Name: Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Scopri la manipolazione di singole molecole di G-quadruplex con pinzette magnetiche per studiare la stabilità e la regolazione proteica. Questo metodo consente misurazioni stabili della dinamica molecolare nel tempo.

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Gli autori ringraziano Meng Pan per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è supportato da Singapore Ministero di formazione accademica ricerca fondo Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) per J.Y.; la Fondazione di ricerca nazionali attraverso l'Istituto Mechanobiology da Singapore a J.Y.; il National Research Foundation, ufficio, Singapore del primo ministro, nell'ambito del programma Investigatorship NRF (NRF Investigatorship premio No. NRF-NRFI2016-03 al J.Y.; il fondo di ricerca fondamentale per le Università centrale (2017KFYXJJ153) di H. Y.

Ho &gt; <li>esempio di impostazione e identificare singole dsDNA tether <ol><li>formazione Tether <ol><li>delicatamente il flusso in 200 X diluito M-280, paramagnetici perle nella soluzione di saggio (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7,4 ) in un canale. Incubare per 10 minuti consentire le perline da associare alla biotina di molecole di DNA immobilizzati sulla superficie rivestita con SMCC fino alla fine del tiolo-etichettati. Delicatamente lavare via un-tethered perline utilizzando 200 µ l di soluzione di reazione standard. 
			Nota: Le perle di M-280 mostrano più basso legame non specifico alla superficie rispetto alle altre biglie magnetiche commerciali come M-270.</li>
		</ol></li> <li>Montare il canale sul palco microscopio. Ricerca per le perle sulla superficie inferiore usando 100 X obiettivo a immersione in olio.</li>
		<li>Selezionare una perlina di riferimento sulla superficie e una perlina tethered commovente. Compilare le librerie di immagine iniziale del branello di riferimento e perlina legato alle diverse defocus aerei.</li>
		<li>Calibrazione dell'immagine di perline <ol><li>prima di esperimenti, utilizzare un attuatore piezoelettrico oggettivi per ottenere immagini di riferimento e di perle legati al defocus diversi piani distanziati di 20-50 nm, che vengono archiviati come due immagine separata della perla librerie e sono rispettivamente indicizzati con la distanza di sfocatura ( Figura 2D).</li>
		</ol></li> <li>x, y, z posizione determinazione <ol><li>durante gli esperimenti, per determinare la posizione del tallone nel piano x-y il centroide della perla. Determinare la modifica dell'altezza del tallone tethered confrontando l'immagine corrente della perla con quelli memorizzati nella libreria. Utilizzare l'analisi della funzione di auto-correlazione dello spettro di potenza della trasformata di Fourier del branello immagini 16.</li>
		</ol></li> <li>Anti-drift feedback utilizzando perlina riferimento <ol><li>durante gli esperimenti, utilizzare il piezo a " blocco " la distanza tra l'obiettivo e un'immagine di perlina di riferimento specifici memorizzati nella libreria tramite una bassa frequenza feedback di controllo, affinché l'immagine di tallone bloccato ha la migliore correlazione con una specifica immagine memorizzata nella libreria ( Figura 2D).</li>
		</ol></li> <li>Determinare se il tether è una molecola singola dsDNA applicando ~ 65 pN forza determinare una molecola singola dsDNA se il tether subisce il DNA caratteristico overstretching transizione 17 , 18 , 19. Ripetere la procedura finché non viene trovato un singolo dsDNA tether. (Fare riferimento alla sezione successiva per forza calibrazione e DNA overstretching transizione).</li>
	</ol></li> 4. Calibrazione di forza magnetica pinzette <ol><li>determinare direttamente la forza (fino a 100 pN) per lunghe molecole di DNA (48.502 bp λ-DNA) utilizzando fluttuazione tallone attraverso: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq1.jpg"> , dove k B è la costante di Boltzmann, T è la temperatura in Kelvin scala, δ 2 y è la varianza della fluttuazione della perla nella direzione perpendicolare al campo magnetico e la forza direzione. In questa direzione, il movimento del tallone può essere descritto come una fluttuazione di pendolo con una lunghezza di l + r 0, dove l è la distanza di end-to-end lungo la direzione della forza (estensione) del DNA, e r 0 è il raggio del branello 10 ( Figura 3A).</li>
