Frazionamento subcellulare per l'attivazione di ERK previo trattamento di Peptide derivato mitocondriale
25 settembre 2017
Questo protocollo descrive come stimolare le cellule con peptidi derivati mitocondriale e valutare la cascata di segnalazione e localizzazione di fosfo-proteine.
L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare la cascata di segnalazione a valle coinvolta nelle cellule stimolate con peptidi di derivazione mitocondriale. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo dei peptidi di derivazione mitocondriale, come ad esempio quali vie di segnalazione sono coinvolte e dove ciò si verifica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice e relativamente facile da eseguire.
Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo esaminato la segnalazione ERK mediata dall'uomo, che ci ha fornito informazioni limitate sui fatti a valle. Il metodo Kersher Subscale ci ha dato un'idea migliore del ruolo della segnalazione mediata dall'uomo. Il terzo giorno dopo la placcatura e il lavaggio due volte dieci al sesto, le celle SH-SY5Y o HEK293 secondo il protocollo di testo.
Sciogliere i peptidi umanini S14G in acqua distillata filtrata da due micron a punto zero. E ricostituirli come una soluzione madre di un millimolare. Aliquotare il terreno preriscaldato contenente siero o privo di siero in una provetta conica da 15 millilitri e aggiungere la soluzione madre di peptide humanin a temperatura ambiente per ottenere una concentrazione di lavoro.
Sostituire immediatamente il terreno nelle cellule con sei millilitri di soluzione peptidica. E incubare le cellule per il tempo appropriato. Utilizzare 10 millilitri di PBS ghiacciato per lavare le celle due volte.
Quindi raschiare le cellule dalla piastra in cinque millilitri di PBS ghiacciato. E trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 500 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone di frazionamento ghiacciato e incubare su ghiaccio per 15 minuti. Centrifugare la provetta a 250 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi raccogliere il surnatante come frazione citoplasmatica e conservare il pellet per la frazione nucleare.
Centrifugare il surnatante per rimuovere i detriti cellulari e altri contaminanti a 18000 volte G e quattro gradi Celsius per dieci minuti. E poi trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga. Questa è la frazione di citisolo.
Risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone di lavaggio ghiacciato e centrifugare la soluzione a 250 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e utilizzare 100 microlitri di tampone di estrazione nucleare ghiacciato per risospendere il pellet. Quindi sonicare il campione sul ghiaccio 10 volte.
Centrifugare nuovamente il campione. Quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga. Per isolare la frazione mitocondriale grezza, utilizzare 10 millilitri di PBS ghiacciato per lavare le cellule in ogni piatto da 10 centimetri.
Quindi aggiungere cinque millilitri di PBS ghiacciato e utilizzare un raschietto per cellule per staccare le cellule. Trasferire le sospensioni cellulari in un unico tubo conico da 15 millilitri. Quindi centrifugare le celle a 600 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Aspirare il PBS e utilizzare un millilitro di tampone di isolamento mitocondriale ghiacciato per risospendere il pellet. Quindi, con un pestello rivestito di politetrafluoroetilene sul ghiaccio, omogeneizzare le cellule con 25 colpi di un omogeneizzatore da due millilitri. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da microcentrifuga e centrifugare il campione a 600 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere i nuclei e le cellule integre.
Quindi raccogliere il surnatante, trasferirlo in una nuova provetta per microcentrifuga e centrifugare la soluzione a 7000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet con 200 microlitri di tampone di isolamento dei mitocondri ghiacciato e trasferire la soluzione in una nuova provetta per microcentrifuga. Centrifugare la provetta a 7000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Dopo aver ripetuto il lavaggio, utilizzare 15 microlitri di tampone RIPA per risospendere il pellet e incubare la sospensione su ghiaccio per 10 minuti. Quindi centrifugare il campione a 16000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire il surnatante, che è la frazione mitocondriale, in una nuova provetta.
