Name: Creazione di modelli murini per disturbi neurologici indotta da Virus di Zika utilizzando strategie di iniezione intracerebrale: embrionale, neonatale e adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Scopri come creare modelli murini per l'infezione cerebrale da virus Zika utilizzando iniezioni intracerebrali in embrioni, neonati e adulti. Questo metodo chirurgico permette di studiare la patogenesi virale e le terapie per la microcefalia.

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Gli autori desidera ringraziare il Dr. Abdellatif Benraiss presso l'Università di Rochester per il suo mentore e discussioni rilevanti per imparare le tecniche di neonato e adulto chirurgica. Gli autori inoltre desidera ringraziare Dr. James Lauderdale a UGA per l'uso delle sue apparecchiature stereotassiche e discussioni legate alla impostazione della metodologia per questa tecnica e l'avanzamento per la Fondazione di ricerca College scienziati (archi) per loro supporto e il nostro supporto di NIH (NINDS concede & F99NS105187-01 R01NS096176-02, R01NS097231-01).

Tutti gli animali utilizzare protocolli seguire le indicazioni di cura degli animali della University of Southern California e l'Università della Georgia. Metodi di eutanasia per dighe incinte e adulti vengono eseguite secondo protocolli approvati: asfissia di anidride carbonica, seguita da dislocazione cervicale come metodo secondario affinché l'eutanasia. Cuccioli neonatali sono euthanized per decapitazione.
Attenzione: Il seguente protocollo coinvolge manipolano un virus patogeni. Corretta precauzione dovrebbe essere presa mentre si maneggia il virus. Tutti i protocolli devono essere approvati dal Priore Comitato istituzionale appropriato da utilizzare.
1. embrionale inoculazione intracerebrale di Virus di Zika
<ol><li>Per l'accoppiamento incinta temporizzata, considera mezzogiorno del giorno dopo l'accoppiamento come 0.5. Coppia di topi alla fine della giornata e controllare le spine al mattino presto per ridurre la variabilità del tempo accoppiamento.</li>
	<li>Preparare l'ago di vetro prima dell'intervento chirurgico. Estrarre l'ago e la lunghezza di taglio a 1/3, quindi affinare un'angolazione di 45°, utilizzando una smerigliatrice micropipetta con una goccia d'acqua fino a quando il poro è dimensionato per 50-70 µm. Check punte dell'ago sotto uno stereoscopio per qualità e rottura.</li>
	<li>Tenere il virus aliquota sul ghiaccio. Appena prima dell'intervento, è necessario caricare il mix di iniezione di ZIKV nell'ago per iniezione vetro preparato. Montare la siringa a tenuta di gas (50 µ l di volume), attacco luer-lock e tubi e saturare la siringa assemblata con il tubo con olio minerale. Una volta saturato, inserire l'ago e disegnare ~ 6-7 µ l ZIKV nell'ago (~ 1 µ l è 1,7 × 106 TCID50/mL).</li>
	<li>Iniettare incinta C57BL/6J o 129S1/SvImJ topi con embrioni e 14.5 giorno embrionale (per iniezione intracranica) o gli embrioni e 10.5 (per iniezione intrauterina) con ketamina cloridrato (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg) diluito in soluzione salina sterile per via intraperitoneale per indurre l'anestesia nella madre. In alternativa, anestetizzare le madri con isoflurano isoflurano monitorato fornito da inalazione, con evacuazione dei gas di scarico, se del caso. Iniettare buprenorfina-SR (0.5-1.0mg/kg) per via sottocutanea per indurre l'analgesia.</li>
	<li>Prova di pizzico anestetizzati madri sulla punta o la coda e poi stendetele supina su un rilievo di riscaldamento animale-autorizzato (pad termico 2,5 100 x 200 mm). Il forcipe di pizzico di punta non sono sterile e non sono abituato a gestire dei tessuti in chirurgia. In alternativa, le mani guantate possono essere utilizzate per verificare il riflesso di ritiro pizzico di punta. Nota: Fare riferimento al vostro personale veterinario istituzionale per la perioperative comodo metodo di riscaldamento. Una cover è stata posta tra la pastiglia di riscaldamento e l'animale.</li>
	<li>Aggiungere unguento oftalmico agli occhi.</li>
	<li>Radere la superficie dell'addome e sterilizzare con iodio e alcol tre volte. Alternare le salviettine alcool e iodio; strofinate delicatamente con movimento circolare dal sito chirurgico.</li>
	<li>Drappo la pelle che circonda il sito chirurgico con panni sterili per evitare la contaminazione della incisione e degli strumenti. Nota: L'apertura di drappeggio non deve superare il sito chirurgico preparato; capelli non dovrebbero essere visto nell'apertura di drappeggio.</li>
	<li>Pizzicare la pelle della madre dal suo addome con una pinza e taglio basso addome in una linea di 1-1,5 cm alla linea sagittale mediale con forbici chirurgiche sterili. Questo tagli nella pelle e maggiori nella cavità addominale in modo che gli embrioni sono ora esposti. Nota: Forbici chirurgiche vengono utilizzate per incidere la pelle e lo strato peritoneale. Guanti e strumenti sterili vengono utilizzati per ogni intervento chirurgico.</li>
	<li>Tagliare una fessura nel mezzo di una piccola garza sterile e applicare sulla parte superiore dell'apertura chirurgica. Idratare con soluzione salina sterile. Tirare gli embrioni attraverso la fessura di riposare su garza sterile, con cura di non rimuovere più di 4-5 embrioni concentrandosi su un corno uterino in una sola volta.</li>