	<li>Determinare la curva di taratura per forza F in funzione dei magneti a distanza tallone d e F (d) per differenti perline usando il lungo λ-DNA. Di solito, la distanza tra il magnete e la lamella viene utilizzata come la lunghezza del legare di DNA può essere ignorata. Appoggiare la F-curva d dalla funzione decadimento doppio-esponenziale: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq2.jpg"> , dove il raccordo parametri α1, α2, γ1, γ2 sono determinati dalla pinzetta magnetica e il parametro C è determinato dalla proprietà eterogenea di biglie magnetiche. Spostando la C, la F-curva d ottenuto da differenti perline può essere sovrapposta 10 ( Figura 3B).</li>
	<li>Esperimenti di calibrazione del parametro C per biglie magnetiche individuali per DNA breve.
	<ol><li>Per determinare la forza basata sulla fluttuazione richiede la posizione del tallone ad una frequenza superiore alla frequenza di angolo di registrazione: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq3.jpg"> , dove γ è il trascinamento coefficiente del tallone. Per breve DNA a forza elevata, richiede più veloce di 100 Hz frequenza di registrazione, pertanto, la forza non può essere misurata direttamente basata sulla fluttuazione con la fotocamera. Tuttavia, il parametro C può essere determinato misurando la forza a bassa forza gamma (&lt; 15 pN) utilizzando fluttuazione e montaggio i dati con un calibrato F-curva d per ottenere il parametro C 20.</li>
		<li>In alternativa, per esperimenti con dsDNA, determinare il parametro C usando il DNA overstretching transizione una forza di ~ 65 pN ( Figura 3) 21 , 22 , 23 registrando la posizione d al salto di estensione ha mostrato quale dsDNA (0,6 X aumento di lunghezza di lunghezza di contorno). Dopo aver determinato il parametro C, calcolare la forza per le perline tethered.</li>
	</ol></li> <li>Controllare la velocità di caricamento di programmazione il movimento dei magneti attraverso la funzione inversa di F (d). Il magnete dovrebbe affrontare il campione doppio esponenzialmente. 
	Nota: L'errore relativo della forza determinata da un metodo di estrapolazione è ~ 10% ed è principalmente causata dalla perlina raggio eterogeneità 20.</li>
</ol> 5. Manipolazione di singola molecola del G4 in presenza ed assenza di Binding Proteins <ol><li>Force-rampa esperimenti <ol><li>dopo aver identificato la lombata di dsDNA, eseguire una scansione di forza-aumento ad un tasso di carico di 0,2 pN/s seguita da un scansione di forza-decesso a -0,2 pN/s. Dopo ogni ciclo di allungamento, tenere la molecola di DNA a 1 pN per 30 s per consentire il ssDNA a ripiegare a G4.</li>
	</ol></li> <li>Force-salto esperimenti <ol><li>ciclo la forza tra 54 pN per 30 s in base al quale un G4 piegato potrebbe essere spiegato e 1 pN per 60s, sotto il quale potrebbe ripiegare un piegato G4-15T.</li>
	</ol></li> <li>Soluzione proteica Flowing <ol><li>fluire la soluzione della proteina quando al ~ 20 pN forza per evitare allegato delle perline per il vetrino coprioggetti. Il helicase RHAU DEAH-box, che ha mostrato elevata specificità la struttura G4, è stato usato 24. Il ricombinante dell'elicasi RHAU (DmRHAU) di Drosophila melanogaster è stata espressa in Escherichia coli e purificata come descritto in precedenza 25. Il G4 svolgimento attività di DmRHAU è stata analizzata su un G4 DNA substrato 13 tetramolecolari.</li>
	</ol></li> <li>Analizzare la forza di spiegamento utilizzando un in-House scritti Matlab programma 14.</li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Come descritto sopra, una piattaforma per lo studio della stabilità meccanica del G4 DNA e le interazioni della proteina a G4 utilizzando una pinzetta magnetica di singola molecola è segnalata. Accompagnando la piattaforma, sono sviluppati protocolli altamente efficienti di trovare G4 DNA tether e misura della chiusura-apertura dinamica e la stabilità della struttura G4 con risoluzione speciale nanometri. Il bloccaggio del piano focale consente controllo antislittamento altamente stabile, che è importante per la rilevazi...

