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Il saggio di bioluminescenza ATP

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Cell Biology

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The ATP Bioluminescence Assay

4.10: An Introduction to Cell Metabolism

4.13: An Introduction to Cell Death

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08:32 min

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April 30, 2023

Overview

Nelle lucciole, l’enzima luciferasi converte un composto chiamato luciferina in ossiluciferina e produce luce o “luminescenza” di conseguenza. Questa reazione richiede energia derivata dall’ATP per procedere, quindi i ricercatori hanno sfruttato l’interazione luciferasi-luciferina per misurare i livelli di ATP nelle cellule. Dato il ruolo dell’ATP come valuta energetica della cellula, il test di bioluminescenza dell’ATP può fornire informazioni sul metabolismo cellulare e sulla salute generale delle cellule.

In questo video, JoVE discute la respirazione cellulare, in particolare esaminando come il metabolismo del glucosio provoca la produzione di ATP. Questo è seguito dai principi alla base del test di bioluminescenza ATP e da un protocollo generalizzato per questa tecnica. Infine, un’indagine su come i ricercatori stanno attualmente utilizzando il test di bioluminescenza ATP per valutare la vitalità cellulare in una varietà di condizioni sperimentali.

Procedure

Il test di bioluminescenza ATP è una tecnica comune utilizzata per quantificare i livelli di ATP e rilevare cellule viventi metabolicamente attive. L’ATP o adenosina trifosfato è la fonte primaria di energia per tutti gli organismi viventi, e per “tutti” intendiamo TUTTI. A livello cellulare, l’ATP viene generato attraverso una serie di processi metabolici chiamati respirazione cellulare.

Oggi discuteremo brevemente i percorsi coinvolti nella respirazione cellulare. Successivamente, introdurremo i principi alla base del test di bioluminescenza ATP e passeremo attraverso un protocollo passo-passo per eseguire questo metodo. Infine, vedremo come gli scienziati stanno applicando questa tecnica nella loro attuale ricerca.

Iniziamo introducendo la respirazione cellulare. Questo fenomeno coinvolge diversi processi metabolici, ma ci concentreremo su quello che si occupa del metabolismo del glucosio.

Nel citoplasma, la via della glicolisi converte il glucosio in piruvato e nel processo genera due molecole di ATP. Il piruvato viene trasportato nei mitocondri, dove viene convertito in acetil-coenzima A, un processo che genera anche anidride carbonica. Mentre è ancora nei mitocondri, l’acetil-coenzima A entra quindi nel ciclo dell’acido tricarbossilico o TCA, durante il quale viene nuovamente generata anidride carbonica, così come le molecole ad alta energia di NADH e FADH2. Queste molecole alla fine “trasportano” gli elettroni nella catena di trasporto degli elettroni o ETC.

All’interno dell’ETC, gli elettroni vengono trasferiti sequenzialmente tra diversi complessi proteici nella membrana mitocondriale interna, prima di convertire l’ossigeno in acqua. Durante questo processo, i protoni vengono “pompati” nello spazio intermembrana dei mitocondri. L’ATP viene effettivamente prodotto quando questi protoni rientrano nella matrice mitocondriale mentre passano attraverso una proteina chiamata ATP sintasi. Insieme, il ciclo TCA e l’ETC si traducono nella sintesi di 36 molecole di ATP. La scomposizione di altre molecole nutritive, come grassi e proteine, può anche alimentare il ciclo TCA e ETC, portando alla produzione di ATP.

Ora che sappiamo come le cellule generano ATP, impariamo a conoscere i principi alla base del test di bioluminescenza ATP, che è comunemente usato per misurare i livelli intracellulari di questa molecola.

Strutturalmente, l’ATP ha una base di adenina, uno zucchero ribosio e tre gruppi fosfato, l’ultimo dei quali è collegato da legami ad alta energia. Questi legami rilasciano energia quando si rompono e il test di bioluminescenza ATP capitalizza su questa energia.

Fondamentalmente, questo test richiede il composto luciferina, che è ottenuto da organismi “incandescenti” come le lucciole, e il suo corrispondente enzima catalizzatore chiamato luciferasi. In presenza di ossigeno, la luciferasi ricava energia dall’ATP e converte la luciferina in ossiluciferina. I sottoprodotti di questa reazione sono il pirofosfato, che è due gruppi fosfato ottenuti dall’ATP, convertendolo in adenosina monofosfato o AMP, anidride carbonica, e luce o luminescenza. La luminescenza viene letta da un luminometro, una macchina che quantifica l’emissione luminosa. Poiché la quantità di luminescenza prodotta è direttamente proporzionale alla quantità di ATP, questo serve un buon indicatore della vitalità cellulare e del metabolismo.

