Dispositivo di Imaging dal vivo a lungo termine per una migliore manipolazione sperimentale delle larve di Zebrafish

L'obiettivo generale della fabbricazione di questo dispositivo di imaging è quello di creare una piattaforma modificabile per l'analisi microscopica della guarigione delle ferite nelle larve di pesce zebra vive. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della guarigione delle ferite, come ad esempio qual è il contributo della riorganizzazione delle fibre di collagene e le risposte cellulari alla successiva ricrescita dei tessuti dopo una lesione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la ferita e l'imaging avvengono all'interno di un unico dispositivo, mentre la ricrescita della coda non è ostacolata dal dispositivo.

Inoltre, i molteplici compartimenti funzionali di zWEDGI potrebbero essere modificati in modo indipendente per adattarsi a diversi stadi larvali e a una serie di protocolli sperimentali. Per iniziare, modellare il componente PDMS del dispositivo con le geometrie e gli attributi desiderati in base al protocollo di testo. Dopo aver stampato gli stampi utilizzando una stampante 3D fotopolimerica, pulire gli stampi utilizzando un pennello fine, alcol denaturato in un flacone spray e aria compressa.

Strofinare delicatamente e rimuovere la resina non polimerizzata, in particolare qualsiasi materiale dalle regioni dei microcanali. Quindi, polimerizzare gli stampi in un apparecchio di postpolimerizzazione UV per 60 minuti su ciascun lato, poiché la resina non polimerizzata è tossica per le larve di zebrafish. Utilizzando carta vetrata a grana 200, carteggiare il lato della cavità dello stampo su una superficie piana fino a quando tutte le superfici del soffitto non sono a contatto con la carta vetrata.

Con carta vetrata a grana 400 e 600, carteggiare leggermente progressivamente per produrre superfici lisce e a filo su tutte le facce geometriche dello stampo. Quindi, utilizzare un comparatore per misurare la profondità della cavità dopo la levigatura per verificare che sia vicina alla profondità di progetto. Pulire gli stampi e i dischi di copertura in vetro mettendoli in un pulitore ad ultrasuoni riempito d'acqua per 30 minuti o sciacquandoli sotto l'acqua corrente.

Utilizzare alcol isopropilico e aria compressa filtrata per pulire e asciugare gli stampi e i coperchi. Preparare un banco pulito come luogo in cui fabbricare i dispositivi per ridurre al minimo la contaminazione da detriti presenti nell'aria. Realizzare il PDMS versando la base e l'attivatore in un rapporto di 5:1 in un bicchiere di plastica.

Con un bastoncino di legno mescolate bene per due minuti, mescolando il gel su se stesso come per impastare il pane. Degasare la miscela in un essiccatore sottovuoto per 25-45 minuti fino a quando tutte le bolle sono sparite. Quindi, utilizzando una siringa da 10 millilitri, riempire la cavità di ogni stampo stampato in 3D con circa 0,75 millilitri di PDMS fino a quando lo stampo non trabocca leggermente con un menisco.

Degassare gli stampini pieni per 45 minuti per rimuovere ulteriori bolle che potrebbero essersi formate durante il riempimento. Applicare un disco di copertura in vetro sopra lo stampo riempito con PDMS, premendo il disco verso il basso ad angolo per evitare che le bolle rimangano intrappolate. Consentire l'espulsione del PDMS in eccesso durante l'applicazione del coperchio del disco di vetro.

Quindi, utilizzare un piccolo cricchetto clamp per tenere saldamente il disco di copertura allo stampo. Per l'efficienza, è possibile utilizzare un dispositivo multi-clamp. Polimerizzare il dispositivo PDMS e gli stampi bloccati a 100 gradi Celsius in forno per almeno 90 minuti.

