Name: High throughput sequenziamento parallelo al Fitness misura di Leptospira interrogans trasposone inserimento mutanti durante dorato siriano criceto infezione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Scopri il sequenziamento ad alto rendimento dei trasposoni per identificare mutanti di Leptospira interrogans con difetti di fitness in vivo e in vitro. Questo metodo consente di studiare i geni di virulenza nel modello di infezione del criceto dorato.

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Questo lavoro è stato supportato da un premio di merito di affari di veterani (a D.A.H.) e un istituto superiore di sanità concede R01 AI 034431 (per D.A.H.).

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Anche se il nostro esperimento pilota per criceto sfidato intraperitonealmente con 42 L. interrogans mutanti i risultati sono presentati17, ci aspettiamo che piscine più grandi di mutanti possono essere schermate da Tn-segg. Perché la frequenza di transconjugants è bassa (100-200 transconjugants/accoppiamento), parecchi accoppiamenti sono necessari per generare un numero sufficiente di mutanti per grandi esperimenti di Tn-Seq. Mantenere un gran numero di mutanti in colture liquide present...

Identificazione di geni di virulenza per alcuni batteri, come ad esempio Leptospira spp., è difficile a causa del numero limitato di strumenti genetici disponibili. Un approccio comunemente utilizzato è la creazione di una collezione di mutanti di mutagenesi casuale trasposone seguita mediante l'identificazione del sito di inserimento in ogni mutante e virulenza prova di mutanti singoli trasposone in un modello animale. Questo approccio è che richiede tempo, costoso e richiede un gran numero di animali.
Quando mutagenesi casuale è stata sviluppata per l'agente patogeno Leptospira interrogans, sono stati identificati geni coinvolti nella virulenza di test singoli mutanti in un modello animale1. Mutanti sono stati selezionati in base a criteri quali i loro ruoli potenziali nella segnalazione o motilità o loro membrana esterna prevista o posizione superficiale. Come la maggior parte dei lipopolosaccaridi geni codificano proteine ipotetiche di funzione sconosciuta2, selezione di mutanti basato su questi limiti di criteri la possibilità di scoprire i geni di virulenza leptospirale romanzo.
Più recentemente, piscine di mutanti di L. interrogans trasposoni sono state schermate per infettività nei modelli criceto e mouse3. Ogni animale è stato sfidato con un pool di fino a 10 mutanti. Infettività di un mutante è stato segnato come positivo se è stato rilevato dalla PCR di colture ottenute da sangue e reni. Prova di PCR era laboriosa perché richiedeva una reazione di PCR individuale per ogni mutante in piscina. Perché la frequenza di ogni mutante nelle culture non è stata quantificata, l'approccio era prevenuto verso identificazione di mutanti altamente attenuati.
Descriviamo un trasposone sequenziamento (Tn-Seq) tecnica, come strategia per schermo in modo più efficiente per i geni di virulenza. TN-seq è costituito dalla creazione di una libreria di mutanti mediante mutagenesi transposon seguita da sequenziamento massivo parallelo4,5,6. Brevemente, trasposoni mutanti sono riuniti, inoculati in animali e poi recuperati da diversi organi (uscita piscine). Il DNA dalle piscine uscita è estratta e digerito con enzimi di restrizione o Tosato di sonicazione. Vengono eseguiti due cicli di PCR targeting per le giunzioni dei siti inserimento trasposoni. Questo passaggio consente di aggiungere gli adattatori necessari per il sequenziamento. I prodotti PCR ottenuti sono analizzati dall'ordinamento ad alta produttività per identificare il sito di inserzione del trasposone di ogni mutante della piscina insieme a loro abbondanza relativa, che è rispetto alla composizione iniziale della piscina del mutante.
Il vantaggio principale di questo approccio è la capacità di schermo simultaneamente un gran numero di mutanti con un numero limitato di animali. TN-Seq non richiede la conoscenza dei siti inserimento trasposone che aumenta le possibilità di scoprire nuove Leptospira-geni specifici coinvolti nella virulenza con meno tempo e una maggiore efficienza. Perché leptospirale onere nei tessuti è relativamente alto in roditore modelli suscettibili di letale infezione (tipicamente 104 -108 batteri/g di tessuto)7,8,9 pure come padroni di casa serbatoio 10,11, tessuti possono essere analizzati direttamente senza la necessità di cultura, riducendo le distorsioni a causa della crescita in vitro .
Negli studi di Tn-Seq con maggior parte dei batteri patogeni descritti fin qui, l'alta frequenza di mutagenesi inserzionale ammessi infezione con grandi vasche contenenti mutanti collettivamente avendo più inserimenti trasposone ravvicinate all'interno di ogni gene4 ,12,13,14. TN-Seq è stato sviluppato anche per un batterio per cui la frequenza di mutagenesi è molto inferiore6. Con Leptospira, una libreria di mutanti trasposone può essere generata introducendo il trasposone su un plasmide che possono essere mobilitato da coniugazione come descritto da Slamti et al.15. Tuttavia, la frequenza di mutagenesi transposon di L. interrogans è bassa. Quando il trasposone Himar1 è stato introdotto su un plasmide coniugativi, la frequenza di transconjugant è stata segnalata per essere solo 8,5 x 10-8 per ogni destinatario delle cellule con il ceppo di Lai di L. interrogans16 e rischia di essere allo stesso modo scarsa con la maggior parte altri ceppi di L. interrogans. Il protocollo descritto qui è in parte basato su quello sviluppato per Borrelia burgdorferi, in cui la frequenza di mutagenesi inserzionale trasposone è anche basso6.
Per il nostro esperimento pilota con il protocollo17, abbiamo condotto la mutagenesi transposon con L. interrogans serovar Manilae ceppo L495 a causa del successo di altri gruppi ad isolare mutanti di inserimento trasposone nel ceppo insieme al suo basso LD50 (dose letale) per virulenza1. Abbiamo proiettato 42 mutanti di Tn-Seq e identificato parecchi candidati mutanti difettosi nella virulenza, compreso due con inserimenti in un gene di adenilato ciclasi del candidato. Prova individuale dei due mutanti in criceti ha confermato che erano carenti in virulenza17.