Ora che hai compreso i principi alla base del test di bioluminescenza ATP, descriviamo un protocollo generale.

In primo luogo, le cellule vengono seminate in una piastra a 96 pozzetti contenente mezzi di coltura. Le cellule sono placcate a varie densità in triplice copia, per tenere conto della variazione dipendente dalla densità. Poiché i pozzi più esterni non sono circondati da altri pozzi su tutti e quattro i lati, la temperatura e il tasso di evaporazione in questi pozzi possono essere variabili. Pertanto, le celle non sono placcate nei pozzi esterni, ma sono invece riempite d’acqua per evitare l’evaporazione a livello di piastra e la variazione di temperatura che possono influenzare la reazione. Le piastre vengono quindi incubate durante la notte a 37 ° C per consentire alle cellule di aderire alle piastre di coltura.

Quindi, il supporto viene rimosso, la luciferasi e la luciferina vengono aggiunte a ciascun pozzetti e la piastra viene posta su uno shaker per 5-15 minuti per facilitare la reazione. Successivamente, una parte della miscela da ciascun pozzo viene trasferita in una piastra bianca a 96 pozzetti; le piastre bianche sono spesso utilizzate in quanto riflettono la luce verso l’alto, consentendo letture di luminescenza più accurate. Inoltre, le bolle dovrebbero essere evitate, in quanto potrebbero interferire con le analisi successive. Poiché il segnale di luminescenza può diminuire nel tempo, la piastra viene letta entro 10-12 minuti su un luminometro.

Per analizzare i risultati del luminometro, viene calcolato un valore medio di luminescenza da pozzi con la stessa densità cellulare. Confrontando i dati di luminescenza raccolti in questo modo sia da campioni di controllo sani che da cellule trattate, i ricercatori possono valutare gli effetti di un trattamento specifico sulla vitalità e sul metabolismo, in particolare cercando una diminuzione della luminescenza nel gruppo sperimentale.

Ora che hai visto come eseguire un test di bioluminescenza ATP, discutiamo le sue applicazioni di ricerca.

Gli scienziati cercano sempre di sviluppare nuovi antivirali che non danneggino o uccidano le cellule ospiti. In questo studio, le cellule di mammifero sono state seminate in una piastra multiwell e infettate da un virus specifico. A questi campioni sono stati aggiunti vari composti antivirali e sono state generate curve concentrazione-risposta per calcolare la concentrazione effettiva cinquanta o EC50. EC50 è la concentrazione di composto alla quale la vitalità cellulare è del 50 percento. Questo è un parametro comunemente usato per valutare la citotossicità di un composto.

I livelli di ATP possono anche fornire indizi sull’attività mitocondriale in varie condizioni. Qui, il test di bioluminescenza ATP è stato eseguito su preparati di mitocondri derivati da cellule epatiche e muscolari di roditori, che hanno aiutato i ricercatori a valutare l’estensione della funzione mitocondriale nei tessuti normali. È importante sottolineare che questo protocollo potrebbe essere esteso per fornire un modo per esaminare la funzione mitocondriale negli stati patologici.

Gli scienziati stanno anche usando questo test per studiare potenziali trattamenti contro il cancro in sistemi in vivo. In questo esempio, le cellule tumorali umane sono state modificate per esprimere la luciferasi e iniettate nel cervello di topi viventi. Dopo che le cellule tumorali si sono stabilite in questi animali, sono state trattate con un farmaco anti-cancro. Un successivo test di bioluminescenza ATP in vivo ha rivelato che le cellule tumorali nei topi esposti al farmaco avevano livelli di ATP più bassi.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE al test di bioluminescenza ATP. Ora dovresti avere familiarità con le vie respiratorie cellulari e il protocollo utilizzato per misurare l’ATP, che è il prodotto finale di questi percorsi. Il test di bioluminescenza ATP funge da eccellente strumento di screening per i biologi cellulari interessati a studiare l’effetto di fattori fisiologici e patologici sul metabolismo cellulare e sulla vitalità. Come sempre, grazie per aver guardato!

Transcript

The ATP bioluminescence assay is a common technique used to quantify ATP levels and detect living, metabolically active cells. ATP or adenosine triphosphate is the primary source of energy for all living organisms, and by “all” we mean ALL. At the cellular level, ATP is generated through a set of metabolic processes called cellular respiration.

Today, we’ll briefly discuss the pathways involved in cellular respiration. Next, we’ll introduce the principles behind the ATP bioluminescence assay, and go through a step-by-step protocol for performing this method. Finally, we’ll see how scientists are applying this technique in their current research.

