Il saggio di bioluminescenza ATP
Il test di bioluminescenza ATP è una tecnica comune utilizzata per quantificare i livelli di ATP e rilevare cellule viventi metabolicamente attive. L'ATP o adenosina trifosfato è la fonte primaria di energia per tutti gli organismi viventi, e per "tutti" intendiamo TUTTI. A livello cellulare, l'ATP viene generato attraverso una serie di processi metabolici chiamati respirazione cellulare.
Oggi discuteremo brevemente i percorsi coinvolti nella respirazione cellulare. Successivamente, introdurremo i principi alla base del test di bioluminescenza ATP e passeremo attraverso un protocollo passo-passo per eseguire questo metodo. Infine, vedremo come gli scienziati stanno applicando questa tecnica nella loro attuale ricerca.
Iniziamo introducendo la respirazione cellulare. Questo fenomeno coinvolge diversi processi metabolici, ma ci concentreremo su quello che si occupa del metabolismo del glucosio.
Nel citoplasma, la via della glicolisi converte il glucosio in piruvato e nel processo genera due molecole di ATP. Il piruvato viene trasportato nei mitocondri, dove viene convertito in acetil-coenzima A, un processo che genera anche anidride carbonica. Mentre è ancora nei mitocondri, l'acetil-coenzima A entra quindi nel ciclo dell'acido tricarbossilico o TCA, durante il quale viene nuovamente generata anidride carbonica, così come le molecole ad alta energia di NADH e FADH2. Queste molecole alla fine "trasportano" gli elettroni nella catena di trasporto degli elettroni o ETC.
All'interno dell'ETC, gli elettroni vengono trasferiti sequenzialmente tra diversi complessi proteici nella membrana mitocondriale interna, prima di convertire l'ossigeno in acqua. Durante questo processo, i protoni vengono "pompati" nello spazio intermembrana dei mitocondri. L'ATP viene effettivamente prodotto quando questi protoni rientrano nella matrice mitocondriale mentre passano attraverso una proteina chiamata ATP sintasi. Insieme, il ciclo TCA e l'ETC si traducono nella sintesi di 36 molecole di ATP. La scomposizione di altre molecole nutritive, come grassi e proteine, può anche alimentare il ciclo TCA e ETC, portando alla produzione di ATP.
Ora che sappiamo come le cellule generano ATP, impariamo a conoscere i principi alla base del test di bioluminescenza ATP, che è comunemente usato per misurare i livelli intracellulari di questa molecola.
Strutturalmente, l'ATP ha una base di adenina, uno zucchero ribosio e tre gruppi fosfato, l'ultimo dei quali è collegato da legami ad alta energia. Questi legami rilasciano energia quando si rompono e il test di bioluminescenza ATP capitalizza su questa energia.
Fondamentalmente, questo test richiede il composto luciferina, che è ottenuto da organismi "incandescenti" come le lucciole, e il suo corrispondente enzima catalizzatore chiamato luciferasi. In presenza di ossigeno, la luciferasi ricava energia dall'ATP e converte la luciferina in ossiluciferina. I sottoprodotti di questa reazione sono il pirofosfato, che è due gruppi fosfato ottenuti dall'ATP, convertendolo in adenosina monofosfato o AMP, anidride carbonica, e luce o luminescenza. La luminescenza viene letta da un luminometro, una macchina che quantifica l'emissione luminosa. Poiché la quantità di luminescenza prodotta è direttamente proporzionale alla quantità di ATP, questo serve un buon indicatore della vitalità cellulare e del metabolismo.
Ora che hai compreso i principi alla base del test di bioluminescenza ATP, descriviamo un protocollo generale.
In primo luogo, le cellule vengono seminate in una piastra a 96 pozzetti contenente mezzi di coltura. Le cellule sono placcate a varie densità in triplice copia, per tenere conto della variazione dipendente dalla densità. Poiché i pozzi più esterni non sono circondati da altri pozzi su tutti e quattro i lati, la temperatura e il tasso di evaporazione in questi pozzi possono essere variabili. Pertanto, le celle non sono placcate nei pozzi esterni, ma sono invece riempite d'acqua per evitare l'evaporazione a livello di piastra e la variazione di temperatura che possono influenzare la reazione. Le piastre vengono quindi incubate durante la notte a 37 ° C per consentire alle cellule di aderire alle piastre di coltura.
