Name: Frazionamento subcellulare per lattivazione di ERK previo trattamento di Peptide derivato mitocondriale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Impara il frazionamento subcellulare per analizzare l'attivazione di ERK in cellule SH-SY5Y e HEK293 trattate con peptidi derivati mitocondriali. Questo metodo identifica le vie di segnalazione attivate e la localizzazione delle fosfoproteine.

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Questo lavoro è stato supportato da un Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship nel programma di ricerca di invecchiamento di SJK, e un premio della Fondazione Glenn e NIH concede a PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Tutti gli autori compaiono nel film.

1. peptide trattamento alle cellule <ol><li>piastra 2 milioni di SH-SY5Y o cellule HEK293 (2 x 10 6) in 10 cm piatto e coltivano per 2 giorni</li> <li>(opzionale) il prossimo giorno, lavare le cellule con Dulbecco privo di siero &#39; s Modified Eagle media Medium (DMEM) una volta e incubare con siero DMEM gratuito durante la notte se il trattamento deve essere fatto in media liberi del siero.</li>
	<li>Il giorno 3, sciogliere S14G-humanin peptidi in 0,2 µm filtrata, acqua distillata e rinvenire come soluzione di riserva di 1mM. 
	Nota: I peptidi devono essere disciolto in solvente appropriato, che può essere determinato dalle caratteristiche di sequenza del peptide (ad es., carica complessiva) e può essere fornito dal produttore se i peptidi sono disponibili in commercio. Ad esempio, S14G-humanin, SHLP2 e SHLP6 e MOTS-c si dissolvono in acqua. Aliquotare i peptidi in un volume adeguato (ad es., 50 µ l) per evitare di congelare e scongelare i cicli. Una volta scongelato, non utilizzarli ancora.</li>
	<li>Aliquota il siero pre-riscaldato-contenente o media del siero-liberi in un conico da 50 mL tubo e aggiungere la soluzione di riserva 1 mM temperatura ambiente per trasformarlo in una concentrazione di lavoro (ad esempio, 1 µM, 10 µM).</li>
	<li>Sostituire il supporto con 6 mL di soluzione del peptide da passo 1.4. Incubare le cellule per la giusta quantità di tempo. 
	Nota: Scegliere il tempo di incubazione a seconda della condizione che attiva ERK.</li>
</ol> 2. Frazionamento subcellulare di citoplasma e nucleo <ol><li>lavare le cellule due volte con 10 mL di PBS ghiacciata, raschiare le cellule fuori la piastra in 5 mL di PBS ghiacciata e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirare il PBS e risospendere il pellet in 200 µ l di tampone di frazionamento ghiacciata, (pH di 10 mM HEPES = 7.6, 3 mM MgCl 2, 10mm KCl, 5% (v/v) glicerolo, 1% tensioattivi non ionici (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) n), inibitori delle proteasi/fosfatasi). 
	Nota: Per mantenere le proteine nel loro stato di fosforilazione, l'inibitore della fosfatasi come bene come proteasi inibitore deve essere appena aggiunto e campioni devono essere tenuti sul ghiaccio a tutti i tempi. Ripetendo il blocco e thaw cicli di campioni devono essere evitati. Aliquotare campioni in piccola quantità (ad es. 50 μg) prima del loro congelamento a -80 ° C.</li>
	<li>Incubare risospeso in ghiaccio per 15 minuti e poi Centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante come la frazione citoplasmatica e tenere il pellet per frazione nucleare.</li>
	<li>Centrifugare il surnatante per rimuovere i detriti cellulari e altri contaminanti a 18.000 x g per 10 min a 4 ° C e poi trasferire il surnatante in un nuovo tubo del microcentrifuge. Questa è la frazione di citosol.</li>
	<li>Risospendere il pellet in tampone ghiacciata di 200 μL (10 mM a pH HEPES = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerolo, 0,2 mM EDTA, inibitori delle proteasi/fosfatasi) e centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in tampone di estrazione ghiacciata, nucleare 100 μL (pH di 20 mM HEPES = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerolo, 0,2 mM EDTA, inibitori delle proteasi/fosfatasi) e Sonicare 10 volte (5 s, 10 s sconto 30% amp.) il ghiaccio</li>
	<li>Centrifugare a 18.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Si tratta di frazione nucleare.</li>
