Sviluppo di analisi per la quantificazione alto contenuto di formazione aggregata di Sod1 mutante della proteina in cellule viventi

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di sviluppare un saggio per studiare l'effetto di piccole molecole nel modulare l'aggregazione di proteine mal ripiegate in modo dipendente dal tempo e dalla dose. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave per lo sviluppo di saggi cellulari e il suo utilizzo è per tecniche di screening ad alto contenuto. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di fornire un metodo semplice per rilevare e quantificare l'aggregazione proteica che si verifica in diverse malattie neurodegenerative.

L'implicazione di questa tecnica si estende verso la potenziale terapia di malattie neurodegenerative, come la SLA, perché propone un metodo semplice che consente di sviluppare saggi cellulari ed eseguire lo screening per i moderatori di piccole molecole. Per avviare la produzione del virus, prima della trasfezione plasmidica, dividere le cellule T HEK-293 al 30-40% di confluenza in una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri e 10 millilitri di terreno di coltura cellulare. Incubare la piastra di coltura in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno seguente, preparare la soluzione di trasfezione del DNA con il vettore lentivirale dei plasmidi di confezionamento, 125 microlitri di cloruro di calcio molare e aggiungere acqua distillata per regolare il volume a 500 microlitri. Aggiungere delicatamente 500 microlitri di tampone HEPS molare da 0,05 e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, sostituire il terreno di coltura delle cellule T HEK-293 con 10 millilitri di terreno di coltura fresco preriscaldato privo di antibiotici mescolato con un millilitro di soluzione di trasfezione del DNA.

Incubare a 37 gradi Celsius e all'incubatore con il 5% di anidride carbonica durante la notte. Sostituire il surnatante cellulare con un terreno di coltura fresco il giorno successivo e incubare nuovamente durante la notte. Infine, il giorno seguente raccogliere il surnatante e trasferirlo in una provetta da 15 millilitri.

Per rimuovere le cellule morte e i detriti, centrifugare la provetta a 500 volte g per cinque minuti. Per purificare ulteriormente il supernatent, passarlo attraverso un filtro da 0,45 micrometri utilizzando una siringa da 60 millilitri. Quindi, erogare immediatamente il surnatante filtrato in aliquote monouso da 300 microlitri.

Per preparare le cellule alla trasduzione, dividerle per essere infettate al 60% di confluenza in una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti in due millilitri di DMAM integrato con il 10% di FBS. Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica durante la notte. Il giorno seguente, scongelare un'aliquota di lentivirus congelato con ghiaccio per ogni utilizzo.

Nel frattempo, riscaldare il terreno di coltura cellulare contenente il siero compatibile con la linea cellulare di interesse. Una volta che il virus è completamente scongelato, diluirlo in DMEM in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi regolare il volume a un millilitro con siero ridotto medio.

Quindi, aggiungere due microlitri di polibrene a un millilitro di virus per terreno e mescolare bene pipettando. Aggiungere un millilitro di questa miscela alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno contenente il virus e sostituirlo con DMEM normale integrato con il 10% di FBS e rimettere le cellule nell'incubatore.

Monitorare la crescita cellulare e cambiare il terreno ogni due giorni Quando le cellule raggiungono la confluenza, espandere ogni pozzetto della piastra a sei pozzetti in una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri. Sposta le piastre nell'incubatrice. Infine, è possibile risparmiare 1,5 volte 10 al 4° cellulare per pozzetto e 50 microlitri di DMEM su piastre di analisi a 384 pozzetti.

Quindi controlla il livello di espressione della proteina marcata YFP al microscopio. Se l'espressione mostra un rapporto segnale/rumore uguale o superiore a tre, preparare lo stock di cellule per la linea cellulare corrispondente. Per il trasferimento del composto, su una piastra in polipropilene di stoccaggio a 384 pozzetti, aggiungere diluizioni seriali dei composti secondo la serie standard da una a tre diluizioni.

Quindi, utilizzando un gestore di liquidi dotato di una testa capillare a 384 pozzetti, distribuire 0,25 microlitri di inibitori del proteasoma su piastre di saggio nere a 384 pozzetti vuote e a fondo piatto. Quindi semina 1,5 volte 10 fino alla quarta cella su queste piastre. Incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore.

Prima di eseguire l'imaging della linea cellulare trattata con inibitori del proteasoma, aggiungere 10 microlitri di DMEM preriscaldato con soluzione colorante e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo la colorazione, avviare il software operativo del microscopio automatizzato selezionando la scheda del microscopio. Innanzitutto, seleziona la scheda di configurazione, quindi seleziona l'obiettivo 20 volte nel tipo di targa corretto.

