Basato su Dendrimero Nanopatterns irregolare alla localmente adesività di superficie di controllo: un metodo per dirigere la differenziazione Chondrogenic

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di ottenere nanopattern irregolari basati su dendrimeri su larga scala che consentano il controllo su scala nanometrica dell'adesività superficiale locale. Il metodo descritto viene applicato per lo studio dell'adesione cellulare e del differenziamento condrogenico. I nanopattern in rilievo con dendrimeri consentono di controllare localmente l'adesività superficiale su scala nanometrica.

I polinanomeri di prima generazione modificati con il peptide RGD adesivo cellulare vengono utilizzati per creare nanopattern. Sono caratterizzati da tecniche di scansione al microscopio e utilizzati negli studi di adesione e differenziazione cellulare. Analizziamo quindi i risultati delle tecniche di microscopia e immunocolorazione.

Il primo passo è preparare i substrati di lavoro. I vetrini quadrati in vetro personalizzati sono prodotti tagliando i vetrini per microscopia con una fresa con punta diamantata. Crea diapositive di dimensioni 1,25 per 1,25 centimetri.

Lavare i vetrini con acqua deionizzata, seguita da etanolo al 96% e lasciarli asciugare all'aria. Preparare la soluzione di PLLA al 2% aggiungendo 200 milligrammi di PLLA a un tubo a pressione e aggiungere 10 millilitri di diossano. Aggiungere una barra di agitazione e chiudere bene il tubo.

Scaldare il composto in un bagno di glicerina a 60 gradi centigradi per 24 ore mescolando delicatamente. Posizionare i vetrini in un flaconcino di vetro contenente la soluzione di PLLA su una piastra calda e pulita a 60 gradi centigradi. Attendere almeno 10 minuti per raggiungere la temperatura necessaria.

Centrifugare i substrati di vetro con la soluzione PLLA posizionando il vetrino sul tavolino di centrifuga ed eseguendo il programma selezionato. Selezioniamo 3.000 giri/min per 30 secondi con un'accelerazione di 1.500 giri/min al secondo con un pre-step di 500 giri/min a cinque secondi a 300 giri/min al secondo per garantire un rivestimento omogeneo. I bicchieri rivestiti possono essere conservati in frigorifero.

Preparare e sonicare per 10 minuti la soluzione A, una soluzione di 0,77 milligrammi per millilitro di dendrimero RGD-Cys-D1 in acqua deionizzata. Quindi preparare soluzioni dendrimeriche rispettivamente da 10 al 2% e da 10 al 5% B e C in acqua deionizzata. Sonicare la soluzione C per 10 minuti e preparare le seguenti soluzioni dendrimeri, D, E e F anche in acqua deionizzata.

Soluzione D, 2,5x10 all'8%soluzione E, 10 all'8% e soluzione F, 4 10 al 9%Conservare queste soluzioni in frigorifero fino all'uso. Si laurea con una lampada UV della cabina di coltura cellulare 18 vetri rivestiti in PLLA per 13 minuti per renderli sterili. Sonicare ciascuna delle soluzioni dendrimeri per 10 minuti.

Filtrare le soluzioni dendrimeri attraverso filtri di 0,22 micrometri di diametro sui vetrini rivestiti in PLLA in una piastra a 12 pozzetti sotto il flusso laminare della cabina di coltura cellulare. Lasciarli all'interno della cabina a temperatura ambiente per 16 ore e lavarli con acqua sterile e deionizzata. Per i campioni di controllo positivi, preparare una soluzione sterile di fibronectina in PBS e incubare le repliche con la soluzione per un'ora a temperatura ambiente nella cabina di coltura cellulare.

Lavali con PBS. I restanti tre substrati rivestiti di PLLA serviranno come repliche per il controllo negativo. La topografia dei nanopattern viene analizzata con AFM operato in modalità tapping in aria.

Monta un cantilever in silicio con una costante elastica di 40 newton per metro e una frequenza di risonanza di 300 kilohertz nel supporto della punta AFM. Con il substrato nanopattern sullo stadio AFM, avvicinarsi alla superficie fino al contatto e scegliere un punto di regolazione dell'ampiezza che consenta di visualizzare la configurazione del dendrimero senza esercitare una pressione eccessiva sulla superficie. Registrare almeno tre immagini rappresentative di 5x5 micrometri per substrato di tre substrati indipendenti per condizione.

