Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di isolare le cellule in diverse fasi del ciclo cellulare utilizzando l'elutriazione centrifuga. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle terapie oncologiche. Perché l'isolamento delle cellule in fasi separate, consente l'interrogazione degli effetti dipendenti dalla fase dei composti antitumorali.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la separazione delle cellule in fasi specifiche utilizzando le proprietà fisiche, piuttosto che le perturbazioni chimiche. Per iniziare l'esperimento, installare il gruppo stroboscopico nella centrifuga in modo che il cavo di alimentazione venga fatto uscire dalla camera attraverso la porta a sinistra. Regolare il flash stroboscopico lamp in modo che sia allineato con il viewfinestra, quando la centrifuga è chiusa.

Fissare il gruppo in posizione, serrando due viti a croce, nella parte superiore di ciascuna staffa. E poi stringendo le viti a testa zigrinata nella parte inferiore della staffa. Collegare il cavo di alimentazione alla porta di alimentazione stroboscopica, situata sul retro della centrifuga.

Quindi, posizionare i rotori verso il basso sul mozzo di trasmissione della centrifuga e fissarlo saldamente con una chiave esagonale con impugnatura a T. Quindi, posizionare il gruppo contenente la camera di elutriazione, il contrappeso, il gruppo di tenuta rotante e una piastra di montaggio sul rotore. Spingere verso il basso in modo uniforme, posizionando una mano sulla camera di elutriazione e l'altra mano sul contrappeso, finché i bulloni sul rotore non scattano in posizione.

Posizionare il perno, situato a un'estremità del cavo, nel foro del gruppo di tenuta rotante. E fissare l'occhiello, all'altra estremità, con una delle viti a croce, fissate sulla staffa per collegare il cavo di ancoraggio. Per assemblare il sistema di flusso, per pompare il tampone dentro e fuori dalla camera di elutriazione, collegare il tubo di dimensione 16 a una pompa a velocità variabile.

Inserire un'estremità libera di questo tubo attraverso una porta in alto a sinistra della camera della centrifuga, in modo che entri nella camera. Fissare un raccordo all'estremità libera di questo tubo, quindi inserire il raccordo nel foro di ingresso del gruppo di tenuta rotante. Infine, inserire il tubo di uscita, attraverso una porta, per fissarlo al tubo di trasferimento nella parte superiore del gruppo di tenuta rotante.

Una volta assemblato il sistema di elutriazione, sterilizzarlo inserendo l'altra estremità libera del tubo di ingresso in un flacone da 500 millilitri, riempito con candeggina al 5%. E mettendo il tubo di uscita in una bottiglia di rifiuti vuota da un litro. Quindi, accendi la pompa e lascia che la candeggina scorra fino in fondo attraverso il sistema di elutriazione, fino a quando non viene pompata nella bottiglia di scarico.

Ora, accendi la centrifuga e lasciala raggiungere la velocità massima designata per rilasciare bolle e contropressione. Una volta raggiunta la velocità impostata, arrestare la centrifuga. Dopo che il rotore si è completamente fermato, aprire il coperchio e ispezionare la camera per eventuali perdite.

Successivamente, in modo simile, come descritto in precedenza, far scorrere l'acqua sterile attraverso il sistema per 10 minuti. Dopo il risciacquo con acqua, sostituire il serbatoio dell'acqua con un flacone di vetro sterile riempito con 100 millilitri di tampone di elutrizione. Posizionare il tubo di ingresso in questa bottiglia, in modo che si trovi sul fondo.

Avviare la centrifuga e lasciare che il tampone scorra attraverso il sistema. Dopo che la bottiglia del serbatoio è quasi vuota e l'acqua è completamente espulsa dal sistema, spostare il tubo di uscita dalla bottiglia di scarico nel serbatoio in modo che il tampone venga continuamente riciclato attraverso il sistema. Infine, accendere la lampada stroboscopica e ruotare la manopola di elutriazione all'estrema sinistra.

Ora, regola la finestra di visualizzazione ruotando lentamente la manopola verso destra, in modo che la camera di elutriazione sia chiaramente visibile e la luce stroboscopica sia sincronizzata con la velocità del rotore. Preparare il campione di cella come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere le cellule risospese nel flacone del serbatoio contenente il tampone di elutriazione del riciclaggio.

Consentire alle cellule di entrare nel sistema e raggiungere l'equilibrio all'interno della camera di elutriazione. Per assicurarsi che tutte le cellule siano trattenute nella camera, prelevare una goccia di eluente su un vetrino e osservarlo al microscopio. Se il campione è privo di cellule intatte, conferma la ritenzione nella camera.

Una volta che tutte le cellule sono entrate nella camera e si vede un confine distinto nella parte più bianca della camera, contenente le cellule e l'equilibrio, iniziare a raccogliere le frazioni. Spostare il tubo di uscita in un tubo conico da 50 millilitri pre-raffreddato, etichettato W1. Raccogliere 50 millilitri di tampone di elutriazione in questa provetta e conservarla in ghiaccio. Subito dopo aver raccolto la frazione W1, abbassare la velocità della centrifuga a 821 G.E spostare il tubo di uscita sul tubo conico, etichettato W2, e raccogliere altri 50 millilitri a questa velocità.

Continua a cambiare la velocità e a raccogliere le frazioni. Assicurati che ci sia del fluido nel serbatoio del serbatoio e conserva sempre le frazioni raccolte sul ghiaccio. Dopo che tutte le frazioni sono state raccolte, arrestare la centrifuga e raccogliere 50 millilitri in una provetta conica, etichettata come stop.

Cellule a pellet raccolte in ciascuna delle frazioni e utilizzando l'analisi a valle, come la citometria a flusso o il western blotting, a seconda delle necessità. Viene mostrato un grafico a linee che mostra il diametro medio delle cellule in frazioni di elutriazione successive. Si noti che maggiore è il diametro della cella, maggiore è il numero di frazione al quale eluisce.

I risultati dell'analisi di smistamento delle cellule attivate da fluorescenti mostrano il contenuto di DNA delle cellule in ciascuna delle 20 frazioni di elutriazione. Le frazioni precoci, da F1 a F5, contengono quasi esclusivamente cellule con contenuto di DNA 2N che rappresentano cellule in fase G1. Una miscela di cellule nelle fasi G1 e S, è stata osservata nelle frazioni intermedie, da F6 a F9. E le cellule con contenuto di DNA 4N, che rappresentano le cellule da G2 a M, sono state osservate a partire da F10.

Qui sono mostrati i risultati del western blot dall'analisi dei livelli di proteine correlate al ciclo cellulare in frazioni raggruppate di cellule in fase G1 e in fase da G2 a M. Il pool da G2 a M aveva livelli più elevati di fosfo-Rb e ciclina B, rispetto al pool G1, come previsto. Il segnale della ciclina D 1 era debole, ma era comunque rilevabile nel pool G1 e non rilevabile nel pool da G2 a M.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di prendersi il tempo necessario e assicurarsi che il sistema di elutriazione sia assemblato correttamente e che tutti i materiali e le soluzioni siano preparati. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi del ciclo cellulare, i saggi di vitalità cellulare e gli immunoblot per indagare in che modo i composti terapeutici possono agire in modo dipendente dalla fase del ciclo cellulare.