Name: Frazionamento subcellulare per lattivazione di ERK previo trattamento di Peptide derivato mitocondriale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Impara il frazionamento subcellulare per analizzare l'attivazione di ERK in cellule SH-SY5Y e HEK293 trattate con peptidi derivati mitocondriali. Questo metodo identifica le vie di segnalazione attivate e la localizzazione delle fosfoproteine.

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Questo lavoro è stato supportato da un Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship nel programma di ricerca di invecchiamento di SJK, e un premio della Fondazione Glenn e NIH concede a PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Tutti gli autori compaiono nel film.

1. peptide trattamento alle cellule <ol><li>piastra 2 milioni di SH-SY5Y o cellule HEK293 (2 x 10 6) in 10 cm piatto e coltivano per 2 giorni</li> <li>(opzionale) il prossimo giorno, lavare le cellule con Dulbecco privo di siero &#39; s Modified Eagle media Medium (DMEM) una volta e incubare con siero DMEM gratuito durante la notte se il trattamento deve essere fatto in media liberi del siero.</li>
	<li>Il giorno 3, sciogliere S14G-humanin peptidi in 0,2 µm filtrata, acqua distillata e rinvenire come soluzione di riserva di 1mM. 
	Nota: I peptidi devono essere disciolto in solvente appropriato, che può essere determinato dalle caratteristiche di sequenza del peptide (ad es., carica complessiva) e può essere fornito dal produttore se i peptidi sono disponibili in commercio. Ad esempio, S14G-humanin, SHLP2 e SHLP6 e MOTS-c si dissolvono in acqua. Aliquotare i peptidi in un volume adeguato (ad es., 50 µ l) per evitare di congelare e scongelare i cicli. Una volta scongelato, non utilizzarli ancora.</li>
	<li>Aliquota il siero pre-riscaldato-contenente o media del siero-liberi in un conico da 50 mL tubo e aggiungere la soluzione di riserva 1 mM temperatura ambiente per trasformarlo in una concentrazione di lavoro (ad esempio, 1 µM, 10 µM).</li>
	<li>Sostituire il supporto con 6 mL di soluzione del peptide da passo 1.4. Incubare le cellule per la giusta quantità di tempo. 
	Nota: Scegliere il tempo di incubazione a seconda della condizione che attiva ERK.</li>
</ol> 2. Frazionamento subcellulare di citoplasma e nucleo <ol><li>lavare le cellule due volte con 10 mL di PBS ghiacciata, raschiare le cellule fuori la piastra in 5 mL di PBS ghiacciata e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirare il PBS e risospendere il pellet in 200 µ l di tampone di frazionamento ghiacciata, (pH di 10 mM HEPES = 7.6, 3 mM MgCl 2, 10mm KCl, 5% (v/v) glicerolo, 1% tensioattivi non ionici (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) n), inibitori delle proteasi/fosfatasi). 
	Nota: Per mantenere le proteine nel loro stato di fosforilazione, l'inibitore della fosfatasi come bene come proteasi inibitore deve essere appena aggiunto e campioni devono essere tenuti sul ghiaccio a tutti i tempi. Ripetendo il blocco e thaw cicli di campioni devono essere evitati. Aliquotare campioni in piccola quantità (ad es. 50 μg) prima del loro congelamento a -80 ° C.</li>
	<li>Incubare risospeso in ghiaccio per 15 minuti e poi Centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante come la frazione citoplasmatica e tenere il pellet per frazione nucleare.</li>
	<li>Centrifugare il surnatante per rimuovere i detriti cellulari e altri contaminanti a 18.000 x g per 10 min a 4 ° C e poi trasferire il surnatante in un nuovo tubo del microcentrifuge. Questa è la frazione di citosol.</li>
	<li>Risospendere il pellet in tampone ghiacciata di 200 μL (10 mM a pH HEPES = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerolo, 0,2 mM EDTA, inibitori delle proteasi/fosfatasi) e centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in tampone di estrazione ghiacciata, nucleare 100 μL (pH di 20 mM HEPES = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerolo, 0,2 mM EDTA, inibitori delle proteasi/fosfatasi) e Sonicare 10 volte (5 s, 10 s sconto 30% amp.) il ghiaccio</li>
	<li>Centrifugare a 18.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Si tratta di frazione nucleare.</li>