	<li>Idratare gli embrioni con soluzione salina sterile prima di e durante l'inoculazione affinché che non si asciugano. Tenere traccia di quali embrioni vengono iniettati e la loro posizione all'interno del corno uterino. Individuali degli embrioni sono pertanto considerati esperimenti separati, come embrioni non cambiare posizione durante lo sviluppo in utero. (Continua al passo 1.15 per iniezione intrauterina).</li>
	<li>Posizionare delicatamente una spatola sotto la testa dell'embrione. Illuminare gli embrioni bene con una lampada per visualizzare i punti di sutura testa e cranio. Nota: Una tecnica asettica è seguita, tra cui strumenti e guanti chirurgici sterili. Dopo gli elementi non sterili (ad esempio la lampada) sono manipolati, guanti devono essere sostituiti con nuovi guanti sterili prima di gestire strumenti sterili e aree.</li>
	<li>Posizione la testa manipolando l'embrione con la lampada (dietro la testa per visibilità) e dita gratuite fino a quando la testa dell'embrione è spinto verso l'alto direttamente contro la parete uterina e tenuta in posizione con la mano non dominante. Nota: Posizionamento dell'embrione è una parte fondamentale e la tecnica che prende la maggior parte pratica. Troppa pressione con le dita può danneggiare le membrane embrionali che conduce a letalità e pressione non sufficiente può rendere difficile l'iniezione.</li>
	<li>Utilizzare i vasi sanguigni che corrono lungo la sutura del cranio come guida. Iniettare il virus ZIKV (~ 1 µ l, 1,7 × 106 TCID50/mL messicano isolare MEX1-44) nei ventricoli laterali del cervello embrionale e 14.5 assemblato siringa e l'ago. Utilizzare mezzi di controllo come una finta iniezione.</li>
	<li>Per migliorare la ritenzione della gravidanza, evitare l'iniezione virale di due embrioni accanto le ovaie e i due embrioni accanto alla vagina superiore (Figura 1A). Nel complesso, non più di 6 embrioni vengono iniettati per figliata per ridurre i tempi della chirurgia e prevenire la perdita dell'embrione.</li>
	<li>Inserire nuovamente gli embrioni iniettati le dighe incinte e riempire la cavità addominale con ~ 0,5 mL di soluzione di fisiologica sterile. Per chiudere, prima sutura sia il muscolo peritoneale addominale e poi in secondo luogo suturare lo strato esterno della pelle con 4,0 suture sterili. È preferibile utilizzare suture interrotte; C'è possibilità di deiscenza della ferita, se il mouse mastica la sutura.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una gabbia parzialmente che riposa su un rilievo di riscaldamento per consentire il mouse sfuggire a una zona non riscaldata, se necessario. Monitorare le madri mentre recuperano (1-2 h) dall'anestesia. Gli embrioni si sviluppano dopo chirurgia per varie volte secondo singoli esperimenti.</li>
	<li>
Iniezione intrauterina
	<ol>
<li>Con un corno uterino ed embrioni esposti, è necessario utilizzare un ago di siringa e 27G di 1 mL per iniettare il virus di Zika 100 μL (106 TCID50 unità sospesa in 100 μL di DMEM), o controllo medio, nello spazio intrauterino o nel tessuto placenta. Si noti che gli embrioni sono stati iniettati per le dissezioni stadio embrionale. Vedere il lavoro precedentemente pubblicato per più dettagli18.</li>
		<li>Inserire nuovamente embrioni iniettati le dighe incinte e riempire la cavità addominale con ~ 0,5 mL di soluzione di fisiologica sterile. Per chiudere, prima sutura del muscolo addominale peritoneale e poi in secondo luogo suturare lo strato esterno della pelle con 4,0 suture sterili. È preferibile utilizzare suture interrotte; C'è possibilità di deiscenza della ferita, se il mouse mastica la sutura.</li>
		<li>Posizionare il mouse in una gabbia parzialmente che riposa su un rilievo di riscaldamento per consentire il mouse sfuggire a una zona non riscaldata, se necessario. Monitorare le madri mentre recuperano (1-2 h) dall'anestesia. Gli embrioni si sviluppano dopo chirurgia per varie volte secondo singoli esperimenti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. neonatale inoculazione intracerebrale di Virus di Zika: P0/P1
<ol><li>Assicurarsi che le siringhe a tenuta di gas (10 µ l di volume) e gli aghi non siano ostruiti. Pulire e provare caricando tre siringhe monouso da 20 mL con aghi 26-gauge: uno con soluzione fisiologica, uno con etanolo al 70% e uno con aria per cancellare le soluzioni. Sterilizzare con candeggina al 10% se utilizzato in precedenza per l'iniezione di virus.</li>
	<li>Mantenere il virus sul ghiaccio. Caricare la siringa riempiendolo con soluzione fisiologica per ridurre il volume morto nella siringa e disegnare 0,75 µ l di aria per separare la soluzione salina dal materiale di iniezione.</li>
	<li>Istituire una camera riscaldata umidificata recupero per cuccioli iniettati. Utilizzo di un blocco di riscaldamento, posizionare un contenitore closeable (ad esempio una casella di punta vuota) con una garza sterile e umidificare con soluzione fisiologica. Preriscaldarlo prima di iniziare le iniezioni.</li>
	<li>Impostare il microinjector compreso la pompa e il controller. Determinare il codice del tipo di dispositivo per la siringa specifico (vale a dire, per una siringa 10 µ l, il tipo di dispositivo è "D"). Determinare la velocità di iniezione.</li>
	<li>Raccogliere i cuccioli postnatale giorno 0 o 1 (P0/P1) vicino l'installazione chirurgica. Caricare la siringa di iniezione con virus. Disinfettare il Monte testa pup con 70% EtOH.</li>
