Sovrapressione e purificazione dell'uomo Cis -preniltransferasi in

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di sovraesprimere e purificare la cis-preniltransferasi umana ottimizzata per il codone in condizioni non denaturanti e di saggiarne l'attività enzimatica. La procedura è dimostrata con la cis-preniltransferasi eucariotica a catena lunga deidrodolidico difosfato sintasi, o DHDDS. Questo metodo può far progredire la nostra comprensione della sintesi degli isoprenoidi e fornire informazioni chiave sul meccanismo fisiopatologico della retinite pigmentosa correlata alle mutazioni in DHDDS.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che è semplice, economica e fa risparmiare tempo. Può anche essere generalizzato per la produzione di grandi quantità di altre proteine cis-preniltransferasi. Iniziare questa procedura con la clonazione di un'espressione di DHDDS umano, come descritto nel protocollo di testo.

Risospendere le cellule nel tampone A, un microgrammo per millilitro di DNasi I e una miscela di inibitori della proteasi. Quindi, omogeneizzare le cellule risospese utilizzando un omogeneizzatore in teflon di vetro. Disgregare le cellule con un microfluidizzatore o equivalente a una velocità compresa tra 12.000 e 15.000 psi.

Quindi, centrifugare il lisato cellulare a 40.000 volte g per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Recuperare il surnatante contenente la frazione solubile. Caricare il surnatante su una colonna per cromatografia di affinità metallica immobilizzata con cobalto da 5 a 10 millimetri con imidazolo da 10 millimolari.

Dopo il caricamento in una macchina per cromatografia liquida di proteine veloci, eseguire un lavaggio accurato della colonna con il tampone A in 10 millimolari di imidazolo al fine di ridurre il legame non specifico delle proteine. Inizia il programma FPLC. Eluire le proteine sovraespresse con il tampone A integrato con 250 millimolari di imidazolo.

Dopo l'eluizione, rimuovere l'imidazolo utilizzando 53 millilitri di una colonna di desalinizzazione preparativa bilanciata con tampone A.Quindi, aggiungere la proteasi TEV marcata con esaistidina alle proteine eluite per rimuovere la loro fusione DHDDS con tioredossina marcata con esaistidina. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius per una notte. Successivamente, caricare le proteine tagliate su una colonna per cromatografia di affinità metallica immobilizzata con cobalto bilanciata con tampone A integrato con cinque millimolari di imidazolo.

Raccogliere il flusso per rimuovere la tioredossina e la proteasi TEV marcate con esaistidina scissicata. Concentrare il flusso in un intervallo compreso tra tre e quattro millilitri utilizzando un filtro centrifugo a peso molecolare da 30 kilodalton. Quindi, caricare la proteina concentrata su una colonna cromatografica ad esclusione di dimensioni Superdex 200 bilanciata con il tampone A per la purificazione finale.

Posizionare i campioni in un rack da 96 pozzetti in un collettore di frazioni. La proteina eluisce sotto forma di dimero. Selezionare le frazioni pertinenti confrontando il profilo di eluizione con una curva di calibrazione della colonna.

A questo punto, valutare la purezza del preparato utilizzando SDS-PAGE. Infine, determinare la concentrazione proteica necessaria per la sperimentazione a valle e congelare le aliquote di proteine concentrate purificate in azoto liquido. Conservare le aliquote a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Per garantire la capacità della proteina di resistere ai cicli di congelamento-scongelamento, scongelare un'aliquota delle proteine congelate. Centrifugare l'aliquota a 21.000 volte g per 10 minuti per rimuovere gli aggregati insolubili. Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante.

Successivamente, caricare le proteine su una colonna analitica Superdex 200 pre-bilanciata con TNXB utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni. Monitorare la fluorescenza del triptofano per rilevare il profilo di eluizione della proteina. Assicurarsi di disporre di una curva di calibrazione valida per la valutazione del peso molecolare, disponibile tramite i produttori di colonne SEC.

Per garantire l'attività della proteina purificata, mescolare prima cinque micromolari di DHDDS purificato con 10 micromolari di FPP e 50 micromolari di C14 IPP. Avviare la reazione nel tampone A con 0,5 millimolari di cloruro di magnesio a 22-30 gradi Celsius. Prelevare campioni da 15 microlitri dalla reazione a zero, due, quattro e sei ore dopo l'estinzione immediata della reazione mediante l'aggiunta di 15 microlitri di tampone A integrato con EDTA da 20 millimolari.

Quindi, aggiungere un millilitro di 1-butanolo saturo d'acqua e agitare accuratamente per estrarre i prodotti di reazione. Il protocollo può essere interrotto qui e i campioni possono essere conservati per una lettura successiva. Quindi, aggiungere il cocktail di scintillazione ai campioni.

Utilizzando un contatore a scintillazione, quantificare i prodotti della reazione nella fase butanolo che comprendono C14 insieme alla radioattività di 15 microlitri della reazione, che rappresenta la radioattività totale. Infine, calcola l'incorporazione netta di C14 IPP in ogni momento calcolando la percentuale utilizzata dalle concentrazioni totali di C14 IPP e traccia i risultati in funzione del tempo. Con il tempo si prevede un aumento dell'incorporazione netta di C14 IPP.

Di seguito sono riportati i campioni ottenuti ad ogni fase di purificazione. Questa analisi SDS-PAGE mostra la purificazione graduale del DHDDS, ottenendo un prodotto altamente purificato. Questo cromatogramma rappresenta i risultati della cromatografia analitica di esclusione dimensionale dell'enzima purificato, rivelando che la proteina viene osservata solo come omodimero.

In questo caso, la freccia indica il volume vuoto. Un test rappresentativo dell'attività tempo-dipendente rivela che l'incorporazione di C14 IPP aumenta chiaramente nell'arco di sei ore, verificando che l'enzima purificato sia funzionale. Una volta padroneggiata, questa semplice preparazione può essere eseguita in due o tre giorni, ottenendo un enzima altamente puro e attivo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sovraesprimere e purificare la cis-preniltransferasi umana da E.coli e misurare la sua attività in modo dipendente dal tempo.