In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale
29 settembre 2017
Qui, presentiamo un protocollo per descrivere una tecnica di amplificazione del prion semplice, veloce ed efficiente, il metodo di conversione indotta da tremare in tempo reale (RT-QuIC).
L'obiettivo generale di questo protocollo per il saggio di conversione indotta dal terremoto in tempo reale è quello di consentire il rilevamento sensibile dei prioni della malattia del dimagrimento cronico nei campioni fecali dei cervidi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulla CWD, come ad esempio quando vengono infettati i prioni della CWD nei cervidi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è specifica, sensibile e consente un'elevata produttività dei campioni.
A dimostrare la procedura sarà Ginny Cheng, un tecnico di laboratorio del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, aggiungere un grammo di materiale fecale a una provetta contenente 10 millilitri di tampone per l'estratto delle feci. Utilizzando un dissociatore con un programma preimpostato per le proteine, omogeneizzare i pellet fecali per un minuto a temperatura ambiente.
Ripetere l'operazione due o tre volte fino a quando i campioni fecali non sono completamente omogeneizzati. Quindi utilizzare il parafilm per sigillare le provette e posizionarle su una piattaforma a dondolo o su un agitatore rotante per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, centrifugare a 18.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Raccogliere i surnatanti e aliquotarli in provette da 1,5 millilitri. Conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Per iniziare il metodo di precipitazione dell'acido fosfotungstico di sodio, aggiungere 250 microlitri di sarkosil a un millilitro di estratto di proteine fecali.
Utilizzando il parafilm, sigillare il tubo. Posizionare la provetta in un miscelatore termico e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti agitando costantemente a 1.400 giri/min. Successivamente, aggiungere una soluzione madre contenente il 10% di acido fosfotungstico di sodio e 170 millimolari di cloruro di magnesio in modo tale che la concentrazione finale di acido fosfotungstico di sodio nei campioni sia del 3%Trasferire i campioni nel miscelatore termico e incubare a 37 gradi Celsius per due ore agitando costantemente a 400 giri/min.
Quindi, centrifugare a 15, 800 g per 30 minuti a 14 gradi Celsius. Rimuovere con cura i surnatanti e lavare i pellet rispendendoli nel tampone di lavaggio. Quindi centrifugare a 15, 800 g per 15 minuti a 14 gradi Celsius.
Rimuovere con cura i surnatanti e risospendere i pellet in 100 microlitri di tampone di diluizione RT-QuIC. Conservare i campioni trattati a meno 20 gradi Celsius fino al momento di eseguire il test RT-QuIC. Per iniziare, aggiungere 0,032 grammi di tioflavina T a 10 millilitri di acqua distillata doppia per preparare una soluzione madre fresca di tioflavina T da 10 millimolari.
Successivamente, utilizzare acqua distillata doppia per effettuare una diluizione da uno a 10 della soluzione madre con conseguente concentrazione finale di un millimolare di tioflavina T. Utilizzando una siringa dotata di un filtro a disco Acro da 0,2 micrometri, filtrare la soluzione di un millimolare di tioflavina T. Quindi scongelare il substrato della proteina prionica più ricombinante. Caricare 500 microlitri di substrato di proteina prionica ricombinante alla volta in microprovette con filtro di esclusione Dalton da 100 kilo.
Centrifugare a 14.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire il substrato eluito in una provetta sterile da 1,5 millilitri. Conservare a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.
Quindi, scongelare il tampone di diluizione RT-QuIC immagazzinato. Diluire il seme e preparare le soluzioni madre e la miscela di reazione RT-QuIC come indicato nel protocollo di testo. Utilizzando una pipetta con puntale filtrante, miscelare la miscela di reazione pipettando su e giù.
Versare la miscela in un serbatoio di pipettaggio da 50 millilitri. Utilizzando una pipetta multicanale, caricare 98 microlitri di miscela di reazione RT-QuIC in ciascun pozzetto di una piastra di fondo ottica a 96 pozzetti. Ad ogni reazione, aggiungere due microlitri di estratto proteico fecale non diluito o diluito in serie 10 volte.