Quantificare ed eseguire il western blotting secondo il protocollo di testo. Utilizzando la procedura illustrata in questo video, le cellule HEK293 e SH-SY5Y si sono ritirate con uno e 100 micromolari S14 G humanin, un potente analogo dell'humanin. E sono state analizzate la forma totale e fosforilata di ERK12 a teanina 202, tirosina 204 da estratti proteici totali.
Come si vede qui, il trattamento con S14G humanin ha mostrato un aumento della fosforilazione di ERK12 e del suo sito regolatorio teanina-202, tirosina-204. Per comprendere il bersaglio dell'attivazione di ERK12 mediata da S14G humanin, è stata analizzata la localizzazione subcellulare di ERK12 totale e fosforilata in seguito al trattamento con S14G humanin. Come mostrato in questi western blot, nelle cellule HEK293, l'ERK fosforilato aumenta sia nel citoplasma che nel nucleo, ma non nei mitocondri.
Nelle cellule SH-SY5Y, tuttavia, l'ERK fosforilata è diminuita nel nucleo del citoplasma e nei mitocondri. Ciò suggerisce che la fosforilazione di ERK mediata dall'uomo S14G può svolgere un ruolo diverso in diversi tipi di cellule e in diverse condizioni. Una volta padroneggiato, il frazionamento nucleare cellulare può essere effettuato in un'ora e il frazionamento mitocondriale può essere eseguito in un'ora e 30 minuti, se eseguito correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di tenere tutti i campioni sul ghiaccio. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, tra cui la precipitazione co-immunitaria e la spettrometria di massa, al fine di comprendere i bersagli a valle delle molecole di segnalazione.
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Panoramica
Questo protocollo descrive come stimolare le cellule con peptidi derivati dai mitocondri e valutare la cascata di segnalazione e la localizzazione delle fosfoproteine. L'obiettivo generale è identificare la cascata di segnalazione a valle coinvolta nelle cellule stimolate con questi peptidi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Segnalazione cellulare
- Biologia mitocondriale
- Fosforilazione delle proteine
Sfondo
- I peptidi derivati dai mitocondri svolgono un ruolo nella segnalazione cellulare.
- Comprendere questi percorsi può fornire informazioni sul funzionamento cellulare.
- I metodi precedenti fornivano informazioni limitate sugli effetti a valle.
- Il metodo Subscale Kersher migliora la comprensione della segnalazione mediata da humanin.
Scopo dello studio
- Studiare le vie di segnalazione attivate dai peptidi derivati dai mitocondri.
- Determinare la localizzazione delle proteine fosforilate in risposta a stimolazione.
- Fornire un metodo semplice per lo studio di questi effetti.
Metodi Utilizzati
- Stimolazione di cellule SH-SY5Y o HEK293 con peptidi derivati dai mitocondri.
- Valutazione delle cascate di segnalazione a valle.
- Studi di localizzazione di proteine fosforilate.
- Utilizzo del metodo Subscale Kersher per un'analisi migliorata.
Risultati principali
- Identificazione dei principali percorsi di segnalazione coinvolti nella risposta ai peptidi derivati dai mitocondri.
- Informazioni sulla localizzazione delle proteine fosforilate durante il processo di segnalazione.
- Convalida del metodo Subscale Kersher per lo studio della segnalazione mediata da humanina.
- Definizione di un protocollo sperimentale semplice ed efficace.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un metodo chiaro per indagare il segnale dei peptidi derivati dai mitocondri.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della biologia mitocondriale.