Quindi, togliete gli stampini dal forno e lasciateli raffreddare fino a quando non saranno facilmente maneggiabili. Bloccare lo stampo contenente il dispositivo PDMS polimerizzato in una morsa da banco in modo che le geometrie dello stampo siano rivolte verso l'alto, parallelamente al banco della stazione di lavoro. Iniziare a rimuovere il dispositivo PDMS utilizzando una pinzetta a punta piatta per rilasciare il rubinetto di estrazione PDMS dallo stampo.

Quindi, lavora intorno al perimetro dello stampo con le pinzette. Il PDMS deve essere polimerizzato per almeno 90 minuti a 100 gradi Celsius, altrimenti rimarrà appiccicoso e si attaccherà allo stampo. Una buona indicazione che hai polimerizzato il dispositivo abbastanza a lungo è che vedrai effettivamente una bolla d'aria all'interfaccia tra lo stampo e il dispositivo PDMS, indicando che sarà facilmente rimossa.

Utilizzare aria compressa filtrata e pinzette per sollevare delicatamente il dispositivo dallo stampo tenendolo alla linguetta di estrazione e soffiando aria sotto il dispositivo. Quindi, posizionare il dispositivo PDMS capovolto all'interno del coperchio di un piatto con fondo di vetro in modo che i cunei del tunnel di contenimento tocchino la plastica. Quindi, posizionare il coperchio del piatto con zWEDGI capovolto e il corrispondente piatto con fondo in vetro in un pulitore al plasma con il vetro interno rivolto verso l'alto.

Evacuare la camera di pulizia al plasma fino a quando la pressione raggiunge i 500 millitorr. Impostare la frequenza radio, o potenza RF, su alta ed esporre il dispositivo e la parabola alla frequenza RF per circa due minuti. Quindi, depressurizzare lentamente la camera e rimettere il dispositivo e la capsula in una cappa per camera bianca.

Rimuovere il dispositivo PDMS dal coperchio della lavastoviglie. Quindi, capovolgere il PDMS zWEDGI nell'orientamento corretto sul vetro posizionandolo con cura sul pozzetto centrale del piatto con fondo in vetro. Per garantire l'aderenza del PDMS al vetro, utilizzare l'estremità posteriore delle pinzette per applicare pressione attorno alle minuscole geometrie dei microcanali, levigando il PDMS verso i bordi.

Premere leggermente sul dispositivo PDMS per assicurarsi che le bolle d'aria non rimangano intrappolate sotto il dispositivo. Aggiungere il 70% di etanolo alla piastra e, utilizzando una micropipetta, sciacquare i canali anche attraverso il tunnel di contenimento. Quindi, rimuovere l'etanolo e utilizzare acqua distillata doppia per sciacquare il dispositivo due o tre volte prima di lasciarlo asciugare all'aria.

Riempire i canali con latte scremato e incubare il dispositivo per 10 minuti a temperatura ambiente per ridurre al minimo l'aderenza delle larve al vetrino di vetro della capsula. Quindi, immergere delicatamente il dispositivo più volte in acqua distillata doppia per risciacquare e lasciarlo asciugare all'aria capovolto. Dopo aver anestetizzato le larve secondo il protocollo di testo, utilizzare alcuni microlitri di tricaina E3 per pre-bagnare i canali del dispositivo.

Utilizzando una punta di pipetta a orifizio largo, prelevare una singola larva e depositarla nel canale di caricamento. Quindi, con la punta di una pipetta o uno strumento simile, orientare la larva nella camera di carico con il lato dorsale rivolto verso il bordo più dritto della camera di carico e la coda rivolta verso il tunnel di contenimento. Prelevare con cautela il fluido dalla camera di ferita, permettendo alla larva di fluire nel tunnel di contenimento.

Rimuovere la maggior parte del liquido mantenendo l'umidità intorno alla larva. La larva deve essere correttamente orientata nel tunnel di contenimento poiché la maggior parte del liquido viene rimossa. Ma intorno alle larve deve rimanere abbastanza liquido.

