Basato su chip tridimensionale coltura cellulare in perfuso Micro-bioreattori

Ciao, sono Eric Gottwald e sono ricercatore scientifico presso l'Istituto per le Interfacce Biologiche del Ware Institute of Technology. Oggi vorrei presentarvi il nostro sistema microbiorattivo perfuso basato su chip. Prima di poter utilizzare il chip in applicazioni di coltura cellulare, dobbiamo idrolizzare il polimero e rimuovere la zona microstrutturata.

Questo si ottiene immergendo semplicemente il chip in diverse concentrazioni di isopropanolo, iniziando dal 100%. Il chip viene immerso per pochi secondi in ciascuna concentrazione e l'ultimo passaggio prevede soltanto acqua. Successivamente, il chip viene essiccato e, infine, deve essere rivestito con una soluzione di collagene tipo I per favorire l'adesione delle cellule al polimero. Questo passaggio viene effettuato depositando alcune gocce di una soluzione di collagene tipo I sulla zona microstrutturata, e in questo stato il chip viene incubato a quattro gradi Celsius per tutta la notte.

Dopo l'incubazione notturna con la soluzione di collagene uno, la soluzione viene rimossa e il chip viene lavato con PBS sterile. Successivamente, anche il PBS viene rimosso e il chip è ora pronto per l'inoculo delle cellule. Ora inoculeremo il chip cellulare con una sospensione di cellule singole, aggiungendo semplicemente 150 microlitri di sospensione cellulare sulla zona microstrutturata. Dopo il deposito delle cellule, il chip viene incubato per tre ore a 37 gradi in un incubatore.

Dopo il periodo di incubazione di tre ore, il chip viene rimosso dall'incubatore ed è ora pronto per l'inserimento nell'ector. A tale scopo, l'ector viene prelevato dalla sua confezione sterile e la sterilità viene garantita mediante irradiazione gamma della pellicola trasparente. Pertanto, dobbiamo semplicemente aprire la confezione ed estrarre l'ector.

Ciò che faremo ora è inserire la parte superiore della bottiglia in questo serbatoio di mezzo, in modo da poter smontare l'alloggiamento del biorreattore per l'inserimento del chip. Dopo aver aperto l'alloggiamento del biorreattore, possiamo inserire il chip, posizionandolo semplicemente nella scanalatura dell'alloggiamento; a questo punto il biorreattore può essere rimontato. L'ultima cosa che dobbiamo fare è collegare due filtri sterili al serbatoio del mezzo e una presa di campionamento sterile.

Per la misurazione della tensione reale di ossigeno nel circuito chiuso, inseriremo due sensori di ossigeno montandoli semplicemente tra questi due connettori. Il bactor è ora pronto per essere riempito con il mezzo di coltura. Il sistema bactor è ora pronto per essere riempito con il mezzo di coltura cellulare, operazione che si ottiene semplicemente collegando il circuito chiuso alla pompa a rulli.

In questo modo, ridurremo contemporaneamente l'intera circolazione del bactor. Come potete vedere qui nella finestra di Ector, si osserva il mezzo salire dal basso sempre più in alto, fino a fuoriuscire dal bactor nella parte superiore. Prima di posizionare il sistema Bactor nell'incubatore, verifichiamo il riempimento senza bolle del circuito di circolazione.

Ora il sistema è completamente riempito con mezzo di coltura cellulare e possiamo trasferire il bioreattore nell'incubatrice. Ora posizioneremo il bioreattore nella camera di incubazione. A tale scopo, innanzitutto il bioreattore viene collegato alla pompa peristaltica, come avete già visto poco fa, e ora il bioreattore viene perfuso attivamente con questo mezzo dalla bottiglia.

E per mantenere la concentrazione ambientale di ossigeno, colleghiamo il serbatoio del mezzo alla fornitura di gas. Infine, collegheremo due sensori di ossigeno al circuito per monitorare in tempo reale la tensione di ossigeno nel sistema. Ora l'allestimento è completo e può funzionare per tutto il tempo previsto per l'esperimento.

Uno degli strumenti più potenti durante l'analisi delle funzioni organotipiche delle cellule all'interno dei contenitori MicroCon è il microscopio a scansione laser, che potete vedere qui. Il microscopio a scansione laser ci offre la possibilità di osservare all'interno di ciascun contenitore MicroCon senza causarne la distruzione. E poiché i contenitori MicroCon o il chip possono essere utilizzati con metodi convenzionali di colorazione immunoistochimica e immunofluorescenza, siamo in grado di rilevare ogni tipo di marcatore e di funzioni organotipiche all'interno dei microcontenitori.

Come si può vedere nell'animazione di questo chip, il fondo è completamente riempito di cellule, così come le pareti del contenitore MicroCon. Abbiamo un'ampia quantità di cellule molto vitali e un numero molto, molto ridotto di cellule morte. L'immagine successiva mostra che siamo in grado di rilevare ogni tipo di funzione organotipica all'interno del contenitore MicroCon.

Ad esempio, per gli epatociti, la produzione di albumina o l'espressione dell'E potrebbe essere osservata nelle cellule, come si vede chiaramente qui nell'immagine sovrapposta. I nuclei sono colorati in blu. L'eco presente è colorato in verde, e l'albumina è espressa o colorata in rosso.

E, come potete vedere chiaramente qui, tutte le funzioni organotipiche che ci si aspetta dagli epatociti sono ben espresse in questo tipo di coltura 3D. Inoltre, abbiamo analizzato un altro marcatore degli epatociti, la citocheratina 18, e questa immagine mostra che anche la citocheratina 18 è ben espressa in questo tipo di colture. Ciò speriamo vi convinca che questo tipo di funzioni organotipiche potrebbe essere utile anche per altre colture organotipiche.

Al termine dell'esperimento Biore, il chip può essere utilizzato per l'isolamento di ogni tipo di componente cellulare, come ad esempio l'RNA totale. Come potete vedere qui, vi mostriamo l'RNA totale prelevato, isolato dal sistema del biorreattore. Questo RNA totale può poi essere utilizzato per applicazioni a valle, come ad esempio la PCR in tempo reale o, come si vede qui, l'analisi con microarray.

Inoltre, è possibile isolare cellule integre dal sistema e utilizzare tali cellule per analisi convenzionali mediante citometria a flusso. Come potete vedere qui, spero di avervi dimostrato che il sistema potrebbe rivelarsi utile per ogni tipo di applicazione in cui siano necessarie reazioni organotipiche e che il sistema potrebbe essere utile anche per tutti quei tipi di applicazioni che finora non abbiamo preso in considerazione, come ad esempio le applicazioni nel campo delle cellule staminali.