Tratta le immagini acquisite con il software di elaborazione AFM. Selezionare i dendrimeri sulle immagini di altezza AFM elaborate e ottenere le soglie dell'immagine corrispondenti. Ottieni le precisioni delle particelle e usale per ottenere le distanze minime tra le particelle.

Sia le distanze minime tra le particelle in Z le corrispondenti precisioni delle particelle per ottenere i tappi di controllo della probabilità per le distanze minime tra le particelle. Regola la scala dei colori del grafico per visualizzare le regioni in cui la densità superficiale RGD locale è inferiore a 70 nanometri. Quantifica l'area di queste regioni selezionandole sull'immagine e generando una soglia.

Utilizzare adiposo umano commerciale derivato da cellule staminali mesenchimali provenienti da passaggi precoci, preferibilmente sotto i cinque. Coltivarli a 37 gradi e 4,6% di CO2 nell'atmosfera del terreno di crescita delle cellule staminali fino a raggiungere il 70 o l'80% di confluenza. Seminare le cellule a una densità cellulare di 3.000 cellule per centimetro quadrato sui substrati in un mezzo che induce la condrogenesi.

Cambia il mezzo ogni tre giorni. La fase di condensazione può essere osservata fin dal primo giorno di coltura e la loro evoluzione può essere seguita da un microscopio ottico a contrasto di fase durante tutti i laboratori di coltura. Fissare le celle con una soluzione di formalina al 10% a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi lavare con PBS.

Bloccare i gruppi furaldeidici aggiungendo una soluzione di 50 millimolari di cloruro di ammonio in PBS. Lasciare agire per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare con PBS.

Permeabilizzare le cellule con una soluzione allo 0,1% di saponina nella soluzione bloccante all'1% di albumina in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Incubare con gli anticorpi primari nella soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Lavare con PBS.

Incubare con gli anticorpi secondari nella soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente, evitando l'esposizione alla luce. Lavare con PBS e asciugare. Applicare il terreno di montaggio per microscopia sui campioni e coprirli delicatamente con vetrini.

Visualizzare i campioni immunocolorati per la proteina di adesione focale paxillina dopo un giorno di induzione condrogenica e per il marcatore condrogenico precoce, il collagene II alfa I, dopo cinque giorni di induzione condrogenica utilizzando un microscopio confocale verticale. Raccogli le sezioni a un intervallo rappresentativo, ad esempio 0,5 o 1 micrometri. Filtrare le immagini colorate per la paxillina dalla zona basale dei condensati cellulari.

Rimuovi lo sfondo, leviga e converti in file a otto bit. Rendili binari impostando una soglia selezionata empiricamente. Trattare un minimo di tre condensati di celle per condizione di tre campioni indipendenti.

Quantifica le aree selezionate ed esprimile come la percentuale corrispondente di area divisa per il numero di nuclei cellulari nell'immagine. Per quantificare la colorazione del collagene II alfa I, creare proiezioni Z confocali. Filtra le immagini risultanti, rimuovi lo sfondo, leviga e imposta una soglia.

Quantificare la somma dell'area proiettata dell'area massima di collagene II alfa I per campione rispetto all'area del condensato cellulare corrispondente. Diverse configurazioni di nanopattern possono essere ottenute modificando la concentrazione iniziale di dendrimeri in soluzione. I nanopattern possono essere visualizzati dall'analisi AFM e dai grafici di contorno di probabilità per la distanza minima tra le particelle costruita.

Evidenziano le regioni sulla superficie con la più alta densità superficiale RGD locale. I nanopattern dendrimeri sono utilizzati negli studi di adesione cellulare. L'adesione aumenta con la densità superficiale locale dell'RGD.

Per il controllo positivo e le superfici contenenti aggregati dendrimeri, questa correlazione viene persa. L'influenza della densità superficiale locale dell'RGD è stata testata nella condrogenesi, sia la condensazione cellulare che la differenziazione sono favorite da nanopattern che presentano un'adesività intermedia. In conclusione, nanopattern basato su dendrimeri in un metodo a tre tabelle per affrontare l'effetto della densità locale di RGD sulla risposta cellulare.

I nanopattern sostengono l'adesione cellulare in modo più efficiente sulla corrispondente superficie omogenea comunemente utilizzata nelle colture cellulari. Negli esperimenti di differenziamento, l'adesività intermedia delle cellule al substrato ha favorito la condensazione cellulare mesenchimale e la differenziazione cronigenica precoce. A causa della facile modifica della crescita periferica dei dendrimeri, il metodo qui descritto può essere ulteriormente esteso a tutti gli strati reumatici eccessivi che hanno effetti di densità sulle cellule.