Quindi, il supporto viene rimosso, la luciferasi e la luciferina vengono aggiunte a ciascun pozzetti e la piastra viene posta su uno shaker per 5-15 minuti per facilitare la reazione. Successivamente, una parte della miscela da ciascun pozzo viene trasferita in una piastra bianca a 96 pozzetti; le piastre bianche sono spesso utilizzate in quanto riflettono la luce verso l'alto, consentendo letture di luminescenza più accurate. Inoltre, le bolle dovrebbero essere evitate, in quanto potrebbero interferire con le analisi successive. Poiché il segnale di luminescenza può diminuire nel tempo, la piastra viene letta entro 10-12 minuti su un luminometro.
Per analizzare i risultati del luminometro, viene calcolato un valore medio di luminescenza da pozzi con la stessa densità cellulare. Confrontando i dati di luminescenza raccolti in questo modo sia da campioni di controllo sani che da cellule trattate, i ricercatori possono valutare gli effetti di un trattamento specifico sulla vitalità e sul metabolismo, in particolare cercando una diminuzione della luminescenza nel gruppo sperimentale.
Ora che hai visto come eseguire un test di bioluminescenza ATP, discutiamo le sue applicazioni di ricerca.
Gli scienziati cercano sempre di sviluppare nuovi antivirali che non danneggino o uccidano le cellule ospiti. In questo studio, le cellule di mammifero sono state seminate in una piastra multiwell e infettate da un virus specifico. A questi campioni sono stati aggiunti vari composti antivirali e sono state generate curve concentrazione-risposta per calcolare la concentrazione effettiva cinquanta o EC50. EC50 è la concentrazione di composto alla quale la vitalità cellulare è del 50 percento. Questo è un parametro comunemente usato per valutare la citotossicità di un composto.
I livelli di ATP possono anche fornire indizi sull'attività mitocondriale in varie condizioni. Qui, il test di bioluminescenza ATP è stato eseguito su preparati di mitocondri derivati da cellule epatiche e muscolari di roditori, che hanno aiutato i ricercatori a valutare l'estensione della funzione mitocondriale nei tessuti normali. È importante sottolineare che questo protocollo potrebbe essere esteso per fornire un modo per esaminare la funzione mitocondriale negli stati patologici.
Gli scienziati stanno anche usando questo test per studiare potenziali trattamenti contro il cancro in sistemi in vivo. In questo esempio, le cellule tumorali umane sono state modificate per esprimere la luciferasi e iniettate nel cervello di topi viventi. Dopo che le cellule tumorali si sono stabilite in questi animali, sono state trattate con un farmaco anti-cancro. Un successivo test di bioluminescenza ATP in vivo ha rivelato che le cellule tumorali nei topi esposti al farmaco avevano livelli di ATP più bassi.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE al test di bioluminescenza ATP. Ora dovresti avere familiarità con le vie respiratorie cellulari e il protocollo utilizzato per misurare l'ATP, che è il prodotto finale di questi percorsi. Il test di bioluminescenza ATP funge da eccellente strumento di screening per i biologi cellulari interessati a studiare l'effetto di fattori fisiologici e patologici sul metabolismo cellulare e sulla vitalità. Come sempre, grazie per aver guardato!
Nelle lucciole, l'enzima luciferasi converte un composto chiamato luciferina in ossiluciferina e produce luce o "luminescenza" di conseguenza. Questa…
Il test di bioluminescenza ATP è una tecnica comune utilizzata per quantificare i livelli di ATP e rilevare cellule viventi metabolicamente attive. L'ATP o adenosina trifosfato è la fonte primaria di energia per tutti gli organismi viventi, e per "tutti" intendiamo TUTTI. A livello cellulare, l'ATP viene generato attraverso una serie di processi metabolici chiamati respirazione cellulare.
Oggi discuteremo brevemente i percorsi coinvolti nella respirazione cellulare. Successivamente, introdurremo i principi alla base del test di bioluminescenza ATP e passeremo attraverso un protocollo passo-passo per eseguire questo metodo. Infine, vedremo come gli scienziati stanno applicando questa tecnica nella loro attuale ricerca.