	<li>Avvolgere i cuccioli in un sottile strato di garza e seppellirli completamente in ghiaccio per raggiungere uno stato di anestetico. I cuccioli sono cryoanesthetized per 5 min, assicurarsi che i cuccioli sono sufficientemente anestetizzati per iniezione eseguendo un pizzico di coda/punta senza risposta. Questo produce circa 15 min di un stato di anestesia.</li>
	<li>Posizionare il cucciolo sul Monte testa, sterilizzare la superficie della testa con iodio e, etanolo (tre volte) e quindi asciugare con un panno sterile (isopropanolo o 70% EtOH).</li>
	<li>Lambda di segnare con un pennarello nero e registrare le coordinate a lambda utilizzando lo strumento stereotassica. Misurare la distanza da lambda al bordo dell'occhio e inizio dalle coordinate stereotassiche di lambda calcolare la distanza di 2/5 da lambda all'occhio (per entrambi gli emisferi se si inietta entrambi).</li>
	<li>Ricontrollare la profondità anestetica prima di creare un foro per il sito di iniezione. Usi un ago 26-gauge per attentamente e superficialmente perforare il cuoio capelluto e il cranio nella posizione di iniezione (il cranio è molto morbido in neonati) per creare un'apertura per l'inserimento dell'ago.</li>
	<li>Abbassare l'ago per iniezione nella posizione forata e una volta che l'ago ha appena violato la pelle, calcolare una profondità di 1 mm per il sito di iniezione (ventricolo laterale) utilizzando lo strumento stereotassica.</li>
	<li>Una volta che l'ago si abbassa fino alla profondità di iniezione, programmare il microinjector per iniettare: 1 µ l di virus, ad un tasso di 10 nL/s, iniettare circa 1 µ l oltre 1,5 min (~ 1 μl e 3,4 x 105 TCID50/mL ZIKV).</li>
	<li>Quando termina l'iniezione, attesa 30 s e ritrarre l'ago in incrementi di 0,5 mm mediante rotazione della vite (dorsalmente), in attesa 30 s dopo ogni incremento. Nota: Questo riduce la perdita di virus iniettato.</li>
	<li>Una volta rimosso, uno rapidamente caricare l'ago e la siringa con altri virus (virus diversi o finti controlli devono essere caricati in siringhe/aghi separati) o rimuovere il programma potenzialmente indesiderato dal Monte testa alla camera umidificata pre-riscaldata. Monitorare il cucciolo ogni pochi minuti per misurare il recupero. Sostituire i cuccioli con sua lettiera.</li>
</ol>3. adulto inoculazione intracerebrale di Virus di Zika
<ol><li>Iniettare topi adulti, intraperitonealmente con ketamina cloridrato (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg), diluiti in soluzione salina sterile per indurre l'anestesia. Iniettare buprenorfina-SR (0.5-1.0mg/kg) per via sottocutanea per indurre l'analgesia. Punta/coda pizzicare il mouse per garantire il suo stato di anestesia e successivamente montarla sullo strumento stereotassica (con un rilievo di riscaldamento) per immobilizzare la testa durante la chirurgia.</li>
	<li>Aggiungere unguento oftalmico agli occhi per evitare che gli occhi del mouse secchino durante la chirurgia. Radere il cuoio capelluto a partire dietro gli occhi all'inizio delle orecchie. Sterilizzare la pelle esposta con iodio e 70% EtOH tre volte. Alternare le salviettine alcool e iodio; strofinate delicatamente con movimento circolare dal sito chirurgico.</li>
	<li>Ricontrollare la profondità anestetica prima di pungere la pelle. Usando un bisturi, praticare un'incisione di 0,5 cm lungo la linea sagittale mediale della testa nella posizione sterilizzata, esponendo il bregma. Utilizza un movimento di rotolamento con un applicatore con punta di cotone, cancellare la superficie del cranio dei tessuti meningei, spingendo contemporaneamente la pelle lontano dai siti di iniezione.</li>
	<li>A partire da bregma, allineare la punta del trapano chirurgico e identificare i siti di iniezione utilizzando le seguenti coordinate: AP mm-0,50, ML: + /-1,5 mm. usando il pedale di controllo, forare il cranio lentamente da forare solo osso fino a quando un foro è stato cancellato per l'ago.</li>
	<li>Sostituire il trapano con la pompa di microinjector e la siringa a tenuta di gas (10 µ l di volume) sulla stereotassica. Lasciando una piccola bolla d'aria tra la soluzione salina e il virus, disegnare ~ 4-5 µ l di virus. Determinare il codice del tipo di dispositivo per il volume della siringa specifici (vale a dire, D per siringa di volume 10 μL). Abbassare l'ago a DV:-1,50 mm dalla superficie del cervello. Per iniettare 1 µ l di virus, programmare un tasso di 10 nL/s, iniettare circa 1 µ l oltre 1,5 min.</li>
	<li>Quando termina l'iniezione, attesa 30 s e rimuovere l'ago in incrementi di 0.5 mm, in attesa di 30 s dopo ogni turno. Questo riduce il riflusso e dispersione del virus iniettato.</li>
	<li>Al termine il gruppo, utilizzare pinze per allentare la pelle e ripristinare il cranio esposto. Sutura del cuoio capelluto utilizzando 4,0 suture e rimuovere il mouse dallo strumento stereotassica. Posto il mouse in una gabbia parzialmente che riposa su un rilievo di riscaldamento per consentire il mouse sfuggire a una zona non riscaldata se necessario e monitorare mentre recuperano (1-2 h) dall'anestesia.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui descritto è un metodo per inoculazione intracerebrale della ZIKV per l'indagine sui danni indotti da ZIKV nello sviluppo del cervello nella fase embrionale, neonatale e adulto. Mentre semplice, ci sono alcune considerazioni che gli investigatori devono prendere per garantire la qualità dello studio e la sicurezza delle persone coinvolte.
DENV è collegato strettamente a ZIKV del genere flavivirus. DENV causale non è stato collegato con i disordini cerebrali pediatrici in esseri umani. DENV2...

