato con MCSF.
Quattordici giorni dopo la semina, lavare le cellule due volte con PBS e fissarle in paraformaldeide al quattro percento per 20 minuti a temperatura ambiente. Eseguire la colorazione della trappola secondo le istruzioni del produttore. Le cellule osteoclaste saranno TRAP positive con almeno quattro nuclei.
Conta manualmente le cellule simili agli osteoclasti al microscopio con un ingrandimento 10X. Per la differenziazione degli osteoclasti indotta dalle cellule tumorali, quando le cellule tumorali raggiungono la confluenza del novanta per cento, vengono staccate mediante tripsinizzazione e seminate su inserti porosi di quattro micrometri di punto zero a una concentrazione quattro volte 10 rispetto alle tre cellule per centimetro quadrato in MEM alfa fresco. Il giorno successivo, posizionare gli inserti seminati su colture cellulari mononucleate indifferenziate piastrate in un giorno in alfa M-E-M completo e cambiare il terreno ogni due o tre giorni.
Quindi, 11 giorni dopo l'inizio della co-coltura, trasferire gli inserti in una nuova piastra contenente il reagente appropriato per l'analisi a valle desiderata. Le cellule del cancro al seno possono sostenere l'osteoclastogenesi, poiché il numero di osteoclasti nei pozzetti indotti dalle cellule tumorali è simile a quello ottenuto nei pozzetti di controllo del fattore di crescita positivo. Il numero di osteoclasti osservati in tutte le colture si riduce tuttavia quando le cellule vengono trattate con un farmaco antitumorale.
È interessante notare che le aree superficiali degli osteoclasti maturi derivate dai fattori di crescita sono più grandi di quelle indotte dalle cellule tumorali. Questo effetto non è osservato nelle colture trattate con farmaci antitumorali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sette, otto ore, se eseguita correttamente.
Dopo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori analisi a valle come l'analisi dell'espressione genica, il Western Blot, l'analisi in immunofluorescenza o l'ELISA per rispondere a ulteriori domande sulle interazioni cellula tumorale/cellula ossea o sui meccanismi farmacologici antitumorali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo delle metastasi ossee per studiare il microambiente osseo, in un modello preclinico completamente umano. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come co-coltivare i monociti, sottoporsi alla differenziazione con le cellule tumorali.
Non dimenticare che lavorare con campioni biologici e farmaci può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e camici da laboratorio.
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Panoramica
Questo protocollo descrive lo sviluppo di un modello preclinico umano in vitro di osteoclastogenesi a partire da monociti del sangue periferico coltivati con linee cellulari di carcinoma mammario, al fine di mimare l'interazione tra cellule tumorali e osteoclasti. Questo modello può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la metastasi ossea e migliorare le opzioni terapeutiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Osteocitogenesi
- Metastasi ossee
- Interazioni tra cellule tumorali
Sfondo
- Il modello utilizza monociti del sangue periferico (PBMC).
- Ha lo scopo di replicare le interazioni tra cellule tumorali e osteoclasti.
- Questa ricerca è significativa per la comprensione delle patologie legate alle ossa.
- La variabilità tra donatori sani può influenzare i risultati.
Scopo dello studio
- Per simulare le interazioni tra cellule tumorali e osteoclasti.
- Per studiare gli effetti di queste interazioni all'interno del microambiente osseo.
- Per fornire informazioni sulle metastasi ossee e sulle condizioni correlate.
Metodi Utilizzati
- Coltura di PBMC con linee cellulari di carcinoma mammario.
- Valutazione dell'osteocitogenesi.
- Analisi delle interazioni tra cellule tumorali e cellule ossee.
- Analisi della variabilità della densità cellulare dei PBMC.
Risultati principali
- Il modello imita con successo le interazioni tra cellule tumorali e osteoclasti.
- Le informazioni ottenute possono guidare strategie terapeutiche per la metastasi ossea.
- Le possibili applicazioni si estendono ad altre malattie correlate all'osso.
- Le sfide includono la variabilità del donatore e la selezione della densità cellulare.
Conclusioni
- Questo modello preclinico umano è utile per lo studio delle metastasi ossee.
- Migliora la comprensione delle interazioni delle cellule tumorali nel microambiente osseo.