	<li>Quantificare la quantità di proteina usando un'analisi BCA</li></ol>
 3. frazione mitocondriale grezza <ol><li>lavare le cellule in ogni piatto di 10 cm con 10 mL di PBS freddo, aggiungere 5 mL di PBS ghiacciata e staccare le celle utilizzando un raschietto cell. 
	Nota: Utilizzare tre piatti di 10cm di cellule per ottenere una buona resa dei mitocondri per Western Blotting.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e combinare tutto da tre piatti di 10cm in una provetta conica da 15 ml.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 600 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirare il PBS e risospendere il pellet in 1 mL di buffer di isolamento mitocondri ghiacciata (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM di saccarosio, regolare a pH = 7,4).</li>
	<li>Omogeneizzare le cellule con 25 colpi di un omogeneizzatore 2 mL con il pestello rivestito politetrafluoroetilene su Ice. 
	Nota: Questo passaggio è fondamentale per mantenere l'integrità mitocondriale e massimizzare la resa della frazione mitocondriale. Il numero dei tratti deve essere ottimizzato per ogni tipo di cellula. Preraffreddare l'omogeneizzatore prima di iniziare la procedura.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato a un tubo del microcentrifuge ed e centrifugare a 600 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere i nuclei ed ininterrotte cellule.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante, trasferirlo in un nuovo tubo del microcentrifuge e centrifugare a 7.000 x g per 10 min a 4 ° C. 
	Nota: Il pellet è allentato, raccogliere il surnatante con cura e cercare di non disturbare il pellet.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante, risospendere il pellet con 200 μL di tampone di isolamento mitocondri ghiacciata e trasferire la soluzione in un nuovo tubo del microcentrifuge. Centrifugare la provetta a 7.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ripetere il punto 3.8 a lavare la pallina. Non è necessario trasferire il surnatante in un nuovo tubo del microcentrifuge in questo passaggio.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante dal pellet lavato e risospendere il pellet contenente i mitocondri con 50 μL di tampone RIPA.</li>
	<li>Incubare la sospensione in ghiaccio per 10 min.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione a 16.000 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Questa è la frazione mitocondriale.</li>
	<li>Quantificare la quantità di proteina usando un'analisi BCA.</li>
</ol> 4. Western Blotting per fosfo-specifici proteine <ol><li>eseguire un'elettroforesi del gel di SDS-poliacrilammide (8-16% preconfezionati gel) e la proteina di trasferimento di una membrana PVDF 4.</li>
	<li>Incubare la membrana con 5% BSA in TBST (0,1% polisorbato 20) per 30 min a temperatura ambiente per bloccare i siti di legame non specifico background. 
	Nota: Per il rilevamento di proteina fosforilata, bloccare la membrana con BSA non latte. Il latte contiene caseina, una fosfoproteina abbondante, che si traduce in alto segnale aspecifico.</li>
	<li>Incubare la membrana con l'anticorpo primario (anti-fosfo-ERK1/2) a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, lavare la membrana con TBST (0,1% polisorbato 20) tre volte per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare la membrana con anticorpo secondario (anti-coniglio HRP) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la membrana con TBST (0,1% polisorbato 20) tre volte per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare la membrana con soluzione di ECL e la membrana nell'analizzatore dell'immagine di immagine.</li>
	<li>Striscia la membrana con stripping buffer per 15 min a temperatura ambiente e lavare la membrana con TBST tre volte per 5 min.</li>
	<li>Ripetere i punti da 4.2 a 4.7 usando l'anticorpo di anti-totale ERK1/2.</li>
	<li>Per verificare la purezza di ogni frazione, eseguire SDS-PAGE ed eseguire immunoblots utilizzando anticorpi che riconoscono i marcatori per ogni vano (ad es., Liuzzi B1 per nucleo, GAPDH per cytosol e TOM20 per i mitocondri).</li>
</ol>