<table><tbody><tr><td>Kanamicina solfato da Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>acido 2,6-diaminopimelico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1377</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomicina dicloridrato pentaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Axio Lab A1 microscopio con condensatore in campo scuro</td><td>Zeiss</td><td>490950-001-000</td><td></td></tr><tr><td>Kit di sangue e tessuti DNeasy</td><td>Qiagen</td><td>69504/69506</td><td></td></tr><tr><td>Purificazione PCR MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004/28006</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104/28106</td><td></td></tr><tr><td>Modello 505 Dismembratore sonico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-505</td><td></td></tr><tr><td>Tromba a tazza da 2,5"</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-4625</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td>Passaggio 3.1.2.4</td></tr><tr><td>Deossinucleotidiltransferasi terminale</td><td>Promega</td><td>M828C</td><td></td></tr><tr><td>Master mix Phusion</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531</td><td>Preparazione di librerie genomiche, passaggio 3.4.</td></tr><tr><td>DreamTaq Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>K9011/K9012</td><td>Identificazione del sito di inserimento del trasposone, passaggio 1.2.</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>ddCTP</td><td>Affymetrix/ USBProducts</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclatore</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorimetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>passo 3.6.</td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851/Q32854</td><td>passo 3.6.</td></tr><tr><td>Tubi per saggi Qubit</td>, <td>tecnologie per la vita</td><td>Q32856</td>, <td>passaggio 3.6.</td></tr><tr><td>PBS pH 7.2 (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012-027 20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi monouso No10</td><td>Feather</td><td>2975#10</td><td></td></tr><tr><td>Plastica K2 Provette EDTA 2 ml</td><td>BD vacutainer</td><td>367841</td><td></td></tr><tr><td>siringa U-100 con 26G x &frac12; &rdquo; ago</td><td>BD vacutainer</td><td>329652</td><td>sfida IP, passaggio 2.2.1.</td></tr><tr><td>Siringa con punta Luer-Lok da 3 mL</td> BD <td>vacutainer</td><td>309657</td><td>Puntura cardiaca, passaggio 2.4.2.</td></tr><tr><td>25G X 5/8" ago</td><td>BD vacutainer</td><td>305901</td><td>puntura cardiaca, passaggio 2.4.2.</td></tr><tr><td>Base in vetro frittato da 25 mm con tappo</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002502</td><td>Sistema di unità di filtrazione, passaggio 1.1.7.</td></tr><tr><td>Morsetto a molla in alluminio da 25 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002503</td><td>Sistema di unità di filtrazione, passaggio 1.1.7.</td></tr><tr><td>Imbuto in vetro borosilcato da 15 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002514</td><td>Sistema di unità di filtrazione, passaggio 1.1.7.</td></tr><tr><td>Pallone Erlenmeyer a braccio laterale da 125 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002505</td><td>Sistema di unità di filtrazione, passaggio 1.1.7.</td></tr><tr><td>Filtro in acetato-cellulosa VVPP (dimensione dei pori 0,1 mm; diametro 25 mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>VVLP02500</td><td></td></tr></tbody></table>

high throughput sequenziamento parallelo al fitness misura di leptospira interrogans trasposone inserimento mutanti durante dorato siriano criceto infezione