- Studi futuri potranno sfruttare questo modello per applicazioni più ampie nella patologia ossea.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Questo modello preclinico completamente umano consente la riduzione del rischio meccanicistico dei percorsi osteoclastogenici nella metastasi ossea, riproducendo l'interazione reciproca tra cellule tumorali e osteoclasti in un sistema fisiologicamente rilevante. Supporta la validazione degli bersagli e lo sviluppo di saggi per terapie antitumorali fornendo letture quantitative della differenziazione e della funzione degli osteoclasti. Il modello aumenta la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti attivi permettendo l'osservazione diretta delle interazioni reciproche e l'analisi downstream di entrambi i tipi cellulari in condizioni di trattamento farmacologico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche riguardo l'osteoclastogenesi indotta dal tumore e la chiarificazione dei percorsi nel microambiente osseo.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico e la validazione funzionale delle target modellando la differenziazione degli osteoclasti a partire da monociti umani primari in condizioni definite di co-coltura.
- Valore scientifico: Favorisce la previsione e il triage del portafoglio progettuale quantificando la formazione degli osteoclasti in risposta a stimoli derivati da cellule tumorali rispetto ai controlli con fattori di crescita.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi mediante differenziazione standardizzata di osteoclasti da PBMC utilizzando RANKL e MCSF.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità del saggio attraverso la semina a densità cellulare fissa (7,5×10⁵ PBMC/cm²) e la differenziazione temporizzata (14 giorni) con quantificazione degli osteoclasti basata sulla TRAP.
- Valore scientifico: Permette una valutazione affidabile di composti testando gli effetti di farmaci sull'osteocitogenesi sia in condizioni indirette (mezzo condizionato) sia in formati di co-coltura diretta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione della rilevanza delle malattie per l'osteoporosi e altre condizioni ossee attraverso l'adattamento del saggio di osteoclastogenesi.
- Valore operativo: Garantisce una continuità traslazionale utilizzando cellule completamente umane, riducendo il rischio di traduzione tra specie nell'estrapolazione da preclinica a clinica.
- Valore scientifico: Permette decisioni di avanzamento aggiustate per il rischio misurando le variazioni nel numero di osteoclasti e nella superficie come biomarcatori farmacodinamici dell'efficacia del farmaco.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino ai test di efficacia preclinica, in particolare per le terapie mirate all'osso e per i modulatori del microambiente osseo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui fattori derivati dalle cellule tumorali nell'attivazione degli osteoclasti e la chiarificazione dei meccanismi di induzione degli osteoclasti indipendenti da RANKL.
- Screening: Garantisce prontezza del saggio mediante isolamento standardizzato di monociti, differenziazione e co-coltura con linee cellulari di carcinoma mammario su inserti permeabili, per studi sui segnali paracrini e giustacrini.
- Analisi: Fornisce letture quantitative degli osteoclasti mediante colorazione per TRAP, conteggio delle cellule multinucleate e analisi morfometrica (area superficiale) per confrontare le condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica permettendo lo studio degli effetti dei farmaci sul microambiente osseo metastatico, utilizzando linee cellulari di carcinoma mammario clinicamente rilevanti.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per lo studio della modulazione degli osteoclasti in diversi tipi di cancro e in patologie ossee oltre il carcinoma mammario.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle interazioni tra osteoclasti e cellule tumorali.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso protocolli definiti per l'isolamento dei PBMC, la densità di semina e la supplementazione con citochine.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione consentendo una valutazione precoce degli effetti dei farmaci sulla formazione e funzione degli osteoclasti, riducendo i rischi biologici in fase avanzata nei programmi per metastasi ossee.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio quantificando il potenziale osteoclastogenico dei composti e guidando lo sviluppo in base alla modulazione del microambiente osseo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento, coltura e differenziazione di cellule umane primarie, inclusa la separazione dei PBMC e l'adesione dei monociti.
- Richiede strumentazione per il conteggio cellulare, la centrifugazione, la microscopia (ingrandimento 10X per il conteggio degli osteoclasti) e l'incubazione (37°C, 5% CO₂).
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per l'approvvigionamento dei donatori di PBMC, l'ottimizzazione della densità cellulare (7,5×10⁵ PBMC/cm²) e i tempi della co-coltura (11 giorni dopo la semina delle cellule tumorali) al fine di ridurre la variabilità.
- Comporta considerazioni di adattamento qualora si estenda a linee cellulari di cancro non mammario o a stimoli osteoclastogenici alternativi rispetto a RANKL/MCSF.
- Comprende limitazioni pratiche, come la variabilità tra donatori nel potenziale di differenziazione osteoclastica e la necessità di abilità manuali nella semina dei PBMC e nell'allestimento della co-coltura.