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</ol>

Pinchas Cohen è un azionista e consulente per Kelvin CohBar, Inc., lo Yen ha servito come un consulente per CohBar, Inc.

Qui, abbiamo dimostrato che humanin peptide-ha mediato l'attivazione di ERK1/2 si verifica a due diversi tipi di cellule, e la localizzazione subcellulare di attivazione di ERK1/2 può essere diversa a seconda delle condizioni (ad es., dose di peptide, punto del tempo e delle cellule tipo). È stato dimostrato che humanin segnali attraverso due diversi recettori22,23, che possono spiegare le differenze nella segnalazione tra le due linee cellulari come pur...

Gli studi emergenti indicano che peptidi mitocondriali-derivati (MDPs) svolgono i ruoli importanti nel metabolismo e nella citoprotezione1,2,3. Capire la via di trasduzione del segnale in presenza di MDPs ci dà comprensione nel meccanismo da cui MDPs modulano varie funzioni. Il primo MDP identificati, humanin, ha dimostrato di aumentare la chinasi segnale-regolata extracellulare 1/2 (ERK1/2) fosforilazione attraverso suo recettore vincolante4,5. Tuttavia, l'effetto a valle dell'attivazione di ERK1/2 è ancora aggiunto.
La cascata di ERK1/2 serve come un mediatore essenziale in una varietà di processi cellulari compreso proliferazione, migrazione cellulare, il metabolismo cellulare, sopravvivenza ed apoptosi6,7,8. Ad per orchestrare tutti questi processi cellulari distinti, l'attività e la localizzazione subcellulare di ERK1/2 sono strettamente regolate da fosfatasi e impalcatura proteine9,10. Oltre a modificazione post-traduzionale, la dinamica di marcia di ERK1/2 inoltre regola la sua segnalazione funzione, attività e specificità11,12. ERK1/2 è localizzato principalmente nel citosol13. Un insieme delle proteine di ancoraggio e impalcatura aiutano a trattenere ERK1/2 in elementi del citoscheletro, sulla superficie degli organelli, o diffusa nel citoplasma13. Stimolazione, ERK1/2 è fosforilato e viene dissociato dalle sue proteine di ancoraggio, che permette la traslocazione di ERK1/2 ad altri compartimenti subcellulari, tra cui il nucleo, mitocondri, Golgi e lisosomi14, 15 , 16.
Anche se humanin è noto per attivare la via di segnalazione di ERK1/2, l'attivazione di ERK1/2 è osservata solo nei lisati cellulari totali. Come descritto in precedenza, poiché la localizzazione subcellulare di ERK1/2 svolge un ruolo cruciale nel suo effetto a valle, l'analisi della localizzazione subcellulare e i livelli totali di fosforilata ERK1/2 è necessario fornire una comprensione globale di attivazione di ERK1/2 indotta da humanin e l'attivazione di obiettivi a valle.
Per comprendere gli organelli bersaglio di attivazione di ERK1/2, è stato effettuato il frazionamento subcellulare seguito mediante western blotting per fosforilata ERK1/2. Questo metodo può essere facilmente implementato come sfrutta i reagenti e la normale attrezzatura da laboratorio. I compartimenti subcellulari isolati sono di elevata purezza, permettendo i risultati semplicemente essere interpretati. Immunostaining di ERK1/2 può produrre risultati simili. Tuttavia, alcuni compartimenti subcellulari sono relativamente difficili da visualizzare e richiedono metodi di fissazione e permeabilizzazione speciali. ERK1/2 livelli variano in compartimenti subcellulari, e questa variazione potrebbe causare falsi positivi e falsi negativi segnali quando guardando lisati di cellule intere. Pertanto, un immunoblot utilizzando compartimenti subcellulari isolati ci dà una migliore comprensione della localizzazione di ERK1/2.
La versatilità del metodo consente modifiche del protocollo per studiare gli effetti di altri stimolanti tra cui altri MDPs o la traslocazione di altre molecole di segnalazione come STAT3. Recentemente scoperti piccoli peptidi simil-humanin (SHLPs) sono codificati dalla regione di rRNA 16S dove humanin viene codificato, e hanno proprietà simili ma distinti rispetto a HN17. Ad esempio, SHLP2 e SHLP3 attiva ERK1/2 dopo 8 h sebbene humanin attiva ERK1/2 entro 5 min Examining localizzazione subcellulare di ERK1/2 in risposta a diversi peptidi ci darà una migliore comprensione della biologia di questi peptidi. La prova emergente ha mostrato che la localizzazione subcellulare delle molecole di segnalazione svolge un ruolo cruciale nei loro effetti a valle. Per esempio, STAT3, tradizionalmente, è noto per essere localizzato principalmente nel citosol nelle cellule a riposo, e quindi trasloca nel nucleo per attivare l'espressione genica in risposta a citochine18. STAT3 inoltre trasloca ai mitocondri e regola il ciclo del TCA e ATP produzione19. Per quanto riguarda il regolamento di autofagia, diversa localizzazione subcellulare di STAT3 modula l'autofagia in vari modi20. Ad esempio, STAT3 nucleare trascrizionalmente regola geni autophagy-relative e agisce come un modulatore di autofagia. STAT3 citoplasmatica inibisce costitutivamente l'autofagia interagendo con l'autofagia molecole di segnalazione. STAT3 mitocondriale inibisce e impedisce mitophagy sopprimendo l'autofagia indotto da stress ossidativo. Pertanto, questo metodo di isolamento compartimento subcellulare è cruciale per comprendere il ruolo di altre molecole di segnalazione, nonché il ERK1/2.