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In questo manoscritto, descriviamo un trasposone sequenziamento (Tn-Seq) tecnica per identificare e quantificare i mutanti di Leptospira interrogans alterati in palestra durante l'infezione di criceti dorati siriani. TN-Seq combina mutagenesi casuale trasposone con la potenza della tecnologia di sequenziamento ad alta velocità. Gli animali sono sfidati con un pool di mutanti trasposone (ingresso piscina), seguito dalla raccolta del sangue e nei tessuti un paio di giorni più tardi per identificare e quantificare il numero di mutanti in ogni organo (uscita piscine). Le piscine di uscita vengono confrontate con la piscina ingresso per valutare l'idoneità in vivo di ogni mutante. Questo approccio consente la proiezione di una grande piscina di mutanti in un numero limitato di animali. Con modifiche minori, il presente protocollo può essere eseguito con qualsiasi modello animale di leptospirosi, modelli di host di serbatoio come i ratti e i modelli di infezione acuta quali criceti, come pure gli studi in vitro . TN-Seq fornisce un potente strumento per schermo per mutanti con difetti di fitness in vivo e in vitro .

Creazione di una libreria di mutanti trasposone in L. interrogans mediante coniugazione richiede un'unità di filtrazione, come mostrato nella Figura 1. Abbiamo recuperato 100-200 transconjugants da ogni accoppiamento.
Il sito di inserzione del trasposone è identificato in ogni mutante ordinando il prodotto PCR generato da PCR semi-casuale che gli obiettivi alla fine del trasposone e accogli...

Qui descriviamo una tecnica che combina la mutagenesi transposon con sequenziamento ad alta produttività per identificare e quantificare il trasposone leptospirale mutanti in tessuti dopo una sfida di criceti. Questo protocollo può essere utilizzato per mutanti di schermo per la sopravvivenza e la diffusione negli animali e può essere applicato anche agli studi in vitro .

High throughput sequenziamento parallelo al Fitness misura di Leptospira interrogans trasposone inserimento mutanti durante dorato siriano criceto infezione

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di sequenziamento dei trasposoni ad alto rendimento è identificare e quantificare i mutanti dei trasposoni con difetti di fitness in vivo e in vitro e, quindi, identificare i geni Leptospira coinvolti nella virulenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della Leptospira, come l'identificazione dei geni coinvolti nella colonizzazione, nella disseminazione e nella sopravvivenza dei batteri nell'ospite. Il vantaggio principale di questa tecnica è che un gran numero di mutanti può essere sottoposto a screening con un numero limitato di animali.Sebbene questo metodo sia stato progettato per esaminare l'idoneità dei mutanti di Leptospira interrogans nel modello di criceto con leptospirosi acuta, può anche essere applicato attraverso modelli di infezione cronica, studi in vitro e altri ceppi di Leptospira. A dimostrare la procedura saranno Kritel Lourdault e Karen Evangelista, entrambi post-doc del mio laboratorio. Innanzitutto, assemblare un'unità di filtrazione.Posizionare la base su un pallone Erlenmeyer a braccio laterale da 125 millilitri. Posizionare un filtro in acetato di cellulosa alla base e fissare un imbuto s

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Immunologia e Infezioni

Enterobacter sp. YSU cresce in glucosio sali minima quantità di terreno. Auxotrofi sono generati trasformandola con transposome che si inserisce in modo casuale nel genoma dell'ospite. Mutanti si trovano di replicazione delle piastre da medie complesso terreno minimo. Geni interrotti sono identificati da salvataggio e sequenziamento del gene.

Generazione di Enterobacter Sp. YSU auxotrofi Utilizzando Transposon Mutagenesi

Coxiella burnetii è un batterio Gram-negativi obbligato intracellulare responsabile della zoonotici malattia febbre Q. Qui si descrivono i metodi per la generazione di Coxiella mutanti di trasposoni fluorescente nonché l'identificazione automatizzata e l'analisi dei risultanti internalizzazione, replica e citotossici fenotipi.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Presentato qui è un metodo semplice per la creazione di una libreria di inserimento ad alta densità trasposone in Escherichia coli o Shigella flexneri mediante coniugazione batterica. Questo protocollo permette la creazione di una collezione di centinaia di migliaia di mutanti unici nei batteri mediante l'inserimento casuale di genomica di un trasposone.