	<li>Quantificare la quantità di proteina usando un'analisi BCA</li></ol>
 3. frazione mitocondriale grezza <ol><li>lavare le cellule in ogni piatto di 10 cm con 10 mL di PBS freddo, aggiungere 5 mL di PBS ghiacciata e staccare le celle utilizzando un raschietto cell. 
	Nota: Utilizzare tre piatti di 10cm di cellule per ottenere una buona resa dei mitocondri per Western Blotting.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e combinare tutto da tre piatti di 10cm in una provetta conica da 15 ml.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 600 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirare il PBS e risospendere il pellet in 1 mL di buffer di isolamento mitocondri ghiacciata (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM di saccarosio, regolare a pH = 7,4).</li>
	<li>Omogeneizzare le cellule con 25 colpi di un omogeneizzatore 2 mL con il pestello rivestito politetrafluoroetilene su Ice. 
	Nota: Questo passaggio è fondamentale per mantenere l'integrità mitocondriale e massimizzare la resa della frazione mitocondriale. Il numero dei tratti deve essere ottimizzato per ogni tipo di cellula. Preraffreddare l'omogeneizzatore prima di iniziare la procedura.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato a un tubo del microcentrifuge ed e centrifugare a 600 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere i nuclei ed ininterrotte cellule.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante, trasferirlo in un nuovo tubo del microcentrifuge e centrifugare a 7.000 x g per 10 min a 4 ° C. 
	Nota: Il pellet è allentato, raccogliere il surnatante con cura e cercare di non disturbare il pellet.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante, risospendere il pellet con 200 μL di tampone di isolamento mitocondri ghiacciata e trasferire la soluzione in un nuovo tubo del microcentrifuge. Centrifugare la provetta a 7.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ripetere il punto 3.8 a lavare la pallina. Non è necessario trasferire il surnatante in un nuovo tubo del microcentrifuge in questo passaggio.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante dal pellet lavato e risospendere il pellet contenente i mitocondri con 50 μL di tampone RIPA.</li>
	<li>Incubare la sospensione in ghiaccio per 10 min.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione a 16.000 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Questa è la frazione mitocondriale.</li>
	<li>Quantificare la quantità di proteina usando un'analisi BCA.</li>
</ol> 4. Western Blotting per fosfo-specifici proteine <ol><li>eseguire un'elettroforesi del gel di SDS-poliacrilammide (8-16% preconfezionati gel) e la proteina di trasferimento di una membrana PVDF 4.</li>
	<li>Incubare la membrana con 5% BSA in TBST (0,1% polisorbato 20) per 30 min a temperatura ambiente per bloccare i siti di legame non specifico background. 
	Nota: Per il rilevamento di proteina fosforilata, bloccare la membrana con BSA non latte. Il latte contiene caseina, una fosfoproteina abbondante, che si traduce in alto segnale aspecifico.</li>
	<li>Incubare la membrana con l'anticorpo primario (anti-fosfo-ERK1/2) a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, lavare la membrana con TBST (0,1% polisorbato 20) tre volte per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare la membrana con anticorpo secondario (anti-coniglio HRP) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la membrana con TBST (0,1% polisorbato 20) tre volte per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare la membrana con soluzione di ECL e la membrana nell'analizzatore dell'immagine di immagine.</li>
	<li>Striscia la membrana con stripping buffer per 15 min a temperatura ambiente e lavare la membrana con TBST tre volte per 5 min.</li>
	<li>Ripetere i punti da 4.2 a 4.7 usando l'anticorpo di anti-totale ERK1/2.</li>
	<li>Per verificare la purezza di ogni frazione, eseguire SDS-PAGE ed eseguire immunoblots utilizzando anticorpi che riconoscono i marcatori per ogni vano (ad es., Liuzzi B1 per nucleo, GAPDH per cytosol e TOM20 per i mitocondri).</li>
</ol>