<table><tbody><tr><td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9102</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>fosfo-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4370</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>Lamina B1</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>12586</td><td>Marcatore nucleare, Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>5174</td><td>Marcatore citoplasmatico, Diluizione 1:2.000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa cruz</td><td>SC-17764</td><td>Marcatore mitocondri, Diluizione 1:2.000</td></tr><tr><td>coniugato anti-Coniglio-HRP</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>7074</td><td>Diluizione 1:30.000</td></tr><tr><td>RIPA Lisi ed estrazione Tampone</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura da 100 mm</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC 12556002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide HNG</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mm filtro per silinga</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Halt&trade; Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblaggi con pestelli lisci</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici prefabbricati</td><td>BIO RAD</td><td>4561104</td> Mini Trans-Blot Module BIO RAD 1658030 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer</td><td>System BIO RAD</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td><td>BIO RAD</td><td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Blotting Substrati</td><td>BIO RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Aquila modificata di Dulbecco Media</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore, Meda: FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

frazionamento subcellulare per l'attivazione di erk previo trattamento di peptide derivato mitocondriale

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Peptidi mitocondriale-derivati (MDPs) sono una nuova classe di peptidi che sono codificati da piccolo open reading frame all'interno di altri noti geni del genoma mitocondriale. MDPs hanno un'ampia varietà di effetti biologici quali proteggere i neuroni dall'apoptosi, migliorare gli indicatori metabolici e proteggere le cellule da chemioterapia. Humanin era la MDP prima di essere scoperto ed è il peptide più studiato tra la famiglia MDP. I recettori di membrana e vie di segnalazione a valle di humanin sono state caratterizzate con attenzione. MDPs aggiuntive quali MOTS-c e SHLP1-6 sono stati scoperti più di recente e i meccanismi di segnalazione devono ancora essere delucidato. Qui descriviamo un metodo di coltura basata di cella per determinare la funzione di questi peptidi. In particolare, tecniche di frazionamento cellulare in combinazione con macchiarsi occidentale consentono la determinazione quantitativa dell'attivazione e spostamento della molecola di segnalazione importante. Mentre ci sono altri metodi di frazionamento cellulare, quello qui descritto è un metodo facile e semplice. Questi metodi possono essere utilizzati più ulteriormente per delucidare il meccanismo di azione di questi peptidi e altri agenti terapeutici.

Utilizzando la procedura qui presentata, abbiamo trattato le cellule HEK293 e SH-SY5Y con 1 μM e 100 μM S14G-humanin, un potente humanin analogico21, rispettivamente, a completare la media per i periodi di tempo indicato (Figura 1A e Figura 1 B). abbiamo poi esaminato la forma totale e fosforilata di ERK1/2 al Thr202/Tyr204 da estratti di proteina to...

Questo protocollo descrive come stimolare le cellule con peptidi derivati mitocondriale e valutare la cascata di segnalazione e localizzazione di fosfo-proteine.

Frazionamento subcellulare per l'attivazione di ERK previo trattamento di Peptide derivato mitocondriale