La microcefalia è una circostanza derivando dallo sviluppo di cervello difettoso caratterizzato da minore dimensione media testa nei neonati. Bambini con microcefalia esibiscono una gamma di sintomi che possono includere ritardo inerente allo sviluppo, il sequestro, disabilità intellettiva, perdita dell'udito, problemi di visione e problemi con il movimento e l'equilibrio, tra gli altri, a seconda della gravità della malattia e causa1,2,3. Questa condizione è multifattoriale in natura, con agente di genetica, infettiva e fattori ambientali legati a causare la microcefalia4,5,6,7,8, 9. Prima dello scoppio del 2015-2016 ZIKV, 8 bambini su 10.000 nascite sono stati diagnosticati con microcefalia negli Stati Uniti secondo il CDC10. Su 1 febbraiost del 2016 l'organizzazione mondiale della sanità ha dichiarato il virus di Zika una preoccupazione di sanità pubblica emergenza di internazionale dovuto l'allarmante aumento nelle diagnosi di microcefalia associata con l'infezione in madri11, ZIKV 12. Un recente studio del CDC su casi ZIKV negli Stati Uniti suggerisce che i risultati di infezione materne ZIKV in un rischio aumentato di 20 volte per un bambino a sviluppare microcefalia rispetto ai soggetti non infetti e il 4% delle madri ZIKV infettati dagli Stati Uniti hanno portato a bambini con microcefalia11. Il tasso di difetti alla nascita associata a microcefalia durante la gravidanza dall'infezione di ZIKV in Brasile sono stati segnalati per avere influenzato fino al 17% dei neonati di madri infette, che indica che altri fattori in America Latina possono contribuire al rischio aumentato 13. mentre sappiamo che la ZIKV può causare microcefalia e patogenesi nei progenitori neurali delle cellule (NPC) popolazione7,8,14, patogenesi completa di ZIKV in via di sviluppo del cervello resta sfuggente. È importante sviluppare modelli animali per indagare ulteriormente i meccanismi di malattia che le anomalie del cervello associate con l'infezione ZIKV.
Per studiare direttamente l'effetto che il ZIKV ha sullo sviluppo del cervello, abbiamo sviluppato un modello del mouse mediante inoculazione intracerebrale del cervello (e 14.5) 14,5 di giorno embrionale con ZIKV7. Questa fase è stato scelto in quanto è considerato rappresentante della fine del primo trimestre di gestazione umana14. I cuccioli possono sopravvivere fino a giorno postnatale 5 (P5) con questo metodo di iniezione intracerebrale embrionale (~ 1 µ l di 1,7 x 106 coltura tissutale dose infettiva (TCID50/mL)). Questi cuccioli postnatali esibiscono una gamma di fenotipi osservati allo stesso modo nei neonati umani infetti compreso ventricoli allargati, perdita di un neurone, rarefazione assonale, astrogliosis e attivazione microglial12,15. Un cervello di topo neonato è relativamente immaturo, simile allo stadio di sviluppo del cervello umano a metà gestazione16, e lo sviluppo del cervello del mouse include una componente importante di postnatale. Per studiare le infezioni successive fase di gestazione, è anche descritto un metodo per l'infezione postnatale. Neonati infettati con ZIKV P1 sono in grado di sopravvivere fino post-all'iniezione 13 giorni. Infezione anima-nati fase adulta è stata descritta nel topo in precedenza17 ma richiede l'uso di fattori la trascrizione del fattore regolatore (IRF) di interferone (IFN) IRF-3, -5, ceppo di knockout triple-7. Questo protocollo descrive un metodo di inoculazione ZIKV intraventricularly aggirare disabilitando la risposta antivirale del modello murino nell'adulto. Mentre questo elude il sistema immunitario murino, questa via di iniezione non imitare direttamente l'itinerario tipico dell'infezione. Per risolvere questa discrepanza direttamente, lo sperimentatore può eseguire un'infezione intrauterina di ZIKV anziché la route intracranica. Adottata dal precedente lavoro18, abbiamo brevemente descritto questa tecnica in questo protocollo di infezione embrionale.
I ceppi di virus di Zika implementati con questa tecnica includono l'isolato messicano MEX1-447,19 e l'africano isolare MR-766 isolato nel 194720. Zika MEX1-44 è stato isolato in Chiapas, Messico nel gennaio del 2016 da un infetto aegypti di Aedes zanzara. Abbiamo ottenuto questo virus con l'autorizzazione tramite l'Università del Texas Medical Branch a Galveston (UTMB). Inoltre, il sierotipo del virus di febbre rompiossa 2 (DENV2) è stato inoculato con questa tecnica in uno studio di confronto. DENV2, ceppo S16803 (sequenza GenBank GU289914), è stato isolato da un campione clinico dalla Thailandia nel 1974 e attraversate in cellule C6/36. Il virus era attraversato due volte in cellule Vero da centro di riferimento mondiale per i virus emergenti e gli arbovirus (WRCEVA) prima di iniezioni del mouse. Ciò dimostra che questa tecnica funziona altrettanto bene per diversi ceppi di ZIKV e altri flavivirus che possono avere un impatto sullo sviluppo del cervello.