<ol><li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334(2009).</li>
<li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li>
<li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1%2F2%2C+AKT%2C+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li>
<li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+kinases+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).</li>
<li>Cagnol, S., Chambard, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+and+cell+death%3A+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis%2C+autophagy+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li>
<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li>
<li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK%3A+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li>
<li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+%28NTS%29+paves+a+way+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+ERK%2FMAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li>
<li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15589366">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li>
<li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+%28ERK1c%29%2C+a+novel+42-kilodalton+ERK%2C+demonstrates+unique+modes+of+regulation%2C+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li>
<li>Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphorylated+ERK%2FMAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li>
<li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis%2C+insulin+sensitivity%2C+and+inflammatory+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li>
<li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat+family+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li>
<li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).</li>
<li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25951043">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li>
<li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer%27s+disease-relevant+insults%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li>
</ol>

Pinchas Cohen è un azionista e consulente per Kelvin CohBar, Inc., lo Yen ha servito come un consulente per CohBar, Inc.

Qui, abbiamo dimostrato che humanin peptide-ha mediato l'attivazione di ERK1/2 si verifica a due diversi tipi di cellule, e la localizzazione subcellulare di attivazione di ERK1/2 può essere diversa a seconda delle condizioni (ad es., dose di peptide, punto del tempo e delle cellule tipo). È stato dimostrato che humanin segnali attraverso due diversi recettori22,23, che possono spiegare le differenze nella segnalazione tra le due linee cellulari come pur...

