Libreria del Peptide per mappare gli epitopi di Qa-1 in una proteina di sovrapposizione
20 dicembre 2017
QA-1 (HLA-E nell'uomo) appartiene ad un gruppo di molecole complesse 1b non classici di istocompatibilità. Immunizzazione con gli epitopi Qa-1-associazione ha dimostrato di aumentare la regolazione immunitaria tessuto-specifici e migliorare diverse malattie autoimmuni. Qui descriviamo una strategia di libreria del peptide sovrapposti per l'identificazione di epitopi di Qa-1 in una proteina.
L'obiettivo generale di questa procedura è identificare gli epitopi Qa-1 nelle proteine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della regolazione immunitaria e dell'immunoterapia. I principali vantaggi di questa tecnica sono che i peptidi mappati sono noti per stimolare le cellule T CD8 con restrizioni Qa-1 e la procedura è facile da eseguire.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso i disegni terapeutici per le malattie immuno-mediate, come la sclerosi multipla. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione immunitaria mediata da Qa-1 negli animali, può anche essere applicato alla regolazione immunitaria mediata da HLA-E nell'uomo. Per iniziare la procedura, progettare una libreria di peptidi 15-mer, in cui i peptidi adiacenti si sovrappongono in 11 amminoacidi.
Ottenere e ricostituire i peptidi in condizioni sterili. Per ogni peptide, combinare cinque milligrammi di peptide con 100 microlitri di dimetilsolfossido. Combina 10 microlitri di ogni stock di peptidi in una provetta criogenica pulita da 1 millilitro per preparare il brodo da pool OLP.
Quindi, caricare 20 microlitri di ciascun peptide in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V e diluire ogni stock con 80 microlitri di acqua sterile. Conservare sia le rimanenti scorte di peptidi da 50 milligrammi per millilitro che la piastra da 10 milligrammi per millilitro di peptidi a 20 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 10 microlitri della soluzione madre per pool OLP a una provetta da 15 millilitri contenente due millilitri di cellule dendritiche irradiate in terreno privo di siero, diluendo così il DMSO di duecento volte.
Conservare le scorte di pool OLP rimanenti a 20 gradi Celsius. Incubare i DC con il pool OLP a temperatura ambiente per tre ore. Agitare delicatamente le cellule ogni 15 minuti con le mani.
Durante l'incubazione, utilizzare un kit per purificare le cellule CD8+T da una milza o da un linfonodo di topo raccolto. Preparare cinque millilitri di una soluzione con 10 milioni di cellule T per millilitro di terreno privo di siero con 50 unità per millilitro di interleuchina 2 e 100 unità per millilitro di interleuchina 7. Le cellule T CD8 purificate devono essere prive di perle o non toccate.
Mettere 0,5 millilitri della soluzione di cellule T in ciascuno dei 10 pozzetti di una piastra a 48 pozzetti. Una volta completata l'incubazione della soluzione DC pulsata in pool OLP, aggiungere 10 millilitri di terreno privo di siero alle DC. Centrifugare le cellule a 300 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, ricostituire le cellule in cinque millilitri di terreno privo di siero. Aggiungere 0,5 millilitri della sospensione cellulare a ciascuno dei 10 pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% per quattro giorni.
Quindi, rimuovere 400 microlitri di terreno di coltura da ciascun pozzetto. Aggiungere 500 microlitri di terreno fresco privo di siero contenente 100 unità per millilitro ciascuna di IL-2 e IL-7 in ciascun pozzetto. Incubare le cellule per altri due o tre giorni prima di stimolare nuovamente le cellule innescate con pool OLP.
Prima della restimolazione, ottenere e irradiare macrofagi peritoneali di topo. Regolare la concentrazione dei macrofagi a cinque milioni di cellule per millilitro di terreno privo di siero. Combinare 10 microlitri di stock OLP con due millilitri di macrofagi peritoneali irradiati per una concentrazione finale di DMSO dello 0,5% in volume.
Integrare questa soluzione con 100 unità per millilitro di fattore stimolante le colonie di macrofagi murini. Riempire una piastra da 48 pozzetti con 200 microlitri della soluzione di macrofagi OLP-pool in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per quattro ore.
Quindi, lavare delicatamente ogni pozzetto con 200 microlitri di terreno RPMI-0 preriscaldato. La soluzione di macrofagi conterrà molte perline. Prima di aggiungere le cellule T CD8 innescate con pool OLP, la piastra deve essere controllata al microscopio per assicurarsi che tutti i pozzetti siano privi di perline.