Iniziamo introducendo la respirazione cellulare. Questo fenomeno coinvolge diversi processi metabolici, ma ci concentreremo su quello che si occupa del metabolismo del glucosio.
Nel citoplasma, la via della glicolisi converte il glucosio in piruvato e nel processo genera due molecole di ATP. Il piruvato viene trasportato nei mitocondri, dove viene convertito in acetil-coenzima A, un processo che genera anche anidride carbonica. Mentre è ancora nei mitocondri, l'acetil-coenzima A entra quindi nel ciclo dell'acido tricarbossilico o TCA, durante il quale viene nuovamente generata anidride carbonica, così come le molecole ad alta energia di NADH e FADH2. Queste molecole alla fine "trasportano" gli elettroni nella catena di trasporto degli elettroni o ETC.
All'interno dell'ETC, gli elettroni vengono trasferiti sequenzialmente tra diversi complessi proteici nella membrana mitocondriale interna, prima di convertire l'ossigeno in acqua. Durante questo processo, i protoni vengono "pompati" nello spazio intermembrana dei mitocondri. L'ATP viene effettivamente prodotto quando questi protoni rientrano nella matrice mitocondriale mentre passano attraverso una proteina chiamata ATP sintasi. Insieme, il ciclo TCA e l'ETC si traducono nella sintesi di 36 molecole di ATP. La scomposizione di altre molecole nutritive, come grassi e proteine, può anche alimentare il ciclo TCA e ETC, portando alla produzione di ATP.
Ora che sappiamo come le cellule generano ATP, impariamo a conoscere i principi alla base del test di bioluminescenza ATP, che è comunemente usato per misurare i livelli intracellulari di questa molecola.
Strutturalmente, l'ATP ha una base di adenina, uno zucchero ribosio e tre gruppi fosfato, l'ultimo dei quali è collegato da legami ad alta energia. Questi legami rilasciano energia quando si rompono e il test di bioluminescenza ATP capitalizza su questa energia.
Fondamentalmente, questo test richiede il composto luciferina, che è ottenuto da organismi "incandescenti" come le lucciole, e il suo corrispondente enzima catalizzatore chiamato luciferasi. In presenza di ossigeno, la luciferasi ricava energia dall'ATP e converte la luciferina in ossiluciferina. I sottoprodotti di questa reazione sono il pirofosfato, che è due gruppi fosfato ottenuti dall'ATP, convertendolo in adenosina monofosfato o AMP, anidride carbonica, e luce o luminescenza. La luminescenza viene letta da un luminometro, una macchina che quantifica l'emissione luminosa. Poiché la quantità di luminescenza prodotta è direttamente proporzionale alla quantità di ATP, questo serve un buon indicatore della vitalità cellulare e del metabolismo.
Ora che hai compreso i principi alla base del test di bioluminescenza ATP, descriviamo un protocollo generale.
In primo luogo, le cellule vengono seminate in una piastra a 96 pozzetti contenente mezzi di coltura. Le cellule sono placcate a varie densità in triplice copia, per tenere conto della variazione dipendente dalla densità. Poiché i pozzi più esterni non sono circondati da altri pozzi su tutti e quattro i lati, la temperatura e il tasso di evaporazione in questi pozzi possono essere variabili. Pertanto, le celle non sono placcate nei pozzi esterni, ma sono invece riempite d'acqua per evitare l'evaporazione a livello di piastra e la variazione di temperatura che possono influenzare la reazione. Le piastre vengono quindi incubate durante la notte a 37 ° C per consentire alle cellule di aderire alle piastre di coltura.
Quindi, il supporto viene rimosso, la luciferasi e la luciferina vengono aggiunte a ciascun pozzetti e la piastra viene posta su uno shaker per 5-15 minuti per facilitare la reazione. Successivamente, una parte della miscela da ciascun pozzo viene trasferita in una piastra bianca a 96 pozzetti; le piastre bianche sono spesso utilizzate in quanto riflettono la luce verso l'alto, consentendo letture di luminescenza più accurate. Inoltre, le bolle dovrebbero essere evitate, in quanto potrebbero interferire con le analisi successive. Poiché il segnale di luminescenza può diminuire nel tempo, la piastra viene letta entro 10-12 minuti su un luminometro.