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare la cascata di segnalazione a valle coinvolta nelle cellule stimolate con peptidi di derivazione mitocondriale. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo dei peptidi di derivazione mitocondriale, come ad esempio quali vie di segnalazione sono coinvolte e dove ciò si verifica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice e relativamente facile da eseguire.Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo esaminato la segnalazione ERK mediata dall'uomo, che ci ha fornito informazioni limitate sui fatti a valle. Il metodo Kersher Subscale ci ha dato un'idea migliore del ruolo della segnalazione mediata dall'uomo. Il terzo giorno dopo la placcatura e il lavaggio due volte dieci al sesto, le celle SH-SY5Y o HEK293 secondo il protocollo di testo.Sciogliere i peptidi umanini S14G in acqua distillata filtrata da due micron a punto zero. E ricostituirli come una soluzione madre di un millimolare. Aliquotare il terreno preriscaldato contenente siero o privo di siero in una provetta conica da 15 millilitri e aggiungere la soluzione madre di peptide humanin a temperatura ambiente per ottenere una concentrazione di lavoro.Sostituire immediatamente il terreno nelle cellule con sei millilitri di soluzione peptidica. E incubare le cellule per il tempo appropriato. Utilizzare 10 millilitri di PBS ghiacciato per lavare le celle due volte.Quindi raschiare le cellule dalla piastra in cinque millilitri di PBS ghiacciato. E trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 500 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti.Risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone di frazionamento ghiacciato e incubare su ghiaccio per 15 minuti. Centrifugare la provetta a 250 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi raccogliere il surnatante come frazione citoplasmatica e conservare il pellet per la frazione nucleare.Centrifugare il surnatante per rimuovere i detriti cellulari e altri contaminanti a 18000 volte G e quattro gradi Celsius per dieci minuti. E poi trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga. Questa è la frazione di citisolo.Risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone di lavaggio ghiacciato e centrifugare la soluzione a 250 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e utilizzare 100 microlitri di tampone di estrazione nucleare ghiacciato per risospendere il pellet. Quindi sonicare il campione sul ghiaccio 10 volte.Centrifugare nuovamente il campione. Quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga. Per isolare la frazione mitocondriale grezza, utilizzare 10 millilitri di PBS ghiacciato per lavare le cellule in ogni piatto da 10 centimetri.Quindi aggiungere cinque millilitri di PBS ghiacciato e utilizzare un raschietto per cellule per staccare le cellule. Trasferire le sospensioni cellulari in un unico tubo conico da 15 millilitri. Quindi centrifugare le celle a 600 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.Aspirare il PBS e utilizzare un millilitro di tampone di isolamento mitocondriale ghiacciato per risospendere il pellet. Quindi, con un pestello rivestito di politetrafluoroetilene sul ghiaccio, omogeneizzare le cellule con 25 colpi di un omogeneizzatore da due millilitri. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da microcentrifuga e centrifugare il campione a 600 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere i nuclei e le cellule integre.Quindi raccogliere il surnatante, trasferirlo in una nuova provetta per microcentrifuga e centrifugare la soluzione a 7000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet con 200 microlitri di tampone di isolamento dei mitocondri ghiacciato e trasferire la soluzione in una nuova provetta per microcentrifuga. Centrifugare la provetta a 7000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.Dopo aver ripetuto il lavaggio, utilizzare 15 microlitri di tampone RIPA per risospendere il pellet e incubare la sospensione su ghiaccio per 10 minuti. Quindi centrifugare il campione a 16000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire il surnatante, che è la frazione mitocondriale, in una nuova provetta.Quantificare ed eseguire il western blotting secondo il protocollo di testo. Utilizzando la procedura illustrata in questo video, le cellule HEK293 e SH-SY5Y si sono ritirate con uno e 100 micromolari S14 G humanin, un potente analogo dell'humanin. E sono state analizzate la forma totale e fosforilata di ERK12 a teanina 202, tirosina 204 da estratti proteici totali.Come si vede qui, il trattamento con S14G humanin ha mostrato un aumento della fosforilazione di ERK12 e del suo sito regolatorio teanina-202, tirosina-204. Per comprendere il bersaglio dell'attivazione di ERK12 mediata da S14G humanin, è stata analizzata la localizzazione subcellulare di ERK12 totale e fosforilata in seguito al trattamento con S14G humanin. Come mostrato in questi western blot, nelle cellule HEK293, l'ERK fosforilato aumenta sia nel citoplasma che nel nucleo, ma non nei mitocondri.Nelle cellule SH-SY5Y, tuttavia, l'ERK fosforilata è diminuita nel nucleo del citoplasma e nei mitocondri. Ciò suggerisce che la fosforilazione di ERK mediata dall'uomo S14G può svolgere un ruolo diverso in diversi tipi di cellule e in diverse condizioni. Una volta padroneggiato, il frazionamento nucleare cellulare può essere effettuato in un'ora e il frazionamento mitocondriale può essere eseguito in un'ora e 30 minuti, se eseguito correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di tenere tutti i campioni sul ghiaccio. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, tra cui la precipitazione co-immunitaria e la spettrometria di massa, al fine di comprendere i bersagli a valle delle molecole di segnalazione.

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Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

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Frazionamento subcellulare per l'attivazione di ERK previo trattamento di Peptide derivato mitocondriale

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