Successivamente, raccogli e raggruppa le cellule T CD8+innescate con pool OLP pronte per la restimolazione. Regolare la concentrazione delle cellule T a un milione di cellule per millilitro in un terreno privo di siero contenente 25 unità per millilitro di IL-2 e 50 unità per millilitro di IL-7. Aggiungere un millilitro della soluzione di cellule T raggruppate a ciascun pozzetto contenente macrofagi pulsati in pool OLP.
Coltiva le cellule a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% per quattro giorni. Quindi, rimuovere circa 400 microlitri di terreno da ciascun pozzetto. Aggiungere a ciascun pozzetto 500 microlitri di terreno fresco privo di siero contenente 100 unità per millilitro ciascuna di IL-2 e IL-7.
Riprendere l'incubazione nelle stesse condizioni. Dopo tre o quattro giorni, esaminare le cellule restimolate per una risposta limitata al Qa-1 specifica del pool OLP con un test immuno spot collegato all'enzima interferone-gamma. Aggiornare il terreno delle cellule T CD8+ ogni tre o quattro giorni in attesa dei risultati.
Eseguire un saggio ELISPOT con le scorte di peptidi diluiti per determinare quali peptidi producono la secrezione di interferone-gamma ristretta Qa-1 specifica per il pool OLP. Infine, valutare una serie peptidica troncata con ELISPOT per identificare l'epitopo Qa-1 ottimale. Un test ELISPOT sull'interferone-gamma ha mostrato un aumento significativo delle cellule che formano macchie quando le cellule T CD8+stimolate dalla libreria di peptidi sovrapposti MOG sono state combinate con C1R.
Cellule Qa-1b. Ciò ha suggerito che le cellule T rispondevano ai peptidi leganti Qa-1 e che il MOG_pool conteneva uno o più epitopi leganti Qa-1. Un altro test è stato eseguito per lo screening dei singoli peptidi nel pool.
Tre peptidi hanno mostrato risposte almeno tre volte maggiori della risposta in presenza di C1R. Cellule Qa-1b senza peptidi. Di questi, il peptide con la maggiore risposta è stato selezionato per un'ulteriore valutazione.
È stata valutata una libreria di peptidi troncati basata sul peptide 15-mer di interesse per identificare l'epitopo Qa-1 ottimale. L'epitopo sarebbe idealmente da 8 a 10 mer, con nove mer preferiti. Inoltre, l'epitopo ottimale mostrerebbe una risposta interferone-gamma simile o più forte rispetto al peptide 15-mer.
Il peptide troncato N-terminale nove mer si adatta meglio a questi criteri, rendendolo l'epitopo Qa-1 ottimale. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della regolazione immunitaria per scoprire nuovi epitopi Qa-1 per lo studio della regolazione immunitaria in altri tessuti, come il pancreas. Non dimenticare che lavorare con le radiazioni può essere estremamente pericoloso.
I ricercatori devono seguire rigorosamente la politica istituzionale ed essere adeguatamente formati.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo per l'identificazione di epitopi Qa-1 nelle proteine, fondamentale per comprendere la regolazione immunitaria. La tecnica prevede la progettazione di una libreria di peptidi sovrapposti in grado di stimolare linfociti T CD8 ristretti da Qa-1.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Immunologia
- Autoimmunità
- Progettazione Terapeutica
Sfondo
- Qa-1 è una molecola non classica del complesso maggiore di istocompatibilità.
- La vaccinazione con epitopi che si legano a Qa-1 può migliorare la regolazione immunitaria.
- Questo metodo ha potenziali applicazioni nel trattamento delle malattie autoimmuni.
- Può essere applicato sia ai modelli animali che alla regolazione immunitaria umana.
Scopo dello studio
- Identificare epitopi Qa-1 in proteine.
- Migliorare la comprensione della regolazione immunitaria e dell'immunoterapia.
- Sviluppare strategie terapeutiche per malattie mediate dal sistema immunitario.
Metodi Utilizzati
- Progettare una libreria di peptidi da 15 residui.
- Garantire un'overlapping di 11 aminoacidi tra peptidi adiacenti.
- Mappare peptidi in grado di stimolare linfociti T CD8 restritti da Qa-1.
- Applicare il metodo a studi su modelli animali e umani.
Risultati principali
- La tecnica è semplice ed efficace.
- I peptidi mappati stimolano con successo le cellule T CD8 restritte da Qa-1.
- Le informazioni ottenute possono guidare la progettazione di terapie per malattie come la sclerosi multipla.
- Potenziale per applicazioni più ampie nella regolazione immunitaria.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce informazioni preziose sulla regolazione immunitaria mediata da Qa-1.