<table><tbody><tr><td>Albero di trasmissione flessibile Trapano Motore per appendere</td><td>Leica</td><td>39416001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Stereotax</td><td>Kopf</td><td>04557R</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 Micro4 Microsyringe Pump Controller</td><td>WPI</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 UltraMicroPump</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Modulamp</td><td>Tubo Schott-Luer-lock</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(calibro 19)</td><td>Hamilton</td><td>90619</td><td></td></tr><tr><td>Punto di fusione Capillare</td><td>Kimble</td><td>34500-99</td><td>Ago in vetro</td></tr><tr><td>Fluoro-Max: Microsfere fluorescenti rosse</td><td>Thermo Scientific</td><td>R25</td><td>Nessuna diluizione; Utilizzare per iniezioni pratiche</td></tr><tr><td>10 & micro; L, Modello 1701 LT SYR</td><td>Hamilton</td><td>80001</td><td>per inoculazione embrionale</td></tr><tr><td>10 & micro; L, modello 1701 RN SYR, NDL rimovibile piccolo, 26s ga, 2 pollici, stile punta 2</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td>per neonato/adulto</td></tr><tr><td>4-0 Suture in nylon Ethilon</td><td>Ethicon-Mineral</td> Oil <td>VWR-estrattore</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>per</td></tr> <tr><td>micropipette</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Grinder per micropipette</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Fastgreen FCF Dye</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td>iniettare con anticorpi del gruppo Dye</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flavivirus group</td><td>antigene Millipore</td><td>MAB10216</td><td>ms IgG2a 1:400 (Figura 2, Figura 3)</td></tr><tr><td>Pax6</td><td>DBHB</td><td>Pax6-s</td><td>ms IgG1 1:20</td></tr></tbody></table>