Gli studi emergenti indicano che peptidi mitocondriali-derivati (MDPs) svolgono i ruoli importanti nel metabolismo e nella citoprotezione1,2,3. Capire la via di trasduzione del segnale in presenza di MDPs ci dà comprensione nel meccanismo da cui MDPs modulano varie funzioni. Il primo MDP identificati, humanin, ha dimostrato di aumentare la chinasi segnale-regolata extracellulare 1/2 (ERK1/2) fosforilazione attraverso suo recettore vincolante4,5. Tuttavia, l'effetto a valle dell'attivazione di ERK1/2 è ancora aggiunto.
La cascata di ERK1/2 serve come un mediatore essenziale in una varietà di processi cellulari compreso proliferazione, migrazione cellulare, il metabolismo cellulare, sopravvivenza ed apoptosi6,7,8. Ad per orchestrare tutti questi processi cellulari distinti, l'attività e la localizzazione subcellulare di ERK1/2 sono strettamente regolate da fosfatasi e impalcatura proteine9,10. Oltre a modificazione post-traduzionale, la dinamica di marcia di ERK1/2 inoltre regola la sua segnalazione funzione, attività e specificità11,12. ERK1/2 è localizzato principalmente nel citosol13. Un insieme delle proteine di ancoraggio e impalcatura aiutano a trattenere ERK1/2 in elementi del citoscheletro, sulla superficie degli organelli, o diffusa nel citoplasma13. Stimolazione, ERK1/2 è fosforilato e viene dissociato dalle sue proteine di ancoraggio, che permette la traslocazione di ERK1/2 ad altri compartimenti subcellulari, tra cui il nucleo, mitocondri, Golgi e lisosomi14, 15 , 16.
Anche se humanin è noto per attivare la via di segnalazione di ERK1/2, l'attivazione di ERK1/2 è osservata solo nei lisati cellulari totali. Come descritto in precedenza, poiché la localizzazione subcellulare di ERK1/2 svolge un ruolo cruciale nel suo effetto a valle, l'analisi della localizzazione subcellulare e i livelli totali di fosforilata ERK1/2 è necessario fornire una comprensione globale di attivazione di ERK1/2 indotta da humanin e l'attivazione di obiettivi a valle.
Per comprendere gli organelli bersaglio di attivazione di ERK1/2, è stato effettuato il frazionamento subcellulare seguito mediante western blotting per fosforilata ERK1/2. Questo metodo può essere facilmente implementato come sfrutta i reagenti e la normale attrezzatura da laboratorio. I compartimenti subcellulari isolati sono di elevata purezza, permettendo i risultati semplicemente essere interpretati. Immunostaining di ERK1/2 può produrre risultati simili. Tuttavia, alcuni compartimenti subcellulari sono relativamente difficili da visualizzare e richiedono metodi di fissazione e permeabilizzazione speciali. ERK1/2 livelli variano in compartimenti subcellulari, e questa variazione potrebbe causare falsi positivi e falsi negativi segnali quando guardando lisati di cellule intere. Pertanto, un immunoblot utilizzando compartimenti subcellulari isolati ci dà una migliore comprensione della localizzazione di ERK1/2.
La versatilità del metodo consente modifiche del protocollo per studiare gli effetti di altri stimolanti tra cui altri MDPs o la traslocazione di altre molecole di segnalazione come STAT3. Recentemente scoperti piccoli peptidi simil-humanin (SHLPs) sono codificati dalla regione di rRNA 16S dove humanin viene codificato, e hanno proprietà simili ma distinti rispetto a HN17. Ad esempio, SHLP2 e SHLP3 attiva ERK1/2 dopo 8 h sebbene humanin attiva ERK1/2 entro 5 min Examining localizzazione subcellulare di ERK1/2 in risposta a diversi peptidi ci darà una migliore comprensione della biologia di questi peptidi. La prova emergente ha mostrato che la localizzazione subcellulare delle molecole di segnalazione svolge un ruolo cruciale nei loro effetti a valle. Per esempio, STAT3, tradizionalmente, è noto per essere localizzato principalmente nel citosol nelle cellule a riposo, e quindi trasloca nel nucleo per attivare l'espressione genica in risposta a citochine18. STAT3 inoltre trasloca ai mitocondri e regola il ciclo del TCA e ATP produzione19. Per quanto riguarda il regolamento di autofagia, diversa localizzazione subcellulare di STAT3 modula l'autofagia in vari modi20. Ad esempio, STAT3 nucleare trascrizionalmente regola geni autophagy-relative e agisce come un modulatore di autofagia. STAT3 citoplasmatica inibisce costitutivamente l'autofagia interagendo con l'autofagia molecole di segnalazione. STAT3 mitocondriale inibisce e impedisce mitophagy sopprimendo l'autofagia indotto da stress ossidativo. Pertanto, questo metodo di isolamento compartimento subcellulare è cruciale per comprendere il ruolo di altre molecole di segnalazione, nonché il ERK1/2.

<table><tbody><tr><td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9102</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>fosfo-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4370</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>Lamina B1</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>12586</td><td>Marcatore nucleare, Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>5174</td><td>Marcatore citoplasmatico, Diluizione 1:2.000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa cruz</td><td>SC-17764</td><td>Marcatore mitocondri, Diluizione 1:2.000</td></tr><tr><td>coniugato anti-Coniglio-HRP</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>7074</td><td>Diluizione 1:30.000</td></tr><tr><td>RIPA Lisi ed estrazione Tampone</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura da 100 mm</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC 12556002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide HNG</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mm filtro per silinga</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Halt&trade; Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblaggi con pestelli lisci</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici prefabbricati</td><td>BIO RAD</td><td>4561104</td> Mini Trans-Blot Module BIO RAD 1658030 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer</td><td>System BIO RAD</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td><td>BIO RAD</td><td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Blotting Substrati</td><td>BIO RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Aquila modificata di Dulbecco Media</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore, Meda: FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

frazionamento subcellulare per l'attivazione di erk previo trattamento di peptide derivato mitocondriale