Per analizzare i risultati del luminometro, viene calcolato un valore medio di luminescenza da pozzi con la stessa densità cellulare. Confrontando i dati di luminescenza raccolti in questo modo sia da campioni di controllo sani che da cellule trattate, i ricercatori possono valutare gli effetti di un trattamento specifico sulla vitalità e sul metabolismo, in particolare cercando una diminuzione della luminescenza nel gruppo sperimentale.
Ora che hai visto come eseguire un test di bioluminescenza ATP, discutiamo le sue applicazioni di ricerca.
Gli scienziati cercano sempre di sviluppare nuovi antivirali che non danneggino o uccidano le cellule ospiti. In questo studio, le cellule di mammifero sono state seminate in una piastra multiwell e infettate da un virus specifico. A questi campioni sono stati aggiunti vari composti antivirali e sono state generate curve concentrazione-risposta per calcolare la concentrazione effettiva cinquanta o EC50. EC50 è la concentrazione di composto alla quale la vitalità cellulare è del 50 percento. Questo è un parametro comunemente usato per valutare la citotossicità di un composto.
I livelli di ATP possono anche fornire indizi sull'attività mitocondriale in varie condizioni. Qui, il test di bioluminescenza ATP è stato eseguito su preparati di mitocondri derivati da cellule epatiche e muscolari di roditori, che hanno aiutato i ricercatori a valutare l'estensione della funzione mitocondriale nei tessuti normali. È importante sottolineare che questo protocollo potrebbe essere esteso per fornire un modo per esaminare la funzione mitocondriale negli stati patologici.
Gli scienziati stanno anche usando questo test per studiare potenziali trattamenti contro il cancro in sistemi in vivo. In questo esempio, le cellule tumorali umane sono state modificate per esprimere la luciferasi e iniettate nel cervello di topi viventi. Dopo che le cellule tumorali si sono stabilite in questi animali, sono state trattate con un farmaco anti-cancro. Un successivo test di bioluminescenza ATP in vivo ha rivelato che le cellule tumorali nei topi esposti al farmaco avevano livelli di ATP più bassi.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE al test di bioluminescenza ATP. Ora dovresti avere familiarità con le vie respiratorie cellulari e il protocollo utilizzato per misurare l'ATP, che è il prodotto finale di questi percorsi. Il test di bioluminescenza ATP funge da eccellente strumento di screening per i biologi cellulari interessati a studiare l'effetto di fattori fisiologici e patologici sul metabolismo cellulare e sulla vitalità. Come sempre, grazie per aver guardato!
Il test di bioluminescenza ATP è una tecnica comune utilizzata per quantificare i livelli di ATP e rilevare cellule viventi metabolicamente attive. L'ATP o adenosina trifosfato è la fonte primaria di energia per tutti gli organismi viventi, e per "tutti" intendiamo TUTTI. A livello cellulare, l'ATP viene generato attraverso una serie di processi metabolici chiamati respirazione cellulare.
Oggi discuteremo brevemente i percorsi coinvolti nella respirazione cellulare. Successivamente, introdurremo i principi alla base del test di bioluminescenza ATP e passeremo attraverso un protocollo passo-passo per eseguire questo metodo. Infine, vedremo come gli scienziati stanno applicando questa tecnica nella loro attuale ricerca.
Iniziamo introducendo la respirazione cellulare. Questo fenomeno coinvolge diversi processi metabolici, ma ci concentreremo su quello che si occupa del metabolismo del glucosio.
Nel citoplasma, la via della glicolisi converte il glucosio in piruvato e nel processo genera due molecole di ATP. Il piruvato viene trasportato nei mitocondri, dove viene convertito in acetil-coenzima A, un processo che genera anche anidride carbonica. Mentre è ancora nei mitocondri, l'acetil-coenzima A entra quindi nel ciclo dell'acido tricarbossilico o TCA, durante il quale viene nuovamente generata anidride carbonica, così come le molecole ad alta energia di NADH e FADH2. Queste molecole alla fine "trasportano" gli elettroni nella catena di trasporto degli elettroni o ETC.