Quattro-stranded DNA o RNA G4 strutture svolgono un ruolo critico in molti processi biologici importanti1. Molte proteine sono coinvolte nel legame G4 e regolamento, comprese le proteine obbligatorie del telomero (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, fattori di trascrizione (nucleolina, PARP1)3, RNA, proteine (hnRNP A1, di elaborazione hnRNP A2)4, elicasi (BLM, Pif1, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2)5e replicazione del DNA relative proteine (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Legame con le proteine può stabilizzare o destabilizzare G4 strutture; regolando le successive funzioni biologiche. La stabilità del G4 è stata misurata da thermal fusione utilizzando raggi ultravioletti (UV) o di metodi di dicroismo circolare (CD)7. Tuttavia, tali condizioni non sono fisiologiche rilevanti e sono difficili da applicare per lo studio degli effetti di binding proteine7.
Il rapido sviluppo delle tecnologie di manipolazione di singola molecola ha permesso studi di chiusura e apertura di una biomolecola, ad esempio un DNA o una proteina, a livello di singola molecola con risoluzione nanometrica in tempo reale8. Microscopia a forza atomica (AFM), pinzette ottiche e magnetiche pinzette sono i più comunemente usati metodi di manipolazione di singola molecola. Rispetto a AFM e pinzette ottiche9, magnetiche pinzette permettono misurazioni stabili di chiusura-apertura dinamica di una singola molecola nei giorni utilizzando una tecnica anti-drift10,11.
Qui, una piattaforma di singola molecola manipolazione usando pinzetta magnetica per studiare la regolazione della stabilità di G4 da proteine leganti è segnalato12,13. Questo lavoro delinea gli approcci di base, tra cui campione e flusso preparazione di canale, il programma di installazione di pinzette magnetiche e la calibrazione di forza. Il controllo di forza e i protocolli di antislittamento come descritto nel passaggio 3 consentono misure di tempo lungo sotto diversi controlli di forza, ad esempio costante forza (forza di bloccaggio) e carico costanti votare (forza-rampa) e forza-salto misura. Il protocollo di calibrazione forza descritto nel passaggio 4 consente forza calibrazione di &#60; 1 µm cavezze breve sopra una vasta forza gamma pN fino a 100, con un errore relativo all'interno di 10%. Un esempio di regolazione della stabilità del RNA Helicase associato AU-rich element (RHAU) elicasi (alias DHX36, G4R1) che gioca un ruolo essenziale nella risoluzione di che RNA G4 viene utilizzato per illustrare le applicazioni di questa piattaforma13.

<table><tbody><tr><td>Primer per PCR del DNA</td><td>IDT</td><td></td><td>Preparazioni del DNA</td></tr><tr><td>Prodotti chimici per PCR del DNA</td><td>NEB</td><td></td><td>Preparazioni del DNA</td></tr><tr><td>enzima di restrizione BstXI</td><td>NEB</td><td>R0113S Preparazioni</td><td>del DNA</td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti (#1.5, 22*32 mm e 20*20 mm)</td><td>BMH. BIOMEDIA</td><td>72204</td><td>preparazione del canale di flusso</td></tr><tr><td>Decon90</td><td>Decon Laboratories Preparazione del canale di</td><td>flusso</td>limitato <td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>440140-500ML</td><td>Preparazione del canale di flusso</td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22322</td><td>preparazione del canale di flusso</td></tr><tr><td>M-280, perle parammanetiche ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>11205D</td><td>preparazione del canale di flusso</td></tr><tr><td>Microsfere di ammino Polybead 3.00 &mu; m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17145-5</td><td>preparazione del canale di flusso</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M6250-250ML</td><td>preparazione del canale di flusso</td></tr><tr><td>Microscopi Olympus IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Configurazione delle pinzette magnetiche</td></tr><tr><td>Piezo-Z Stages P-721</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-721</td><td>Configurazione delle pinzette magnetiche</td></tr><tr><td>Olympus Obiettivo MPLAPON-Oil 100X</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON-Oil 100X</td><td>Configurazione pinzette magnetiche</td></tr><tr><td>Telecamera CCD/CMOS</td><td>AVT</td><td>Pike F-032B</td><td>Configurazione pinzette magnetiche</td></tr><tr><td>Traslazione tavolino lineare</td><td>Physik Instrumente</td><td>MoCo DC</td><td>Configurazione pinzette magnetiche</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL</td><td>Configurazione pinzette magnetiche</td></tr><tr><td>Magneti cubici</td><td>Supermagnete</td><td></td> Configurazione <td>pinzette magnetiche</td></tr><tr><td>Configurazione</td><td>delle pinzette magnetiche</td>Labview <td>National Instruments</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro/Matlab</td><td>OriginLab/MathWorks</td><td></td><td>Analisi dei dati</td></tr></tbody></table>