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Peptidi mitocondriale-derivati (MDPs) sono una nuova classe di peptidi che sono codificati da piccolo open reading frame all'interno di altri noti geni del genoma mitocondriale. MDPs hanno un'ampia varietà di effetti biologici quali proteggere i neuroni dall'apoptosi, migliorare gli indicatori metabolici e proteggere le cellule da chemioterapia. Humanin era la MDP prima di essere scoperto ed è il peptide più studiato tra la famiglia MDP. I recettori di membrana e vie di segnalazione a valle di humanin sono state caratterizzate con attenzione. MDPs aggiuntive quali MOTS-c e SHLP1-6 sono stati scoperti più di recente e i meccanismi di segnalazione devono ancora essere delucidato. Qui descriviamo un metodo di coltura basata di cella per determinare la funzione di questi peptidi. In particolare, tecniche di frazionamento cellulare in combinazione con macchiarsi occidentale consentono la determinazione quantitativa dell'attivazione e spostamento della molecola di segnalazione importante. Mentre ci sono altri metodi di frazionamento cellulare, quello qui descritto è un metodo facile e semplice. Questi metodi possono essere utilizzati più ulteriormente per delucidare il meccanismo di azione di questi peptidi e altri agenti terapeutici.

Utilizzando la procedura qui presentata, abbiamo trattato le cellule HEK293 e SH-SY5Y con 1 μM e 100 μM S14G-humanin, un potente humanin analogico21, rispettivamente, a completare la media per i periodi di tempo indicato (Figura 1A e Figura 1 B). abbiamo poi esaminato la forma totale e fosforilata di ERK1/2 al Thr202/Tyr204 da estratti di proteina to...

Questo protocollo descrive come stimolare le cellule con peptidi derivati mitocondriale e valutare la cascata di segnalazione e localizzazione di fosfo-proteine.

Frazionamento subcellulare per l'attivazione di ERK previo trattamento di Peptide derivato mitocondriale

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare la cascata di segnalazione a valle coinvolta nelle cellule stimolate con peptidi di derivazione mitocondriale. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo dei peptidi di derivazione mitocondriale, come ad esempio quali vie di segnalazione sono coinvolte e dove ciò si verifica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice e relativamente facile da eseguire.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo esaminato la segnalazione ERK mediata dall'uomo, che ci ha fornito informazioni limitate sui fatti a valle. Il metodo Kersher Subscale ci ha dato un'idea migliore del ruolo della segnalazione mediata dall'uomo. Il terzo giorno dopo la placcatura e il lavaggio due volte dieci al sesto, le celle SH-SY5Y o HEK293 secondo il protocollo di testo.Sciogliere i peptidi umanini S14G in acqua distillata filtrata da due micron a punto zero. E ricostituirli come una soluzione madre di un millimolare. Aliquotare il terreno preriscaldato contenente siero o privo di siero in una provetta conica da 15 millilitri e aggiungere la soluzione madre di peptide humanin a temperatura ambiente per ottenere una concentraz

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In questo video vi mostreremo come il complesso della catena respiratoria mitocondriale di cellule staminali embrionali umane possono essere analizzati utilizzando nelle prove di attività gel.

Sondaggio per mitocondriale complessa attività di cellule staminali embrionali umane

Gli effetti di attivazione di proteina chinasi C (PKC) isoenzimi sulle funzioni mitocondriali associate respirazione e fosforilazione ossidativa e sulla vitalità cellulare sono descritti. L'approccio si adatta tecnica adenovirale per sovraesprimere selettivamente isoenzimi PKC in coltura primaria e una varietà di saggi per determinare le funzioni mitocondriali e lo stato energetico della cellula.