creazione di modelli murini per disturbi neurologici indotta da virus di zika utilizzando strategie di iniezione intracerebrale: embrionale, neonatale e adulto

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Il virus di Zika (ZIKV) è un flavivirus attualmente endemico in Nord, centro e Sud America. È ormai accertato che il ZIKV può causare microcefalia e le anomalie supplementari del cervello. Tuttavia, il meccanismo alla base della patogenesi della ZIKV nel cervello in via di sviluppo rimane poco chiaro. Metodi chirurgici intracerebral sono frequentemente utilizzati in ricerca in neuroscienza per rispondere alle domande su entrambi lo sviluppo normale e anormale del cervello e la funzione del cervello. Questo protocollo utilizza tecniche chirurgiche classiche e vengono descritti metodi che permettono di malattia neurologica umana ZIKV-collegata di modello nel sistema nervoso del mouse. Mentre l'inoculazione diretta del cervello non modella la normale modalità di trasmissione del virus, il metodo consente gli investigatori a fare domande mirate riguardanti la conseguenza dopo l'infezione di ZIKV del cervello in via di sviluppo. Questo protocollo descrive le fasi embrionali, neonatale e adulte di inoculazione intraventricolare di ZIKV. Una volta imparato, questo metodo può diventare una tecnica semplice e riproducibile che dura solo poche ore per eseguire.