All'interno dell'ETC, gli elettroni vengono trasferiti sequenzialmente tra diversi complessi proteici nella membrana mitocondriale interna, prima di convertire l'ossigeno in acqua. Durante questo processo, i protoni vengono "pompati" nello spazio intermembrana dei mitocondri. L'ATP viene effettivamente prodotto quando questi protoni rientrano nella matrice mitocondriale mentre passano attraverso una proteina chiamata ATP sintasi. Insieme, il ciclo TCA e l'ETC si traducono nella sintesi di 36 molecole di ATP. La scomposizione di altre molecole nutritive, come grassi e proteine, può anche alimentare il ciclo TCA e ETC, portando alla produzione di ATP.
Ora che sappiamo come le cellule generano ATP, impariamo a conoscere i principi alla base del test di bioluminescenza ATP, che è comunemente usato per misurare i livelli intracellulari di questa molecola.
Strutturalmente, l'ATP ha una base di adenina, uno zucchero ribosio e tre gruppi fosfato, l'ultimo dei quali è collegato da legami ad alta energia. Questi legami rilasciano energia quando si rompono e il test di bioluminescenza ATP capitalizza su questa energia.
Fondamentalmente, questo test richiede il composto luciferina, che è ottenuto da organismi "incandescenti" come le lucciole, e il suo corrispondente enzima catalizzatore chiamato luciferasi. In presenza di ossigeno, la luciferasi ricava energia dall'ATP e converte la luciferina in ossiluciferina. I sottoprodotti di questa reazione sono il pirofosfato, che è due gruppi fosfato ottenuti dall'ATP, convertendolo in adenosina monofosfato o AMP, anidride carbonica, e luce o luminescenza. La luminescenza viene letta da un luminometro, una macchina che quantifica l'emissione luminosa. Poiché la quantità di luminescenza prodotta è direttamente proporzionale alla quantità di ATP, questo serve un buon indicatore della vitalità cellulare e del metabolismo.
Ora che hai compreso i principi alla base del test di bioluminescenza ATP, descriviamo un protocollo generale.
In primo luogo, le cellule vengono seminate in una piastra a 96 pozzetti contenente mezzi di coltura. Le cellule sono placcate a varie densità in triplice copia, per tenere conto della variazione dipendente dalla densità. Poiché i pozzi più esterni non sono circondati da altri pozzi su tutti e quattro i lati, la temperatura e il tasso di evaporazione in questi pozzi possono essere variabili. Pertanto, le celle non sono placcate nei pozzi esterni, ma sono invece riempite d'acqua per evitare l'evaporazione a livello di piastra e la variazione di temperatura che possono influenzare la reazione. Le piastre vengono quindi incubate durante la notte a 37 ° C per consentire alle cellule di aderire alle piastre di coltura.
Quindi, il supporto viene rimosso, la luciferasi e la luciferina vengono aggiunte a ciascun pozzetti e la piastra viene posta su uno shaker per 5-15 minuti per facilitare la reazione. Successivamente, una parte della miscela da ciascun pozzo viene trasferita in una piastra bianca a 96 pozzetti; le piastre bianche sono spesso utilizzate in quanto riflettono la luce verso l'alto, consentendo letture di luminescenza più accurate. Inoltre, le bolle dovrebbero essere evitate, in quanto potrebbero interferire con le analisi successive. Poiché il segnale di luminescenza può diminuire nel tempo, la piastra viene letta entro 10-12 minuti su un luminometro.
Per analizzare i risultati del luminometro, viene calcolato un valore medio di luminescenza da pozzi con la stessa densità cellulare. Confrontando i dati di luminescenza raccolti in questo modo sia da campioni di controllo sani che da cellule trattate, i ricercatori possono valutare gli effetti di un trattamento specifico sulla vitalità e sul metabolismo, in particolare cercando una diminuzione della luminescenza nel gruppo sperimentale.
Ora che hai visto come eseguire un test di bioluminescenza ATP, discutiamo le sue applicazioni di ricerca.
Gli scienziati cercano sempre di sviluppare nuovi antivirali che non danneggino o uccidano le cellule ospiti. In questo studio, le cellule di mammifero sono state seminate in una piastra multiwell e infettate da un virus specifico. A questi campioni sono stati aggiunti vari composti antivirali e sono state generate curve concentrazione-risposta per calcolare la concentrazione effettiva cinquanta o EC50. EC50 è la concentrazione di composto alla quale la vitalità cellulare è del 50 percento. Questo è un parametro comunemente usato per valutare la citotossicità di un composto.