manipolazione di singola molecola di g-quadruplex di pinzette magnetiche

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonico dell'acido nucleico struttura secondaria che g-quadruplex (G4) sono coinvolti in diversi processi cellulari, come ad esempio la replicazione del DNA, trascrizione, elaborazione del RNA e l'allungamento dei telomeri. Durante questi processi, varie proteine legano e risolvere strutture G4 per svolgere la loro funzione. Come la funzione di G4 spesso dipende dalla stabilità della sua struttura piegata, è importante studiare come G4 proteine regolano la stabilità di G4. Questo lavoro presenta un metodo per modificare singole molecole di G4 usando la pinzetta magnetica, che permette studi del regolamento delle proteine leganti G4 su una singola molecola di G4 in tempo reale. In generale, questo metodo è adatto per un ampio campo di applicazioni negli studi per interazioni proteine/ligandi e regolamenti su varie strutture secondarie del DNA o RNA.

qui per visualizzare la versione ingrandita di questa figura.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56328/56328fig5.jpg"> 
Figura 5: Misurazioni di forza-salto del G4 svolgimento. (A) traccia di tempo rappresentativo del cambiamento di altezza tallone durante forza saltare cicli tra 1 pN e pN 54 misurata senza DmRHAU, con 10 nM DmRHAU ma senza ATP e con 10 nM DmRHAU e 1 mM ATP, come indicato nel pannello di figura....

Una piattaforma di singola molecola magnetico pinzette per manipolare G-quadruplex è segnalata, che permette per lo studio della stabilità di G4 e regolamento di varie proteine.

