Valutazione In Vitro del DNA danni utilizzando test della cometa

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di studiare l'efficacia degli agenti genotossici nelle cellule tumorali utilizzando un saggio di elettroforesi a singola cellula, chiamato anche saggio della cometa. Questa procedura è un senso per misurare i quattro studi tossicologici genetici. Ed è applicabile a diverse valutazioni, come la selezione precoce di farmaci candidati e la ricerca fondamentale sul danno al DNA e la riparazione.

Questa tecnica fornisce un modo diretto per valutare quantitativamente il danno al DNA. Inoltre, è efficiente, facile da eseguire e relativamente economico. Preparare l'agarosio per il rivestimento in vetrino sciogliendo l'uno per cento di agarosio in un forno a microonde per due o tre minuti o fino a quando l'agarosio non è completamente fuso.

Immergere un vetrino da microscopio nell'agarosio e utilizzare un panno privo di lanugine per pulire un lato del vetrino. Appoggiare il vetrino su una superficie piana per farlo asciugare all'aria. Dopo l'essiccazione si dovrebbe formare un film di agarosio trasparente.

Posizionare i vetrini rivestiti a 37 gradi Celsius prima dell'uso. L'effetto terapeutico della chemioterapia è valutato in cellule di glioma U251 coltivate in terreno DMEM/Ham F-12 integrato con il 10% di FBS, 100 unità per millilitro di penicillina e 10 microgrammi per millilitro di streptomicina. Digerire le cellule usando un millilitro di tripsina per tre minuti, quindi neutralizzare la tripsina utilizzando il terreno DMEM/Ham F-12 con FBS.

Raccogli le cellule in una provetta da 15 millilitri. E gira a 300 volte G per quattro minuti. Aspirare il terreno.

E sospendere le cellule a due volte da 10 a 5 cellule per millilitro in 1x PBS. Le cellule e devono essere preparate immediatamente prima di iniziare il saggio. E il dovrebbe essere gestito al buio.

Il tutto in penombra per evitare danni. Combinare la sospensione cellulare con l'uno per cento di agarosio fuso a basso punto di fusione con un rapporto in volume di uno a 10. Mescolare delicatamente pipettando su e giù.

E pipettare immediatamente 30 microlitri su un vetrino. Utilizzare il vetrino della punta della pipetta per stendere la miscela di agarosio per garantire la formazione di uno strato sottile. Posizionare i vetrini in piano a quattro gradi Celsius, al buio, per 10 minuti.

Immergere i vetrini in una soluzione di lisi a quattro gradi Celsius, al buio per un'ora o tutta la notte. Per il saggio della cometa alcalina, rimuovere delicatamente i vetrini dalla soluzione di lisi, drenare il liquido in eccesso e immergere delicatamente i vetrini in AES, al buio a quattro gradi Celsius per un'ora per consentire lo svolgimento del DNA. Aggiungere AES pre-raffreddato nel vassoio per vetrini per elettroforesi.

Non superare 0,5 centimetri sopra le diapositive. Posizionare i vetrini all'interno e coprire con un tappo. Impostare la tensione di alimentazione a un volt per centimetro e far funzionare a quattro gradi Celsius per 30 minuti.

Al termine dell'elettroforesi, drenare l'AES in eccesso dai vetrini. Immergere delicatamente i vetrini due volte in acqua distillata a temperatura ambiente per cinque minuti ogni volta. Successivamente, immergere delicatamente i vetrini in etanolo al 70% a temperatura ambiente per cinque minuti.

Per il saggio della cometa neutra, rimuovere delicatamente i vetrini dalla soluzione di lisi, drenare il liquido in eccesso e immergere delicatamente in NES al buio, a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere il NES pre-raffreddato nel vassoio per vetrini per elettroforesi, non superando 0,5 centimetri sopra i vetrini. Posizionare i vetrini all'interno e coprire con un tappo.

Impostare la tensione di alimentazione a un volt per centimetro e far funzionare a quattro gradi Celsius per 45 minuti. Drenare il tampone in eccesso dai vetrini. Immergere delicatamente i vetrini nella soluzione di precipitazione del DNA a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, immergere delicatamente i vetrini in etanolo al 70% a temperatura ambiente per 30 minuti. Iniziare questa procedura asciugando i vetrini al buio a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Quindi, posizionare 50-100 microlitri di soluzione colorante di acido nucleico fluorescente verde sull'agarosio essiccato di ciascun vetrino e colorare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.

Sciacquare brevemente i vetrini in acqua distillata e asciugarli completamente a 37 gradi Celsius al buio. Eseguire l'acquisizione e l'analisi delle immagini subito dopo aver colorato i vetrini della cometa. Posizionare un vetrino sotto un microscopio a fluorescenza con un supporto per vetrini.

Seleziona la lente dell'obiettivo 10X e assicurati che il gel di agarosio sia rivolto verso la lente dell'obiettivo. Cattura casualmente le immagini di ogni diapositiva di cometa colorata. Evitare i bordi e le aree intorno a eventuali bolle d'aria.

Assicurati che ogni coda di cometa sia distribuita orizzontalmente. Le teste delle comete dovrebbero provenire da sinistra e la coda da destra. Salva ogni immagine in un formato binario tivo con colorazione del DNA brillante e sfondo scuro.

Per l'analisi delle immagini, caricare prima tutte le immagini sul software di analisi delle comete, utilizzando il pulsante Seleziona file da analizzare, che si trova a sinistra della barra degli strumenti. Dovrebbe apparire una finestra di visualizzazione dell'immagine. Disegna un fotogramma di misurazione sullo schermo e regola le sue dimensioni in base alla cometa della cella.

Fare clic su Regola per impostare la soglia della testa, della cometa e della coda, in base all'immagine. E quindi fare clic su Avvia misurazioni. Selezionare una cella utilizzando il riquadro e attivare la misurazione facendo clic sul pulsante Saggia la cometa.

Sulla finestra dei profili verrà visualizzata un'immagine dell'intensità, con i parametri di misurazione selezionati. Salva i risultati facendo clic sul pulsante Memorizza risultati. Analizzare almeno 50 cellule per trattamento.

I risultati dei saggi sulle comete alcaline e neutre mostrano che le code delle comete delle cellule UT51 trattate con doxorubicina erano più lunghe e avevano una maggiore intensità di DNA, suggerendo un sostanziale accumulo di DNA frammentato. L'analisi quantitativa per il test della cometa alcalina o neutra, ha mostrato un aumento significativo della formazione di coda della cometa, dopo i trattamenti con doxorubicina, indicando un danno al DNA. Un trattamento combinato di un inibitore di PARP, olaporib, e di un agente alchilante, temozolomide, ha aumentato significativamente il danno al DNA nelle cellule di glioma, riflesso dall'aumento della lunghezza e dell'intensità del segnale della coda della cometa.

Olaporib da solo non ha introdotto danni al DNA. Dove ha potenziato l'effetto genotossico di temozolomide. Immagini rappresentative di cellule di glioma sottoposte a trattamenti singoli e combinati, hanno mostrato le code di cometa più lunghe e di intensità più elevata delle cellule trattate con temozolomide e olaporib.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore, se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della genotossicità per misurare le rotture delle stringhe di DNA in molti tipi di cellule ucariotiche. Come le cellule in coltura o le cellule isolate da organismi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il test della cometa per studiare l'efficacia di un agente genotossico a livello di singola cellula. Non dimenticare che lavorare con il reagente per i danni può essere estremamente pericoloso. E le precauzioni, come indossare un camice da laboratorio e guanti, dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.