Immagini rappresentative dei nostri metodi di iniezione per l'inoculazione di ZIKV del cervello embrionale sono indicati nei diagrammi raffiguranti intracerebrale iniezioni (Figura 1A) e intrauterina e iniezioni di intraplacental (Figura 1B), che illustrano la modo la diga incinta ed embrioni dovrebbero essere guardati e orientati per la chirurgia (protocollo di inoculazione embrionali). Figura 2A es...

Qui descriviamo un metodo per l'instaurazione di un modello di microcefalia indotta da virus di Zika nel topo. Questo protocollo include metodi per inoculazione intracerebrale embrionale, neonatale e adulto-fase del virus Zika.

Creazione di modelli murini per disturbi neurologici indotta da Virus di Zika utilizzando strategie di iniezione intracerebrale: embrionale, neonatale e adulto

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

L'obiettivo generale dei metodi chirurgici qui presentati è quello di stabilire modelli in vivo di infezione intracranica da virus Zika. Questo metodo può aiutare ad affrontare le questioni chiave nel campo, come la patologia e il meccanismo dell'infezione da virus Zika nel cervello sia nella fase iniziale che in quella successiva dello sviluppo, nonché nella fase adulta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'infezione della direzione del cervello può essere facilmente raggiunta.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie o alle diagnosi di microcefalia indotta dal virus Zika o di altri disturbi dello sviluppo neurologico. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla patogenesi del virus Zika, può anche essere applicato per studiare altre infezioni da flavivirus nel cervello, come il virus della dengue. Poco prima dell'intervento chirurgico, caricare la miscela per iniezione del virus Zika in un ago per iniezione di vetro preparato assemblando prima la siringa per iniezione a tenuta di gas da 50 microlitri e il tubo Luer-lock.Saturare la siringa e il tubo assemblati con olio minerale. Una volta saturo, inserire l'ago e aspirare circa sei-sette microlitri di virus nell'ago. Dopo aver anestetizzato una madre incinta di embrioni E14.5, testare la profondità dell'anestesia pizzicando la punta o la coda.Quando si ottiene un piano chirurgico di anestesia, assicurarsi che la diga sia posata supina su un termoforo. Radere la superficie dell'addome e sterilizzare con iodio e alcool tre volte. Coprire la pelle che circonda il sito chirurgico con panni sterili per evitare la contaminazione dell'incisione e degli strumenti.Pizzicare e sollevare la pelle dell'addome con una pinza, quindi utilizzare le forbici sterili per eseguire un taglio da 1 a 1 1/2 centimetro nell'addome inferiore in corrispondenza della linea sagittale mediale ed esporre gli embrioni. Quindi, tagliare una fessura al centro di una piccola garza sterile e posizionarla sopra l'apertura chirurgica. Idratare l'apertura e garzare con soluzione fisiologica sterile.Quindi, tirare gli embrioni attraverso la fessura per appoggiarli sulla garza, facendo attenzione a non rimuovere più di quattro o cinque embrioni contemporaneamente. Idratare gli embrioni con soluzione fisiologica sterile prima e durante l'inoculazione per assicurarsi che non si secchino. Illuminare l'embrione da iniettare con una lampada per visualizzare le suture della testa e del cranio, quindi posizionare delicatamente una spatola sotto la testa dell'embrione da iniettare e manipolare l'embrione fino a quando la testa non viene spinta direttamente contro la parete uterina.Tenere l'embrione in posizione con la mano non dominante. Utilizzare la siringa per iniettare il virus Zika o il mezzo di controllo nei ventricoli laterali del cervello embrionale. Per l'iniezione intrauterina dello stadio E11.5, utilizzare una siringa da un millilitro e un ago calibro 27 per iniettare il virus Zika o un mezzo di controllo nello spazio intrauterino.Per migliorare la ritenzione della gravidanza, evitare di iniettare i due embrioni vicino alle ovaie e i due embrioni vicino alla parte superiore della vagina. Se si esegue un'iniezione intrauterina, iniettare nello spazio intrauterino o nella placenta. Riposizionare gli embrioni nella madre gravida e riempire la cavità addominale con circa 0,5 millilitri di soluzione fisiologica sterile.Sutura sia il muscolo peritoneale addominale che lo strato cutaneo esterno con suture sterili 4-0. Tieni la diga su un termoforo e monitorala mentre ti riprendi dall'anestesia. Scongelare il virus con ghiaccio, quindi caricare la siringa riempiendola di soluzione fisiologica per ridurre il volume morto nella siringa.Aspirare fino a 0,75 microlitri di aria per separare la soluzione salina dal materiale di iniezione. Per allestire una camera di recupero riscaldata e umidificata, posizionare un contenitore richiudibile con una garza sterile su una scatola di calore impostata a 37 gradi Celsius e immergere con soluzione salina. Dopo aver impostato la pompa del microiniettore e il controller, caricare la siringa di iniezione con il virus e sterilizzare il supporto della testa della pompa della configurazione chirurgica con etanolo al 70%.Quindi, dopo aver crio-anestetizzato i cuccioli neonatali per cinque minuti, garantire un'anestesia sufficiente per l'iniezione in caso di mancanza di risposta a un pizzico di coda o dita. Posiziona il cucciolo sul supporto per la testa. Sterilizzare la superficie della testa con iodio, quindi etanolo, quindi asciugare con una salvietta imbevuta di alcol.Segna lambda con un pennarello nero, quindi misura la distanza da lambda al bordo dell'occhio e, utilizzando le coordinate stereotassiche, calcola la distanza di 2/5 da lambda all'occhio. Successivamente, utilizzare un ago calibro 26 per perforare con cura e superficialmente il cuoio capelluto e il cranio nel punto di iniezione e creare un'apertura per l'ago di iniezione. Ora abbassa l'ago per iniezione nel sito di puntura e, una volta che l'ago ha appena violato la pelle, calcola una profondità di un millimetro per l'iniezione nel ventricolo laterale utilizzando lo strumento stereotassico.Una volta che l'ago è stato abbassato alla profondità di iniezione, iniettare un microlitro di virus a una velocità di 10 nanolitri al secondo. Attendere 30 secondi dopo l'iniezione, quindi ritrarre l'ago con incrementi di 0,5 millimetri ruotando la vite dorsalmente, attendendo 30 secondi dopo ogni incremento per ridurre la fuoriuscita di virus iniettato. Dopo aver terminato l'iniezione, trasferire il cucciolo nella camera preriscaldata e umidificata e monitorare fino a quando non si riprende.Immobilizzare la testa di un topo adulto anestetizzato nello strumento stereotassico e posizionare un termoforo sotto il mouse. Dopo un pizzico di punta o coda per assicurare un piano chirurgico di anestesia, radere il cuoio capelluto partendo da dietro gli occhi fino all'inizio delle orecchie. Sterilizzare la pelle esposta con iodio ed etanolo al 70%.Dopo aver praticato un'incisione di 0,5 centimetri lungo la linea sagittale mediale della testa nella posizione sterilizzata per esporre il bregma, liberare la superficie del cranio dai tessuti meningei e contemporaneamente allontanare la pelle dai siti di iniezione. Allineare la punta chirurgica con bregma, quindi identificare il sito di iniezione mediante le coordinate stereotassiche. Usando il pedale di comando, perforare lentamente il cranio fino a quando il foro non è libero per l'ago.Sostituire la punta del trapano con la pompa del microiniettore e la siringa da 10 microlitri a tenuta di gas. Lasciare una piccola bolla d'aria tra la soluzione salina e il virus e aspirare da quattro a cinque microlitri di virus. Abbassare l'ago a 1,5 millimetri sotto la superficie del cervello dalla superficie del cervello e iniettare un microlitro di virus a una velocità di 10 nanolitri al secondo, iniettando un microlitro in 1 minuto e mezzo.Dopo aver rimosso l'ago dal cervello in incrementi come prima, usa una pinza per allentare la pelle e coprire nuovamente il cranio esposto. Una volta che il cuoio capelluto è stato suturato con suture 4-0, rimuovere il mouse dalla stereotassa e monitorare su un termoforo fino al recupero. Le cellule neuro-progenitrici sono immuno-marcate con Pax6, visto in rosso, e con il virus Zika tramite antigeni flavivirus, visto in verde, quattro giorni dopo l'iniezione a E18.5.Il cervello embrionale è infettato dal ceppo MEX1-44 del virus Zika in tutti gli strati della neocorteccia in via di sviluppo. Il test TCID50 che utilizza tessuto del terzo giorno post-natale inoculato a E14.5 mostra che il virus Zika può replicarsi e crescere in modo efficiente nei cervelli in via di sviluppo. Questa immagine mostra l'infezione da virus Zika MEX1-44 nella corteccia cerebrale P13 dopo l'iniezione di P0.Zika viene rilevato utilizzando anticorpi contro l'antigene del gruppo dei flavivirus visto in rosso. Queste immagini mostrano le perle fluorescenti che sono state utilizzate per praticare la posizione dell'iniezione e il successo dell'iniezione del ventricolo laterale negli adulti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di tenere traccia degli embrioni iniettati, di avere controlli appropriati e di mantenere piccole le ferite chirurgiche.Seguendo questa procedura, altri metodi come l'iniezione intraperitoneale o arteriosa possono essere eseguiti per rispondere alla domanda aggiuntiva come il modo in cui il virus Zika attraversa la placenta. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare il modello murino in vivo dell'infezione da virus Zika nel cervello.

