Basato su chip tridimensionale coltura cellulare in perfuso Micro-bioreattori

Ciao, sono Eric Gottwald e sono ricercatore presso l'Institute for Biological Interfaces del Ware Institute of Technology. E oggi vorrei presentarvi il nostro sistema microbioattivo perfuso basato su chip. Prima di poter utilizzare il chip nelle applicazioni di coltura cellulare, dobbiamo idrolizzare il polimero e declassare l'area microstrutturata.

Ciò si ottiene semplicemente immergendo il chip in diverse concentrazioni di isopropanolo, iniziando con il 100%Sto immergendo il chip solo pochi secondi in ogni concentrazione e il passaggio finale è solo acqua. Successivamente, il chip viene essiccato e infine dobbiamo rivestire il chip con un collagene, una soluzione per facilitare l'adesione delle cellule al polimero. Questo viene fatto gocciolando solo poche gocce di collagene, una soluzione sopra l'area microstrutturata, e in questo stato, il chip viene incubato a quattro gradi Celsius durante la notte.

Dopo l'incubazione notturna con la soluzione di collagene uno, la soluzione viene rimossa e il chip viene lavato con PBS sterile. Successivamente, inoltre, il PBS viene rimosso e il chip è ora pronto per l'inoculazione delle cellule. Ora inoculeremo la nave cellulare con una sospensione di singole cellule, e questo viene fatto semplicemente mettendo 150 microlitri di sospensione cellulare sopra l'area microstrutturata. Dopo la deposizione delle cellule, il chip viene incubato per tre ore a 37 gradi in un incubatore.

Dopo il periodo di incubazione di tre ore, il chip viene rimosso dall'incubatore ed è ora pronto per l'inserimento nell'ettore. Per questo, l'ector viene estratto dalla sua confezione sterile e la sterilità viene ottenuta mediante irradiazione gamma di questa pellicola trasparente. Quindi non ci resta che aprire la confezione e rimuovere l'ettore.

Quello che faremo dopo è inserire la parte superiore della bottiglia in questo serbatoio del mezzo in modo da poter smontare l'alloggiamento del bioreattore per l'inserimento del chip. Dopo aver aperto l'alloggiamento del bioreattore, ora possiamo inserire il chip, che si ottiene semplicemente posizionando il chip nella scanalatura dell'alloggiamento del bioreattore e il bactor può ora essere assemblato di nuovo. Quello che dobbiamo fare infine è collegare filtri sterili al serbatoio del mezzo e una porta di campionamento sterile.

Per la misurazione della tensione effettiva di ossigeno nel circuito di circolazione chiuso, inseriremo due sensori di ossigeno semplicemente montandoli tra questi due connettori. Il bactor è ora pronto per essere riempito con terreno di coltura. Il sistema bactor è ora pronto per essere riempito con terreno di coltura cellulare, e ciò si ottiene semplicemente collegando il circuito di circolazione chiuso alla pompa a rulli.

In questo modo, declasseremo contemporaneamente l'intera circolazione del ballatore. Come potete vedere qui nella finestra di Ector, potete vedere il medium che sale dal basso salendo e salendo, e lasciando il bactor in cima. Prima di posizionare il sistema Bactor nell'incubatrice, controlliamo il riempimento senza bolle del circuito di circolazione.

Ora il sistema è completamente riempito con terreno di coltura cellulare e possiamo trasferire il bioreattore all'incubatore. Ora posizioneremo il birettore nella camera di incubazione. E per questo, all'inizio, il birettore è collegato alla pompa a rulli, come hai già visto poco prima, e ora l'ettore è attivamente perfuso da questo mezzo dalla bottiglia.

E per mantenere la concentrazione di ossigeno nell'ambiente, colleghiamo il serbatoio del fluido all'alimentazione del gas. Infine, collegheremo due sensori di ossigeno alla circolazione per monitorare online la tensione dell'ossigeno nel sistema. A questo punto la configurazione è completa e può essere eseguita purché l'esperimento sia stato progettato.

Uno degli strumenti più potenti durante l'analisi delle funzioni organotipiche delle cellule all'interno dei contenitori MicroCon è il microscopio a scansione laser, che potete vedere qui. Il microscopio a scansione laser ci dà l'opportunità di esaminare ogni singolo contenitore MicroCon senza doverlo. E poiché i contenitori MicroCon o il chip possono essere utilizzati per i metodi convenzionali di immunofluorescenza con colorazione immunitaria, siamo in grado di rilevare tutti i tipi di marcatori e funzioni organotipiche all'interno dei micro contenitori.

Come potete vedere qui, nell'animazione di questo chip, il fondo è completamente riempito di celle così come le pareti del contenitore MicroCon. Abbiamo un sacco di cellule che sono abbastanza vive, e abbiamo pochissime cellule morte. L'immagine seguente mostra che siamo in grado di rilevare tutti i tipi di funzioni organotipiche all'interno del contenitore MicroCon.

Ad esempio, per gli epatociti, la produzione di albumina o la E potrebbero sentire un'espressione nelle cellule, che si può vedere bene qui nella sovrapposizione. Il nucleo è colorato di blu. L'eco qui contenuto è colorato in verde e l'albumina è espressa o colorata in rosso.

E come potete vedere qui, tutte le funzioni organotipiche che ci si aspetta dagli epatociti sono ben espresse in questo tipo di coltura 3D. Inoltre, abbiamo esaminato un altro marcatore di epatociti, e questo era la citocheratina 18, e questa immagine mostra che la citocheratina 18 è ben espressa anche in quel tipo di colture. E questo si spera vi convinca che questo tipo di funzioni organotipiche potrebbe essere utile anche per altre colture organotipiche.

Dopo la fine dell'esperimento Biore, il chip può essere utilizzato per l'isolamento di tutti i tipi di componenti cellulari, come ad esempio l'RNA totale. Come potete vedere qui, qui vi mostriamo l'assunzione di RNA totale, che è stato isolato dal sistema del bioreattore. Questo RNA totale può quindi essere utilizzato per applicazioni a valle come, ad esempio, la PCR in tempo reale o, come si può vedere qui, l'analisi dei microarray.

Inoltre, le cellule intatte possono essere isolate dal sistema e tali cellule possono quindi essere utilizzate per l'analisi convenzionale della citometria a flusso. Come potete vedere qui, spero che potremmo mostrarvi che il sistema potrebbe essere utile per tutti i tipi di applicazioni in cui sono richieste reazioni organotipiche e che il sistema potrebbe essere utile per tutti quei tipi di applicazioni che finora non abbiamo considerato, come ad esempio le applicazioni con le cellule staminali.