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di misurare direttamente il ripiegamento e il dispiegamento dei G-quadruplex, abbreviato in G4, e la regolazione mediante il legame delle proteine a livello di singola molecola utilizzando pinzette magnetiche. Questo messaggio può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo G4, come la dinamica fluttuante di G4 e la regolazione da parte delle proteine leganti. Il vantaggio principale di questa tecnica, è che le pinzette magnetiche, consentono una misurazione stabile, della dinamica di galleggiamento di dimensioni nanometriche di una singola molecola per giorni, utilizzando la tecnica anti-deriva.Iniziamo con questo messaggio, può fornire all'interno i meccanismi molecolari della stabilità di G4, le attività dell'elicasi su G4, può anche essere utilizzato per sondare gli al-a-do-gee correlati alle proteine leganti G4, o ligani, che possono avere potenziali applicazioni terapeutiche. Inoltre, può anche essere utilizzato per sondare le interazioni del DNA delle proteine esterne o le interazioni delle proteine proteiche. Iniziare questa procedura con la preparazione del DNA G4 nel canale di flusso, come descritto nel protocollo di testo.Il DNA G4 è stato preparato mediante ligata G4 formando DNA a singolo filamento, DNA a singolo filamento a due fianchi e un manico di DNA a doppio filamento, utilizzando legati di DNA T4. Per la configurazione delle pinzette magnetiche, avviare il programma delle pinzette magnetiche. Qui, le pinzette magnetiche sono controllate da un programma di visualizzazione del laboratorio scritto interno.Quindi, allineare i centri del magnete prima di montare il canale. Utilizzare una lente dell'obiettivo 10 volte per regolare gli assi X e Y del magnetismo, nell'accesso ottico del microscopio. Utilizzare un manipolatore motorizzato controllato da computer per spostare i magneti lungo la direzione Z e impostare la distanza tra i magneti e il vetrino coprioggetti su D uguale a zero, quando il magnete si attacca a un vetrino coprioggetti sul microscopio.Programmare il movimento del magnetismo attraverso il manipolatore per ottenere il controllo della forza, compresa la forza costante e la forza variabile nel tempo. Utilizzare una sorgente luminosa a diodi emettitori di luce intensa per l'illuminazione retrodiffusa del cordone attraverso l'obiettivo. Raccogli le immagini del cordone e una frequenza di campionamento di 100 hertz, tramite una fotocamera del dispositivo accoppiato a modifiche.Per la formazione del cavo, far scorrere delicatamente 200 perle paramagnetiche M280 diluite in soluzione as-say in un canale. Incubare la miscela per 10 minuti per consentire alle perle di legarsi alle molecole di DNA marcate con biotina immobilizzate sulla superficie codificata SMCC attraverso l'ent marcato con tiolo. Lavare delicatamente le perle non legate utilizzando 200 microlitri di soluzione di reazione standard.Quindi, montare il canale sul tavolino del microscopio. Cerca le perline sulla superficie inferiore utilizzando l'obiettivo a immersione in olio 100 volte. Selezionate un cordone di riferimento sulla superficie e un cordone vincolato in movimento.Costruisci le librerie di immagini iniziali, sia della perlina di riferimento che della perlina legata e di diversi piani defocalizzati. Prima degli esperimenti, utilizzare un attuatore piezoelettrico obiettivo per ottenere immagini di perline di riferimento e legate in diversi piani defocalizzati, distanziati da 20 a 50 nanometri. Memorizza le immagini come due librerie di immagini a tallone separate che sono rispettivamente indicizzate con la distanza sfocata.Durante gli esperimenti, determinare la posizione del tallone nel piano XY, in base al baricentro del perlo. Determinare anche la variazione di altezza del tallone vincolato confrontando l'immagine corrente del tallone con quelle memorizzate nella libreria. Utilizzare l'analisi della funzione di correlazione automatica dello spettro di potenza della trasformata di Fourier delle immagini delle perline.Durante gli esperimenti, utilizzare il Pizeo per bloccare la distanza tra l'obiettivo in una specifica immagine di bead di riferimento memorizzata nella libreria attraverso un controllo di feedback a bassa frequenza, in modo che l'immagine del bead bloccato, abbia la migliore correlazione con l'immagine specifica memorizzata nella libreria. Determina se il cavo è una singola molecola di DNA a doppio filamento, applicando circa 65 piconewton di forza. Un cavo è una singola molecola di DNA a doppio filamento se subisce la caratteristica transizione di sovraallungamento del DNA.Ripetere il processo fino a quando non viene trovato un singolo cavo di DNA a doppio filamento. La relazione tra la forza e la posizione del magnete, o la cosiddetta curva della distanza della forza, è stata calibrata in base alla fluttuazione del cordone. Inoltre, la transizione di sovraallungamento del DNA a doppio filamento che si è verificata vicino a 65 piconewton, potrebbe anche essere utilizzata per calibrare la forza.Per gli esperimenti di rampa di forza, eseguire una scansione di aumento della forza a una velocità di carico di 0,2 piconewton al secondo, seguita da una scansione di diminuzione della forza a meno 0,2 piconewton al secondo. Dopo ogni ciclo di allungamento, tenere la molecola di DNA a un piconewton per 30 secondi, per consentire al DNA a singolo filamento di ripiegarsi in G4. Per gli esperimenti di salto forzato, far scorrere la forza tra 54 piconewton per 30 secondi, sotto i quali un G4 piegato potrebbe essere aperto, e 1 piconewton per 60 secondi permettendo a un G4-15T piegato di ripiegarsi. Infine, analizza la forza di dispiegamento, utilizzando un programma di laboratorio mat scritto internamente.Qui è mostrato un tipico esempio di una curva di aumento e diminuzione della forza di un quadruplex G4 legato. Il salto di estensione nella scansione per l'aumento della forza ha indicato una transizione di G4, a circa 52 piconewton. Tuttavia, in presenza di RHAU, G4 è rimasto piegato durante la scansione di aumento della forza per un massimo di 60 piconewton, indicando la stabilizzazione della forza G4 mediante legame RHAU.In presenza di RHAU e ATP, la distribuzione della forza di dispiegamento di G4 è stata spostata verso una forza inferiore, indicativa di una destabilizzazione di G4 dipendente dall'ATP da parte di RHAU. Tracce rappresentative dell'altezza della perlina durante i cicli di salto forzato, mostrano che la forza applicata alla molecola è stata ciclica tra 54 piconewton per 30 secondi, sotto i quali un G4 piegato poteva essere dispiegato, e 1 piconewton per 60 secondi, sotto il quale poteva ripiegarsi. Il tempo medio di vita di un G4 piegato a 54 piconewton, era di circa 6,4 secondi, stimato adattando l'istogramma del tempo di vita con una funzione di decadimento esponenziale.Quando è stata introdotta l'elicasi RHAU, l'estensione del DNA legato è rimasta a livello piegato per tutto il tempo di mantenimento di 30 secondi a 54 piconewton, indicando che il RHAU stabilizza fortemente G4 contro il dispiegamento meccanico. Dopo l'aggiunta di RHAU e ATP, l'estensione era a livello del DNA a singolo filamento dispiegato, indicando una destabilizzazione di G4. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare le dinamiche di dispiegamento e ripiegamento delle giunzioni ACS nucleari utilizzando queste pinzette magnetiche ultra stabili. L'assegnazione di questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della struttura degli acidi nucleici e delle proteine leganti per esplorare la regressione della stabilità della struttura e la cinetica di ripiegamento, nonché l'interazione dell'acido nucleico e delle proteine leganti.