Quindi utilizzare del nastro sigillante per sigillare la piastra. Incubare in un lettore di piastre a 42 gradi Celsius per 25 ore con cicli ripetuti di un minuto di doppio agitamento orbitale a 700 giri/min e un minuto di riposo durante l'incubazione. Nel frattempo, definire le impostazioni di misurazione della fluorescenza come indicato nel protocollo di testo.
Trascorse 25 ore, rimuovere la lastra dal lettore di piastre. Centrifugare la piastra a 3.000 g per tre minuti per evitare potenziali contaminazioni tra i pozzetti. Quindi, rimuovere il sigillo dalla piastra.
Preparare una nuova piastra aggiungendo 90 microlitri di miscela di reazione RT-QuIC contenente substrato fresco e colorante a fluorescenza Tioflavina T fresca. Trasferire 10 microlitri da ciascun pozzetto della prima piastra alla piastra a 96 pozzetti appena preparata. Utilizzare del nastro sigillante per sigillare la nuova piastra.
Dopo aver definito le impostazioni di misurazione della fluorescenza, continuare il test per altre 50 ore. Leggere e documentare il segnale di fluorescenza della tioflavina T per ciascun pozzetto ogni 15 minuti. Quindi raccogli e traccia i dati come descritto nel protocollo di testo.
In questo studio, il materiale fecale di alce o cervo mulo non infetto viene omogeneizzato in un tampone di estratto di feci per ottenere una concentrazione finale del campione del 10%Alcuni omogeneizzati vengono quindi elaborati e concentrati 10 volte mediante precipitazione di acido fosfotungstico di sodio. Mentre una riduzione delle conversioni spontanee è stata osservata nei campioni purificati, tutti i campioni hanno mostrato bassi segnali di fluorescenza nei campioni fecali positivi alla CWD. Per migliorare l'amplificazione dei prioni e aumentare la sensibilità di rilevamento, è incorporata una fase di sostituzione del substrato.
I campioni sottoposti a sostituzione del substrato come parte del protocollo RT-QuIC mostrano un aumento della sensibilità e della specificità del rilevamento, con 14 dei 18 campioni positivi e nessuno dei controlli negativi registrato come falso positivo. Una volta padroneggiato, la preparazione dell'estratto fecale e la concentrazione di PRP/SCRP possono essere eseguite in circa quattro ore e il test RT-QuIC può essere impostato in circa 1/1-2 ore se eseguito correttamente. Durante il tentativo della procedura, è importante ricordarsi di filtrare il substrato ma di non farlo mai vorticare.
Dopo la procedura, altri metodi come il western blotting possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come la resistenza delle proteasi ai prodotti risultanti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada agli scienziati nel campo della ricerca sui prioni per esplorare la presenza di prioni negli animali vivi testando campioni fecali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e concentrare PRP/SCRP da estratti fecali e come eseguire un test RT-QuIC modificato per ottenere la rilevazione di prioni sensibili e specifici.
Non dimenticare che lavorare con i prioni può essere estremamente pericoloso e che è importante indossare DPI adeguati e lavorare sotto una cabina di biosicurezza durante l'esecuzione della procedura.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per il metodo di conversione indotta da scuotimento in tempo reale (RT-QuIC), una tecnica sensibile per la rilevazione di prioni della malattia da wasting cronica in campioni fecali di cervidi. Il metodo è progettato per rispondere a domande fondamentali riguardo la presenza di prioni CWD nelle feci.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sulle malattie da prioni
- Salute animale
Sfondo
- La malattia cronica da wasting (CWD) colpisce i cervidi e pone significative preoccupazioni ecologiche.
- Il rilevamento dei prioni in campioni fecali è fondamentale per comprendere la trasmissione della malattia.
- RT-QuIC è un metodo innovativo che aumenta la sensibilità e la specificità nel rilevamento dei prioni.
- La tecnica consente un'analisi ad alto rendimento dei campioni.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo affidabile per la rilevazione di prioni del CWD nelle feci.
- Facilitare la ricerca sui tempi di eliminazione dei prioni nei cervidi infetti.
- Migliorare la comprensione della dinamica del CWD nelle popolazioni selvatiche.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di campioni fecali utilizzando un tampone per l'estrazione delle feci.
- Omotermizzazione dei pellet fecali con un dissociatore.
- Applicazione del saggio RT-QuIC per il rilevamento dei prioni.