Creazione di una densa trasposone inserimento Biblioteca mediante coniugazione batterica Enterobacterial ceppi come Escherichia Coli e Shigella flexneri

Pronuclei iniezione (PN) del cluster regolarmente intervallate brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) e sistema di CRISPR-collegato della proteina-9 nucleasi (CRISPR/Cas9) è un metodo altamente efficiente per produrre geneticamente criceti dorati siriani. Qui, descriviamo il protocollo dettagliato di PN iniezione per la produzione di gene knockout criceti con il sistema CRISPR/Cas9.

Produzione di geneticamente criceti dorati siriani di pronuclei iniezione del complesso CRISPR/Cas9

Questo approccio molecolare per determinare la forma fisica batterica facilita il rilevamento preciso e preciso dei microrganismi utilizzando codici a barre specifici del DNA genomico quantificati tramite PCR digitale. Il protocollo descrive il calcolo dell'indice concorrenziale per i ceppi di Salmonella;  tuttavia, la tecnologia è facilmente adattabile ai protocolli che richiedono la quantificazione assoluta di qualsiasi organismo geneticamente malleabile.

Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella

L'emizigozia reciprocata tramite sequenziamento (RH-seq) è un nuovo potente metodo per mappare la base genetica di una differenza tra le specie. I pool di emizigotes sono generati dalla mutagenesi trasposonista e la loro forma fisica è monitorata attraverso la crescita competitiva utilizzando il sequenziamento ad alto tutto. L'analisi dei dati risultanti individua i geni alla base del tratto.

Mappatura genetica delle differenze di termotolleranza tra le specie di Saccamici Yeast tramite l'analisi dell'emizigosità reciproca genomica

Descriviamo un metodo per generare librerie mutanti trasposoni saturanti nei batteri Gram-negativi e la successiva preparazione di librerie di amplicone di DNA per il sequenziamento ad alto rendimento. Ad esempio, ci concentriamo sull'agente patogeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ma questo protocollo è summostico per una vasta gamma di organismi Gram-negativi.

Generazione di librerie di inserimento transposon in batteri Gram-Negativi per il sequenziamento ad alta velocità effettiva

Qui viene descritta l'applicazione dell'interferenza CRISPR (CRISPRi) per un silenziamento genico specifico nelle specie di Leptospira. Le cellule leptospira sono trasformate coniugando con plasmidi che esprimono dCas9 (cas9 cataliticamente "morto") e un RNA a guida singola (sgRNA), responsabile dell'accoppiamento di base al bersaglio genomico desiderato. Vengono presentati metodi per convalidare il silenziamento genico.

Applicazione dell'interferenza CRISPR (CRISPRi) per il silenziamento genico nelle specie patogene di Leptospira

Questo è un metodo adattato per identificare i potenziali fattori di colonizzazione degli insetti in un simbionte benefico Burkholderia. L'ospite coleottero è infettato da una libreria mutante casuale generata tramite mutagenesi trasposone e la complessità della libreria dopo la colonizzazione viene confrontata con un controllo coltivato in vitro.

Sequenziamento trasposone-inserzione come strumento per chiarire i fattori di colonizzazione batterica in un simbionte gladioli Burkholderia di Coleotteri Lagria villosa

Qui presentiamo una valutazione longitudinale di criceti dorati infettati per via intraperitoneale (IP) o per via intragengivale (IG) con L. infantum-Luc mediante imaging bioluminescente e mediante PCR. I criceti sono stati valutati 1 giorno dopo l'infezione (1 dpi), 1 settimana dopo l'infezione (8 dpi) e 3 settimane dopo l'infezione (22 dpi) e soppressi al 50° dpi e 8 mesi dopo l'infezione.

In vivo Imaging di criceti infetti da Leishmania infantum mediante inoculazione gengivale di amastigoti axenici che esprimono luciferasi

Questo protocollo offre un flusso di lavoro modulare BSL-2 che combina saggi su biomassa cristallino-viola, cinetica a contrasto di fase in time-lapse, mappatura confocale 3D/matriciale, ultrastruttura SEM e un modulo di infezione da criceto in vivo per coltivare, quantificare, caratterizzare e indagare il ruolo funzionale del biofilm di Leptospira , consentendo la valutazione standardizzata dei mutanti e interventi anti-biofilm in laboratori.

Un flusso di lavoro modulare per l'analisi quantitativa, strutturale e funzionale dei biofilm di Leptospira

Scopri il sequenziamento ad alto rendimento dei trasposoni per identificare mutanti di Leptospira interrogans con difetti di fitness in vivo e in vitro. Questo metodo consente di studiare i geni di virulenza nel modello di infezione del criceto dorato.

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