L'orientamento può essere regolato dopo l'aggiunta di agarosio, ma deve essere raggiunto prima che l'agarosio si solidifichi. Pipettare l'agarosio all'1%LMP in tricaina E3 sopra la testa della larva, riempiendo la camera di carico, e lasciare che l'agarosio solidifichi con la larva nella posizione corretta. Aggiungere la tricaina E3 alla camera di ferita secondo necessità per mantenere l'idratazione.

Quindi, ripetere questo processo di caricamento per i due canali rimanenti. Utilizzando un ago per siringa, rimuovere con cura l'agarosio che è filtrato attraverso il tunnel di contenimento nella camera di ferita. Per le ferite, l'imaging a breve termine o l'isolamento del trattamento delle ferite, aggiungere più tricaina E3 sopra l'agarosio.

Per ferire le larve nella camera di ferita, utilizzare una lama di bisturi sterile per sezionare la pinna caudale posteriormente alla notocorda. Se necessario, aggiungere altra tricaina E3 e riposizionare il coperchio della piastra di coltura. Installare il dispositivo zWEDGI con larve anestetizzate su un microscopio invertito in un inserto per tavolino che ospiterà il piatto inferiore in vetro da 60 millimetri.

Individua la coda delle larve nel canale più in alto, ruotando il piatto secondo necessità per ottenere la coda nella posizione desiderata. Immagina la larva come richiesto per l'esperimento specifico. Al termine dell'esperimento, rimuovere la capsula zWEDGI dal microscopio.

Dopo la rimozione delle larve e dell'agar secondo il protocollo di testo, utilizzare etanolo e acqua distillata per pulire lo zWEDGI come dimostrato in precedenza e metterlo a testa in giù per farlo asciugare all'aria. Conservare il dispositivo coperto in un luogo fresco e asciutto. Qui sono mostrate le immagini che utilizzano la microscopia multifotone per la seconda armonica, o l'imaging SHG delle fibre di collagene nella pinna caudale per illustrare le capacità di imaging dello zWEDGI.

Prima della ferita, l'SHG ha rilevato fibre di collagene che si irradiano verso l'esterno dalla notocorda alla punta della pinna. Poco dopo l'ingiuria, la distanza tra la punta della pinna contratta e il centro della pinna aumenta con il rilassamento della ferita. Lo zWEDGI consente la raccolta di dati tridimensionali nel tempo, fornendo una visione più completa dei cambiamenti dinamici che avvengono nella struttura della matrice extracellulare.

La natura 3D della raccolta dei dati consente la ricostruzione spaziale utilizzando software di rendering. Queste ricostruzioni e le successive opzioni di rotazione illustrano che la contrazione e il rilassamento della pinna si verificano non solo nel piano XY della raccolta di immagini, ma anche nell'asse Z, quando la coda si appiattisce dal ricciolo verso l'alto dello stato contratto. Una volta stampati gli stampi riutilizzabili, la tecnica di fabbricazione può essere eseguita in tre o quattro ore.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate nel PDMS prima dell'indurimento e di polimerizzare i dispositivi abbastanza a lungo prima di provare a rimuoverli dagli stampi. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'applicazione localizzata di farmaci, la marcatura degli anticorpi o la purificazione di RNA e proteine per rispondere a ulteriori domande, come l'impatto della presenza di farmaci o inibitori sulla guarigione delle ferite. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della guarigione delle ferite per esplorare la dinamica del collagene, la risposta delle cellule immunitarie e la ricrescita dei tessuti nelle larve di zebrafish.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come fabbricare uno zWEDGI e usarlo per ferire e imaging dal vivo delle larve di zebrafish. Non dimenticare che le resine fotopolimeriche per la stampa 3D sono pericolose per l'uomo e tossiche per il pesce zebra. È necessario prendere precauzioni, come indossare guanti e utilizzare una maschera facciale durante la manipolazione di parti stampate in 3D non polimerizzate e assicurarsi che tutta la resina rimasta sulle stampe sia polimerizzata prima di tentare di riempire gli stampi con PDMS.