- Dimostrazione della procedura da parte di un tecnico di laboratorio qualificato.
Risultati principali
- Il metodo RT-QuIC rileva con successo i prioni del CWD nei campioni fecali.
- Il protocollo è efficiente e consente l'analisi di più campioni contemporaneamente.
- I risultati indicano che è possibile determinare il momento della presenza dei prioni nelle feci.
- Il metodo mostra un'elevata specificità e sensibilità rispetto alle tecniche tradizionali.
Conclusioni
- RT-QuIC è uno strumento prezioso per la ricerca e il monitoraggio della CWD.
- Il protocollo può migliorare la comprensione della dinamica dei prioni nei cervidi.
- Studi futuri possono basarsi su questo metodo per esplorare le vie di trasmissione dei prioni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Management
Il rilevamento dell'eliminazione di prioni nel materiale fecale consente un monitoraggio non invasivo della malattia da wasting cronico nelle popolazioni selvatiche, sostenendo strategie di intervento precoce. Il saggio RT-QuIC fornisce un metodo ad alto rendimento, specifico e sensibile per identificare l'attività di semina dei prioni, elemento fondamentale per comprendere la dinamica della trasmissione e orientare le decisioni di gestione della malattia. Questo approccio riduce la dipendenza da campionamenti invasivi e migliora la scalabilità per programmi di monitoraggio su larga scala in ambito di ricerca e sanità animale selvatica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'attività di semina dei prioni come biomarcatore della presenza della malattia nelle fasi precliniche e cliniche.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale dei metodi di rilevamento dei prioni mediante matrici campionarie non invasive.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative di fluorescenza mediante Thioflavin T per monitorare in tempo reale la formazione di amiloidi.
- Valore operativo: Facilita la standardizzazione del saggio attraverso una preparazione campione standardizzata, inclusa l'omogeneizzazione con detergenti e la precipitazione con acido fosfotungstico.
- Valore scientifico: Migliora la sensibilità e la specificità mediante la sostituzione del substrato, riducendo il rumore di fondo e potenziando il rilevamento dei veri positivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce un sistema rilevante per lo studio della cinetica di rilascio dei prioni nei cervidi, supportando l'allineamento traslazionale dei biomarcatori.
- Valore operativo: Consente campionamenti longitudinali per monitorare l'insorgenza e la persistenza dei prioni nelle feci durante le diverse fasi della malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica delle ipotesi nella fase iniziale della scoperta alla prontezza del saggio per applicazioni di screening, in particolare quando è richiesta la rilevazione non invasiva di biomarcatori.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo al momento e alla frequenza dell'eliminazione di prioni negli animali infetti.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso passaggi riproducibili di concentrazione e purificazione del campione che riducono al minimo gli inibitori.
- Analisi: Produce segnali quantitativi di fluorescenza della tioflavina T che permettono il confronto dell'attività di semina tra campioni e condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica consentendo il rilevamento negli animali vivi, facilitando studi longitudinali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per il rilevamento dei prioni, adattabile a diversi tipi di campioni e specie previa opportuna validazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella rilevazione dei prioni riducendo i falsi negativi mediante la rimozione di inibitori e il potenziamento del segnale.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità grazie a protocolli standardizzati per l'elaborazione di campioni fecali e il rilevamento su piastre a 96 pozzetti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione nei programmi di sorveglianza fornendo una capacità di rilevamento affidabile in fase precoce.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione della ricerca adeguata al rischio in base ai modelli di eliminazione dei prioni nelle popolazioni bersaglio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella manipolazione dei prioni, nell'applicazione delle pratiche di biosicurezza di livello 2+ e nell'interpretazione di saggi basati sulla fluorescenza.
- Presuppone l'accesso a lettori di piastre dotati di agitazione e controllo della temperatura, centrifughe e filtri a esclusione dimensionale.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la raccolta dei campioni, lo stoccaggio (-80°C) e il pretrattamento, al fine di garantire coerenza.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse matrici fecali, che potrebbero richiedere un'ottimizzazione della composizione del buffer e delle condizioni di precipitazione.
- Comprende limitazioni pratiche, come la variabilità potenziale del carico di inibitori tra i campioni, che richiede una validazione empirica dei passaggi di purificazione.