- Il protocollo può essere utilizzato per ulteriori ricerche nel campo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente ai team di ricerca e sviluppo biofarmaceutici di valutare quantitativamente l'attivazione della ERK e la sua localizzazione subcellulare in risposta a peptidi derivati dai mitocondri, supportando la validazione del bersaglio e la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase iniziale della scoperta. Fornendo un protocollo di frazionamento semplice e compatibile con l'analisi mediante western blot, facilita la verifica di ipotesi relative a cascate di segnalazione mediate da peptidi, rilevanti per indicazioni legate alla neuroprotezione e alle malattie metaboliche. L'approccio aumenta la fiducia predittiva nell'analisi dei percorsi prima degli sforzi di identificazione del capostazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Verifica l'ipotesi terapeutica relativa all'interazione tra peptidi mitocondriali e le vie di segnalazione ERK.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale del bersaglio mediante la misurazione quantitativa dell'ERK fosforilato nelle frazioni citoplasmatica, nucleare e mitocondriale.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio rivelando risposte di segnalazione specifiche per tipo cellulare, utili per la riduzione del rischio meccanicistico.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera frazioni subcellulari standardizzate adatte ad analisi downstream mediante western blot di eventi di fosforilazione.
- Riproducibilità: Fornisce un protocollo semplice, mantenuto sul ghiaccio, che garantisce l'isolamento consistente di frazioni citoplasmatiche, nucleari e mitocondriali.
- Abilitazione dello screening: Prepara sistemi biologici validati per la valutazione affidabile di composti in cascami fenotipici di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Supporta l'indagine sui peptidi mitocondriali derivati nella neuroprotezione e nei modelli di stress metabolico, in linea con la rilevanza preclinica per le malattie.
- Continuità traslazionale: Collega le osservazioni sui segnali nella fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso dati quantificabili sulla localizzazione delle proteine fosforilate.
- Avanzamento basato sul rischio: Fornisce informazioni per decisioni di avanzamento o interruzione del progetto, chiarendo se l'attivazione osservata della ERK avviene in compartimenti subcellulari rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla valutazione dell'interazione con il bersaglio alla chiarificazione del percorso, consentendo di passare da risultati fenotipici a una comprensione meccanicistica prima dell'ottimizzazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi dei peptidi derivati dai mitocondri mediante la risoluzione subcellulare degli eventi di attivazione di ERK.
- Screening: Fornisce frazioni pronte per il saggio con letture quantitative della fosforilazione per il confronto degli effetti dei composti.
- Analisi: Genera misurazioni della fosfo-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) che consentono ai gruppi di lavoro di confrontare le condizioni di stimolazione e gli effetti degli inibitori.
- Ricerca traslazionale: Collega i modelli di localizzazione di ERK alla continuità preclinica identificando il predominio della segnalazione nucleare rispetto a quella citoplasmatica in modelli cellulari pertinenti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di frazionamento riutilizzabile, applicabile a diversi peptidi derivati dai mitocondri e ad agenti terapeutici oltre agli analoghi dell'umanina.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione del percorso bersaglio riducendo l'ambiguità meccanicistica nei segnali mediati da peptidi.
- Valore operativo: Fornisce una frazionamento standardizzato e riproducibile, compatibile con analisi tramite western blot, utilizzabile tra diversi gruppi di ricerca.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati ai bersagli mitocondriali prima di investimenti significativi nella generazione di composti leader.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce una priorizzazione adeguata al rischio distinguendo l'attivazione del segnale produttivo dal rumore artifattuale o specifico del compartimento.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di frazionamento subcellulare e nella rilevazione tramite western blot di epitopi fosforilati.
- Dipende dall'accesso a un'attrezzatura per centrifuga in grado di controllare con precisione la forza G e la temperatura per l'isolamento delle frazioni.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i tempi di frazionamento e l'uso di inibitori di proteasi/fosfatasi al fine di garantire risultati costanti.
- Le considerazioni per l'adattamento includono l'ottimizzazione per diversi tipi cellulari e concentrazioni di peptidi in base ai profili di solubilità e stabilità.
- I limiti pratici comprendono il rischio di contaminazione incrociata tra frazioni qualora i passaggi di lavaggio non vengano rigorosamente rispettati, come indicato nel protocollo.
