Purificazione di DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di purificare il DNA del virus Herpes Simplex di tipo uno da cellule infette per l'analisi proteomica delle proteine associate al genoma virale. Questo metodo fornisce informazioni chiave sul coinvolgimento dei fattori cellulari e sull'infezione da virus dell'herpes. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere adattata per purificare direttamente diverse popolazioni di DNA virale da cellule infette, consentendo l'analisi di molteplici aspetti dell'infezione.

Iniziare questa procedura con la coltura di cinque cellule MRC come descritto nel protocollo di testo. Quindi, diluire HSV-1 in soluzione salina tris-tamponata a freddo o TBS. Per i passaggi successivi, è importante spegnere il soffiatore e la cappa di coltura tissutale per evitare che le cellule si secchino.

Utilizzare una pipetta per trasferire il terreno di coltura dalle cellule MRC 5 a un flacone sterile da aggiungere nuovamente alle cellule dopo l'infezione. Infettare le cellule aggiungendo sette millilitri di virus diluito alle cellule. Scuotere le celle ogni 10 minuti per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo l'assorbimento, aspirare l'innoculum, sciacquare le cellule con 50 millilitri di TBS a temperatura ambiente e sostituire il terreno di coltura originale. Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius in presenza del 5% di anidride carbonica. Dopo l'inizio della replicazione del DNA virale, circa quattro ore dopo l'infezione, etichettare il DNA virale replicante.

Per fare ciò, diluire l'EdC in un millilitro di terreno di crescita e aggiungerlo al terreno di coltura cellulare delle cellule infette per due o quattro ore. Per raccogliere i nuclei, sostituire il terreno di coltura con 20 millilitri di tampone di estrazione dei nuclei e incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius con oscillazione occasionale. Dopo l'incubazione, raschiare i nuclei dalla piastra utilizzando un raschietto cellulare e trasferirli in una provetta conica da 50 millilitri su ghiaccio.

Centrifugare per 10 minuti a 2, 500 x g e quattro gradi Celsius per pellettare i nuclei. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante. Staccare delicatamente il pellet nucleare in 10 millilitri di soluzione salina tampone fosfato o PBS e trasferirlo in una provetta conica da 50 millilitri.

Quindi, centrifugare il campione come prima. Dopo aver rimosso completamente il PBS, risospendere il pellet nucleare in 10 millilitri di miscela di reazione a scatto, pipettando delicatamente su e giù cinque volte con una pipetta da 10 millilitri. Ruotare il campione per un'ora a quattro gradi Celsius, prima di pellettare i nuclei come prima.

Rimuovere completamente la miscela a reazione rapida, quindi lavare il pellet rimettendolo delicatamente in 10 millilitri di PBS e centrifugando nuovamente. Ora, risospendere con cura il pellet nucleare in un millilitro di PBS e trasferire la soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Dopo la centrifugazione, rimuovere completamente il PBS e congelare il pellet in azoto liquido.

A questo punto, il pellet può essere conservato a 80 gradi Celsius oppure la procedura può essere continuata. Per lisare i nuclei e frammentare il DNA, risospendere i nuclei scongelati in 500 microlitri di tampone B1 pipettando su e giù. Incubare la sospensione con ghiaccio per 45 minuti.

Quindi, sonicare i campioni sei volte per 30 secondi ciascuno al 40% di ampiezza, utilizzando una sonda a micropunta da tre millimetri. Posizionare i campioni sul ghiaccio per almeno 30 secondi tra gli impulsi. Dopo la sonicazione, i campioni dovrebbero apparire limpidi, non torbidi.

Pellettare i detriti cellulari centrifugando a 14.000 x G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. La dimensione del pellet dovrebbe diminuire notevolmente, filtrare il surnatante attraverso un filtro cellulare da 100 micron e trattenere il flusso. Quindi, aggiungere 500 microlitri di Buffer B2 al surnatante filtrato.

Per legare il DNA biotinilato alle perle rivestite di streptavidina, preparare le perle magnetiche di streptavidina trasferendo 300 microlitri di impasto liquido di perle in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Preparare un tubo di perline per campione. Lavare le perle tre volte con millilitro di Buffer B2 vorticando per ri-suspendare, applicandole a un magnete per separare le perle e aspirando il tampone di lavaggio.

Quindi, aggiungere 900 microlitri di campione alle perle lavate. Il resto del campione sarà utilizzato per l'isolamento del DNA e delle proteine. Ruotare la sospensione durante la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, posizionare i campioni in un rack magnetico per provette a microfusibile e rimuovere il surnatante. Risospendere delicatamente le perle in un millilitro di Buffer B2, prima di ruotare a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere nuovamente il surnatante utilizzando il portaprovette magnetico per microfuge.

Questa volta, risospendere delicatamente le perle in un millilitro di Buffer B3 e ruotarle a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante dalla miscela di perle utilizzando il magnete, risospendere le perle in 50 microlitri di tampone campione 2x Laemmli per alludere ai complessi proteici del DNA. Quindi, far bollire i campioni a 95 gradi Celsius per 15 minuti.

Agitare una miscela prima di far girare rapidamente i campioni in una microfuga. Applicare i campioni al magnete e trasferire l'assegnazione su un nuovo tubo. Infine, congelare i campioni e conservarli a 80 gradi Celsius.

Eseguire l'analisi delle proteine come descritto nel protocollo di testo. La marcatura EdC è stata effettuata per zero, 20, 40 o 60 minuti, seguita dalla purificazione del DNA virale e delle proteine associate. Le proteine eluite sono state sottoposte a colorazione blu coomassie e western blotting con l'anticorpo specifico per le proteine leganti il DNA virale, ICP4 e UL42.

La freccia indica la streptavidina che è stata rimossa dalle perle durante l'eluizione, che è presente in tutte le condizioni. Le proteine isolate con questo metodo sono poi sottoposte a spettrometria di massa. Il grafico a torta illustra il numero di proteine in ciascuna categoria funzionale che sono risultate associate al tipo di virus Herpes Simplex sui genomi a sei ore dall'infezione.

Uno sguardo più approfondito alle interazioni proteina-proteina tra le proteine identificate è stato effettuato utilizzando il database della rete di associazione proteica funzionale a stringa. I risultati rivelano sottocomplessi di proteine che funzionano insieme nello stesso processo biologico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare il DNA virale dalle cellule infette per l'indagine proteomica delle proteine associate al genoma virale.

Questa tecnica può essere completata in tre o quattro giorni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prendere precauzioni per prevenire la contaminazione da DNAsi o proteasi dei campioni. Oltre a questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunofluorescenza per verificare la natura del DNA virale marcato con EdC.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della virologia dell'herpes, per esplorare le funzioni delle proteine dell'ospite e dell'infezione virale.