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Questo video dimostra la generazione di un modello murino sperimentale di malaria cerebrale. Gli sporozoiti isolati da zanzare femmine infette da Plasmodium berghei vengono iniettati nelle vene della coda di un topo trattenuto, causando l'interruzione della barriera emato-encefalica e l'infiammazione cerebrale, causando la malaria cerebrale. Questo modello murino infetto offre uno strumento prezioso per studiare in vivo la patologia microvascolare associata alla malaria cerebrale.

Generazione di un modello murino di malaria cerebrale sperimentale utilizzando sporozoiti derivati da zanzare ospiti

Questo video dimostra la creazione di un modello in vitro di infezione da virus Zika in un cervello in via di sviluppo. Gli organoidi cerebrali umani contenenti rosette di cellule staminali, cellule progenitrici neurali (NPC) e neuroni sono infettati dal virus Zika. Il virus infetta gli NPC e innesca l'apoptosi, interrompendo lo sviluppo degli organoidi.

Sviluppo di un modello in vitro di infezione da virus Zika in organoidi cerebrali

Questo video dimostra la generazione di un modello murino con un'infezione del SNC. A un cucciolo da latte viene iniettato il virus sia per via intracranica che intraperitoneale. Il virus si diffonde, infettando il SNC causando la morte delle cellule neuronali e l'infiammazione. Il cucciolo viene valutato per i sintomi dell'infezione man mano che la malattia progredisce.

Generazione di un modello murino con un'infezione del sistema nervoso centrale

Il video mostra l'iniezione intracerebrale di sospensione del virus Zika in un topo adulto per indurre la neurodegenerazione. Un topo anestetizzato viene fissato in un telaio stereotassico e viene praticato un foro nel cranio esposto per l'iniezione. Una sospensione del virus Zika viene iniettata nel tessuto cerebrale. L'infezione virale provoca infiammazione, portando alla neurodegenerazione.

Stabilire un modello di neurodegenerazione indotta dal virus Zika in un topo adulto

Questo video mostra una procedura per infettare le cellule staminali neurali fetali umane con il virus Zika. Le cellule infette possono essere utilizzate per ulteriori studi.

Infezione da virus Zika delle cellule staminali neurali fetali

Qui dimostriamo una tecnica per la trasduzione neuronale diffusa mediante iniezione intraventricolare di virus adeno-associato nel cervello del topo neonatale.  Questo metodo fornisce un modo rapido e semplice per ottenere l'espressione permanente dei transgeni veicolati viralmente.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

Questo protocollo descrive una tecnica usata per modellare l'infezione del virus di Zika di sviluppo del cervello umano. Utilizzando wildtype o linee di cellule staminali ingegnerizzati, i ricercatori possono utilizzare questa tecnica per scoprire i vari meccanismi o trattamenti che possono influenzare l'infezione iniziale del cervello e conseguente microcefalia in embrioni di Zika infettati da virus.

Modellazione di infezione del Virus di Zika dello sviluppo del cervello umano In Vitro utilizzando cellule staminali derivate Organoids cerebrale

Questo articolo descrive in dettaglio i metodi che vengono utilizzati per espandere le cellule staminali neurali del cervello fetale umano nella cultura, come pure come per differenziarli in vari sottotipi neuronali e astrociti, con un'enfasi sull'uso delle cellule staminali neurali per studiare l'infezione del virus di Zika.

Infezione del Virus di Zika delle cellule staminali neurali del cervello fetale umano colto per analisi Immunocytochemical

Un protocollo per valutare le risposte delle cellule T antigene-specifiche negli organi nuova di Ifnar1- / - modello murino per l'infezione del virus (ZIKV) di Zika è descritto. Questo metodo è fondamentale per indagare i meccanismi cellulari della protezione e immunopatogenesi di vaccini ZIKV ed è inoltre utile per la loro valutazione di efficacia.

Valutazione delle risposte a cellula T Zika Virus-specifici in organi di nuova di Ifnar1 infetti- / - Mice

Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di un iCR immunocompetente (Istituto di ricerca sul cancro) modello murino di infezione del sistema nervoso centrale per visualizzare lo sviluppo della neuropatia. Il monitoraggio dei disturbi encefalitici virali con punteggi di malattia identici potrebbe essere eseguito per mostrare la neuropatia indotta dal virus dengue in vivo.

Un modello Murine di encefalite virale acuta indotta da virus dengue

L'obiettivo del protocollo è quello di dimostrare le tecniche utilizzate per studiare la malattia virale isolando e quantificando il virus zoika, da più organi in un topo dopo l'infezione.

Isolamento e quantificazione del virus zika da più organi in un mouse

Scopri come creare modelli murini per l'infezione cerebrale da virus Zika utilizzando iniezioni intracerebrali in embrioni, neonati e adulti. Questo metodo chirurgico permette di studiare la patogenesi virale e le terapie per la microcefalia.

Creazione di modelli murini per disturbi neurologici indotta da Virus di Zika utilizzando strategie di iniezione intracerebrale: embrionale, neonatale e adulto (Video) | JoVE Journal

Creazione di modelli murini per disturbi neurologici indotta da Virus di Zika utilizzando strategie di iniezione intracerebrale: embrionale, neonatale e adulto

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