La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi

Molti mRNA codificanti proteine ​​mitocondriali sono associate alla membrana esterna mitocondriale. Descriviamo una procedura di frazionamento subcellulare volta a isolamento dei mitocondri di lievito con i suoi mRNA e ribosomi associati. Questo protocollo può essere applicato a cellule cresciute in condizioni diverse per rivelare meccanismi di localizzazione mRNA e traduzione localizzata vicino ai mitocondri.

Isolamento di mRNA associati con mitocondri di lievito per studiare i meccanismi di traduzione localizzata

Qui, descriviamo come studiare la localizzazione mitocondriale di una chinasi (ciclo cellulare) e come determinare la sua posizione sub-mitocondriale, nonché potenziali substrati/bersagli mitocondriali. L'espressione forzata di proteine nei mitocondri fornisce uno strumento utile per studiare le conseguenze funzionali della localizzazione mitocondriale di una proteina di interesse.

Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

Le chinasi di proteine ​​sono enzimi e stadi di segnalazione altamente evoluti che sono critici per la trasduzione del segnale inter-e intracellulare. Presentiamo un protocollo per la misurazione dell'attività di chinasi mediante l'uso di trifosfato adenosina radiomarcato ([γ-32P] ATP), un metodo affidabile per aiutare a spiegare la regolazione cellulare di segnalazione.

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

Sequestro di electroconvulsive (ECS) è un modello sperimentale animale della terapia electroconvulsive per la depressione grave. ECS globalmente stimola l'attività nell'ippocampo, che conduce a sinaptogenesi e plasticità sinaptica. Qui, descriviamo i metodi per induzione ECS in ratti e per frazionamento subcellulare dei loro ippocampi per esaminare le modifiche grippaggio-indotto proteine sinaptiche.

Sequestri di Electroconvulsive in ratti e frazionamento dei loro ippocampi di esaminare grippaggio-indotto cambiamenti nella densità postsinaptica proteine

Qui, presentiamo un protocollo per isolare la membrana plasmatica, citoplasma e nei mitocondri delle cellule U937 senza l'uso di centrifugazione ad alta velocità. Questa tecnica può essere utilizzata per purificare le frazioni subcellulari per l'esame successivo di localizzazione della proteina tramite immunoblotting.

Il frazionamento delle cellule delle cellule U937 in assenza di centrifugazione ad alta velocità

Il laser a femtosecondi strettamente focalizzato può fornire una stimolazione precisa alle cellule aggiungendosi a una microscopia confocale che consenta l'osservazione e la fotostimolazione in tempo reale. La fotostimolazione può attivare eventi molecolari cellulari, tra cui percorso di segnalazione ERK e lampi mitocondriali di specie reattive dell'ossigeno.

La fotostimolazione da parte del laser Femtosecondo attiva la segnalazione o eventi mitocondriali regolati dal segnale extracellulare (ERK) nelle cellule bersaglio

Nonostante i recenti progressi, molte proteine mitocondriali del lievito rimangono ancora con le loro funzioni completamente sconosciute. Questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per determinare la localizzazione sottocondriale delle proteine, che è stato fondamentale per la delucidazione delle loro funzioni molecolari.

Valutazione della localizzazione della proteina submitocondriale nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae

Le RASopatie sono sindromi genetiche multisistemiche causate dall'iperattivazione della via RAS-MAPK. Varianti potenzialmente patogene in attesa di convalida emergono continuamente, mentre le scarse evidenze precliniche limitano la terapia. Qui, descriviamo il nostro protocollo in vivo per testare e convalidare in modo incrociato i livelli di attivazione ERK associati alla RASopathy e la sua modulazione farmacologica durante l'embriogenesi mediante imaging FRET dal vivo in zebrafish...

Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza

Impara il frazionamento subcellulare per analizzare l'attivazione di ERK in cellule SH-SY5Y e HEK293 trattate con peptidi derivati mitocondriali. Questo metodo identifica le vie di segnalazione attivate e la localizzazione delle fosfoproteine.

Frazionamento subcellulare per l'attivazione di ERK previo trattamento di Peptide derivato mitocondriale

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