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Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

In questo articolo si descrivono l'uso di una pinzetta magnetici per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi enzimatica a livello di singola molecola in modo altamente parallelizzabile.

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

Pinzette magnetiche, una potente tecnica di manipolazione singola molecola, possono essere adattati per le misure dirette della torsione (utilizzando una configurazione denominata liberamente orbitante pinzette magnetiche) e coppia (utilizzando una configurazione definita pinzette coppia magnetica) in macromolecole biologiche. Linee guida per l'esecuzione di tali misure sono espresse, comprese le applicazioni allo studio del DNA e associati filamenti nucleo-proteine.

Pinzetta magnetici per la misurazione di Twist and Torque

Le pinzette ottiche sono state utilizzate per studiare il ripiegamento dell'RNA allungando le singole molecole dalle loro estremità 5' e 3'. Qui vengono descritte le procedure comuni per sintetizzare molecole di RNA per la pinzetta, la calibrazione dello strumento e i metodi per manipolare singole molecole.

Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

G4 Resolvase1 lega a strutture G-quadruplex (G4) con ristretti affinità segnalato per una proteina G4 vincolanti e rappresenta la maggioranza dell'attività svolgimento G4-DNA in cellule HeLa. Descriviamo un nuovo protocollo che sfrutta l'affinità e l'attività svolgimento ATP-dipendente di G4-Resolvase1 per purificare specificamente G4R1 ricombinante cataliticamente attivo.

Un approccio G-quadruplex del DNA-affinità per purificazione di enzimaticamente attiva G4 Resolvase1

La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.

Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Qui, descriviamo una configurazione di pinzette magnetiche ad alta velocità che esegue misurazioni nanomeccaniche su biomolecole sensibili alla forza alla velocità massima di 1,2 kHz. Presentiamo la sua applicazione a forcine di DNA e complessi SNARE come sistemi modello, ma sarà applicabile anche ad altre molecole coinvolte in eventi meccanobiologici.

Pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza

Le bis-3-cloropepidine (B-CePs) sono sonde chimiche utili per identificare e caratterizzare le strutture G-quadruplex in modelli di DNA in vitro. Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per eseguire reazioni di sondaggio con B-CeP e per risolvere i prodotti di reazione mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide ad alta risoluzione.

In vitro Mappatura chimica delle strutture del DNA G-quadruplex mediante bis-3-cloroperidine

Questo protocollo dimostra l'utilizzo di pinzette magnetiche a singola molecola per studiare le interazioni tra le proteine telomeriche leganti il DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e i lunghi telomeri estratti da cellule umane. Descrive le fasi preparatorie per i telomeri e i fattori di legame ripetuto telomerico, l'esecuzione di esperimenti su singole molecole e i metodi di raccolta e analisi dei dati.

Analisi delle interazioni proteina-DNA telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola

Questo protocollo delinea un saggio di replicazione del DNA a singola molecola basato su microscopia a fluorescenza, che consente la visualizzazione in tempo reale delle interazioni tra le DNA polimerasi e gli ostacoli come le strutture G-quadruplex.

Visualizzazione a fluorescenza a singola molecola della dinamica della DNA polimerasi ai G-quadruplex

Qui viene presentato un protocollo per esperimenti FRET ad alta precisione a livello di singola molecola. Inoltre, questa metodologia può essere usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante del legame del recettore N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinare le distanze precise è il primo passo verso la costruzione di modelli strutturali basati su esperimenti FRET.

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

Scopri la manipolazione di singole molecole di G-quadruplex con pinzette magnetiche per studiare la stabilità e la regolazione proteica. Questo metodo consente misurazioni stabili della dinamica molecolare nel tempo.

Manipolazione di singola molecola di G-quadruplex di pinzette magnetiche

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