I livelli di ATP possono anche fornire indizi sull'attività mitocondriale in varie condizioni. Qui, il test di bioluminescenza ATP è stato eseguito su preparati di mitocondri derivati da cellule epatiche e muscolari di roditori, che hanno aiutato i ricercatori a valutare l'estensione della funzione mitocondriale nei tessuti normali. È importante sottolineare che questo protocollo potrebbe essere esteso per fornire un modo per esaminare la funzione mitocondriale negli stati patologici.
Gli scienziati stanno anche usando questo test per studiare potenziali trattamenti contro il cancro in sistemi in vivo. In questo esempio, le cellule tumorali umane sono state modificate per esprimere la luciferasi e iniettate nel cervello di topi viventi. Dopo che le cellule tumorali si sono stabilite in questi animali, sono state trattate con un farmaco anti-cancro. Un successivo test di bioluminescenza ATP in vivo ha rivelato che le cellule tumorali nei topi esposti al farmaco avevano livelli di ATP più bassi.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE al test di bioluminescenza ATP. Ora dovresti avere familiarità con le vie respiratorie cellulari e il protocollo utilizzato per misurare l'ATP, che è il prodotto finale di questi percorsi. Il test di bioluminescenza ATP funge da eccellente strumento di screening per i biologi cellulari interessati a studiare l'effetto di fattori fisiologici e patologici sul metabolismo cellulare e sulla vitalità. Come sempre, grazie per aver guardato!
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Q1: How does ATP bioluminescence assay measure cell viability?
The ATP bioluminescence assay uses luciferase enzyme to convert luciferin into oxyluciferin, producing light proportional to ATP levels. Since ATP reflects cellular metabolism and energy status, luminescence intensity directly indicates cell viability. A luminometer quantifies light emission, allowing researchers to assess whether cells are metabolically active or compromised by treatment or disease.
Q2: What role does ATP play in cellular respiration?
ATP is the primary energy currency produced through cellular respiration, a series of metabolic processes including glycolysis, the TCA cycle, and the electron transport chain. Glycolysis generates two ATP molecules, while the TCA cycle and electron transport chain together produce 36 ATP molecules. This energy powers all cellular functions in living organisms.
Q3: Why are outer wells filled with water in the ATP bioluminescence assay protocol?
Outer wells in a 96-well plate lack surrounding wells on all sides, causing variable temperature and evaporation rates. Filling these wells with water prevents plate-wide evaporation and temperature fluctuations that could interfere with the assay reaction and compromise luminescence readings from experimental wells.
Q4: What is EC50 and how does it relate to antiviral compound testing?
EC50 is the concentration of a compound at which cell viability drops to 50 percent, serving as a standard parameter to assess cytotoxicity. In antiviral research, scientists use the ATP bioluminescence assay to generate concentration-response curves and calculate EC50 values, helping identify effective antiviral compounds that minimize harm to host cells.
Q5: How does the luciferase-luciferin reaction produce luminescence?
Luciferase enzyme uses energy from ATP to convert luciferin into oxyluciferin in the presence of oxygen. This reaction releases byproducts including pyrophosphate, carbon dioxide, and light or luminescence. The amount of light produced is directly proportional to ATP concentration, making it a reliable indicator of cellular energy status.
Q6: Why are white 96-well plates preferred for luminescence measurements?
White 96-well plates reflect light upward toward the luminometer detector, enabling more accurate and sensitive luminescence readings compared to other plate colors. This reflective property maximizes signal detection and reduces background noise, improving the reliability of ATP quantification in the assay.
Q7: How can the ATP bioluminescence assay reveal mitochondrial function in disease states?
The assay measures ATP production, which directly reflects mitochondrial activity and oxidative phosphorylation efficiency. By comparing ATP levels in healthy tissue mitochondria versus diseased preparations, researchers can assess whether mitochondrial dysfunction contributes to pathological conditions, providing insights into metabolic disruption in disease.
Capitoli in questo video
0:00
Overview
0:57
Cellular Respiration
2:43
Principles Behind the ATP Bioluminescence Assay
4:09
General Protocol for Measuring ATP in Cells
6:04
Applications
7:56
Summary