- Presenta potenzialità per lo sviluppo di terapie per le malattie autoimmuni.
- Ulteriori ricerche potrebbero ampliare le sue applicazioni nell'immunoterapia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'identificazione di epitopi funzionali Qa-1 consente la riduzione meccanicistica dei rischi associati a bersagli immunoregolatori nei programmi per le malattie autoimmuni. Questo approccio supporta la validazione del bersaglio collegando sequenze peptidiche all'attivazione di linfociti T CD8+ limitata da Qa-1, fornendo una previsione affidabile per l'immunomodulazione specifica per epitopo. Il metodo accelera l'identificazione dei candidati promettenti nei percorsi di immunoterapia mediante la rapida mappatura di regioni immunogeniche all'interno di proteine rilevanti per la malattia, come la glicoproteina mielinica oligodendrocitaria.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mappando epitopi leganti Qa-1 in grado di indurre risposte di cellule T regolatorie CD8+.
- Valore operativo: Utilizza librerie di peptidi sovrapposti per scansionare sistematicamente sequenze proteiche alla ricerca di regioni immunogeniche, con validazione funzionale tramite saggio IFN-γ ELISPOT.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico confermando la regolazione immunitaria specifica per epitopo in modelli di malattia come l'encefalomielite allergica sperimentale.
Screening e sviluppo di saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative di IFN-γ per ordinare i peptidi candidati in base alla forza stimolatoria rispetto ai controlli.
- Valore operativo: Stabilisce un flusso di lavoro riproducibile per lo screening, che utilizza cellule dendritiche e macrofagi irradiati per presentare peptidi a linfociti T CD8+.
- Valore scientifico: Permette l'analisi di troncamento per definire epitopi minimi (8–10 mer) con attività ottimale per applicazioni successive.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mappa gli epitopi in antigeni rilevanti per le malattie (ad esempio, MOG) per studiare la regolazione immunitaria in tessuti come il pancreas e il sistema nervoso centrale (SNC).
- Valore operativo: Fornisce una piattaforma trasferibile dai sistemi murini Qa-1 a quelli umani HLA-E per la validazione incrociata dei bersagli tra specie.
- Valore scientifico: Supporta la selezione di modelli preclinici identificando epitopi che potenziano la regolazione immunitaria specifica per la mielina.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nella fase iniziale della scoperta per guidare l'identificazione di composti promettenti, in particolare per terapie immunomodulatrici mirate a vie autoimmuni.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi sulla regolazione immunitaria collegando regioni proteiche all'attivazione delle cellule T restritte da Qa-1.
- Screening: Fornisce pool di peptidi pronti per il saggio e peptidi individuali con attività immunostimolatoria validata.
- Analisi: Utilizza l'ELISPOT per quantificare le cellule formanti macchie, consentendo una priorizzazione degli epitopi basata sui dati.
- Ricerca traslazionale: Collega la mappatura degli epitopi agli esiti funzionali nei modelli di malattie autoimmuni.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una pipeline riutilizzabile per la mappatura degli epitopi applicabile a diversi antigeni rilevanti per le malattie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella selezione degli antigeni confermando gli epitopi funzionali responsabili della regolazione immunitaria.
- Valore operativo: Standardizza la scoperta di epitopi mediante la progettazione di peptidi sovrapposti e la stimolazione cellulare controllata.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico nello sviluppo di immunoterapie confermando precocemente il meccanismo d'azione.
- Impatto sul portafoglio: Permette l'avanzamento mirato di candidati basati su epitopi con effetti immunomodulanti dimostrati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in immunologia, manipolazione di peptidi e tecniche di coltura cellulare sterili.
- È subordinato all'accesso a linee cellulari di linfociti T CD8+ restritte da Qa-1 e a cellule presentanti l'antigene (cellule dendritiche, macrofagi).
- Necessita di reagenti standardizzati, inclusi IL-2, IL-7 e M-CSF, per la coltura dei linfociti T e la differenziazione dei macrofagi.
- Comporta considerazioni di sicurezza biologica nella manipolazione di cellule irradiate e scorte di peptidi in DMSO.
- Si basa su infrastrutture per ELISPOT per la rilevazione sensibile della secrezione di IFN-γ come lettura funzionale.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Overlapping Peptide (OLP) Library Generation and T Cell Priming with OLP Pool-pulsed Dendritic Cells (DCs) Protocol
3:43
Re-stimulation of OLP Pool-primed CD8+ T Cells Using Macrophages Pulsed with the OLP Pool
6:19
Results: Identification of a 9-mer Qa-1 Epitope in Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG)
7:32
Conclusion