Per consentire una messa a fuoco corretta con diversi tipi di targa, assicurarsi che il chiamante sia impostato sul valore corretto sull'obiettivo. Quindi, seleziona l'esposizione uno. Impostare l'altezza di messa a fuoco su zero micrometri, quindi selezionare la messa a fuoco.

Una volta messa a fuoco, esporre la fotocamera uno. Per ottimizzare il piano di esposizione, regolare l'altezza di messa a fuoco e fare clic su prendi altezza. Modifica i tempi di esposizione e la potenza del laser per un'intensità massima di pixel di circa 3000 e salva i parametri di esposizione.

Seleziona la scheda di definizione dell'esperimento, crea un layout e un sottolayout. Quindi, trascina e rilascia l'esposizione del layout pertinente, l'immagine di riferimento, il file di ritaglio inclinato e il sottolayout. Quindi, salva l'esperimento.

Infine, seleziona la scheda Esperimento automatico e acquisisci le immagini. Per le immagini a due canali, selezionare prima l'algoritmo software per segmentare gli oggetti primari, come nuclei, citosol e aggregati. Per prima cosa, distribuire 0,25 microlitri di inibitore del proteasoma disciolto in DMSO al 100% o DMSO su piastre a fondo piatto a 384 pozzetti.

Sulla stessa piastra, seminare manualmente 1,5 volte 10 alla quarta cella per pozzetto in 50 microlitri di DMEM. Quindi impostare l'unità di controllo ambientale del sistema di microscopio a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Utilizzare il microscopio in modalità di florescenza ad ampio campo e, come impostazioni software, scegliere la modalità non confocale LWD 20 volte l'obiettivo, quattro campi per pozzetto e l'intervallo di acquisizione di un'ora.

Quindi, selezionare l'algoritmo appropriato per segmentare l'oggetto primario, ad esempio citosol e aggregati. Se necessario, regolare la soglia dello sfondo e i parametri di contrasto. Le linee cellulari testate trasdotte con SOD-1 wild type e SOD-1 A4V mutant sono rimaste sane, hanno mostrato alti livelli di espressione e un'ampia marcatura phi a lungo termine, indipendentemente dalla forma SOD.

Il trattamento con l'inibitore del proteasoma ALLN per 24 ore ha promosso l'accumulo di aggregati SOD-1 A4V YFP nelle cellule HEK-293 ma non nelle cellule trasdotte SOD-1 Wild Type YFP. Inoltre, c'erano livelli molto bassi di aggregazione nelle linee cellulari U2 OS e SH-SY5Y SOD-1 A4V YFP trasdotte con gli stessi vettori. Dopo aver seminato le cellule in presenza o assenza di ALLN, sono state monitorate per la formazione di aggregati per un periodo di 50 ore.

La formazione aggregata di ALLN ha raggiunto un plateau a 24 ore ed è rimasta stabile nelle successive 12 ore. Inoltre, la densità cellulare è diminuita significativamente dopo 28 ore a causa dell'effetto citotossico dell'ALLN, mentre il numero di cellule è aumentato nel controllo negativo trattato con DMSO. Le cellule SOD-1 A4V YFP coltivate in presenza di inibitori del proteasoma per 24 ore sono state colorate con la soluzione di Hoechst.

La tossicità relativa per tre diversi inibitori del proteasoma è stata quantificata misurando il numero di linee cellulari aderenti rimaste nel pozzetto marcato con il colorante Hoechst. Il numero totale di cellule è diminuito in risposta all'aumento della dose di inibitori della proteasi. Al contrario, la percentuale di cellule che esprimono aggregati SOD-1 A4V aumenta con la concentrazione dell'inibitore della proteasi.

Quando si esegue questo processo, è importante ricordare che la qualità delle celle influenzerà drasticamente il risultato. Quindi è importante determinare che le cellule siano prive di microplasma e siano sane lungo tutti i passaggi. A seguito di questo processo, è possibile utilizzare un altro metodo di imaging per rispondere a ulteriori domande riguardanti la degradazione della proteina o l'interazione della proteina con altre utilizzando il trasferimento di energia di risonanza.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare gli strumenti per testare il destino delle proteine in più cellule viventi utilizzando l'analisi delle immagini ad alto contenuto. Quindi questo metodo può fornire informazioni sull'aggregazione proteica così come si verifica in semplici modelli cellulari. Può anche essere applicato ad altri sistemi, come i neuroni differenziati dalle cellule staminali pluripotenti indotte specifiche del paziente.