Lets begin by introducing cellular respiration. This phenomenon involves several metabolic processes, but we’ll focus on the one dealing with glucose metabolism.

In the cytoplasm, the glycolysis pathway converts glucose to pyruvate, and in the process generates two ATP molecules. Pyruvate is transported into the mitochondria, where it is converted to acetyl-coenzyme A—a process that also generates carbon dioxide. While still in the mitochondria, acetyl-coenzyme A then enters the tricarboxylic acid or TCA cycle, during which carbon dioxide is again generated, as are the high-energy molecules of NADH and FADH2. These molecules ultimately “carry” electrons into the electron transport chain or ETC.

Within the ETC, electrons are sequentially transferred between different protein complexes in the inner mitochondrial membrane, before converting oxygen to water. During this process, protons are “pumped” into the intermembrane space of mitochondria. ATP is actually produced when these protons enter back into the mitochondrial matrix as they pass through a protein called ATP synthase. Together, the TCA cycle and ETC result in the synthesis of 36 ATP molecules. Breakdown of other nutrient molecules, such as fats and proteins, can also feed into the TCA cycle and ETC, leading to ATP production.

Now that we know how cells generate ATP, let’s learn about the principles behind the ATP bioluminescence assay, which is commonly used to measure intracellular levels of this molecule.

Structurally, ATP has an adenine base, a ribose sugar, and three phosphate groups—the latter of which are connected by high-energy bonds. These bonds release energy when broken, and the ATP bioluminescence assay capitalizes on this energy.

Basically, this assay requires the luciferin compound, which is obtained from “glowing” organisms like fireflies, and its corresponding catalyst enzyme called luciferase. In the presence of oxygen, luciferase derives energy from ATP and converts luciferin into oxyluciferin. Byproducts of this reaction are pyrophosphate, which is two phosphate groups obtained from ATP—converting it to adenosine monophosphate or AMP—carbon dioxide, and light or luminescence. Luminescence is read by a luminometer, a machine that quantifies light emission. Since the amount of luminescence produced is directly proportional to the amount of ATP, this serves a good indicator of cell viability and metabolism.

Now that you understand the principles behind the ATP bioluminescence assay, let’s outline a general protocol.

First, cells are seeded in a 96-well plate containing culture media. Cells are plated at various densities in triplicate, to account for density-dependent variation. Since the outer-most wells are not surrounded by other wells on all four sides, the temperature and evaporation rate in these wells may be variable. Therefore, cells are not plated in the outer wells, and instead they are filled with water to avoid plate-wide evaporation and temperature variation that may affect the reaction. Plates are then incubated overnight at 37°C to allow the cells to adhere to the culture plates.

Then, the media is removed, luciferase and luciferin are added to each well, and the plate is placed on a shaker for 5–15 minutes to facilitate the reaction. Next, a portion of the mixture from each well is transferred to a white 96-well plate; white plates are often used as they reflect light upwards, allowing for more accurate luminescence readings. In addition, bubbles should be avoided, as they could interfere with subsequent analyses. As the luminescence signal can decrease over time, the plate is read within 10–12 minutes on a luminometer.

To analyze the luminometer results, an average luminescence value is calculated from wells with the same cell density. By comparing luminescence data collected in this manner from both healthy control samples and treated cells, researchers can evaluate the effects of a specific treatment on viability and metabolism—specifically by looking for decreased luminescence in the experimental group.

Now that you’ve seen how to perform an ATP bioluminescence assay, let’s discuss its research applications.

Scientists are always trying to develop new antivirals that don’t harm or kill host cells. In this study, mammalian cells were seeded in a multiwell plate and infected with a specific virus. Various antiviral compounds were added to these samples, and log concentration-response curves were generated to calculate the effective concentration fifty or EC50. EC50 is the concentration of compound at which cell viability is 50 percent. This is a commonly used parameter to assess a compound’s cytotoxicity.

ATP levels can also yield clues about mitochondrial activity under various conditions. Here, the ATP bioluminescence assay was performed on preparations of mitochondria derived from rodent liver and muscle cells, which helped researchers assess the extent of mitochondrial function in normal tissues. Importantly, this protocol could be extended to provide a way to examine mitochondrial function in disease states.

Scientists are also using this assay to investigate potential cancer treatments in in vivo systems. In this example, human tumor cells were modified to express luciferase and injected into the brains of living mice. After the tumor cells became established in these animals, they were treated with an anti-cancer drug. A subsequent in vivo ATP bioluminescence assay revealed that tumor cells in drug-exposed mice had lower ATP levels.

You’ve just watched JoVE’s introduction to the ATP bioluminescence assay. You should now be familiar with the cellular respiration pathways and the protocol used to measure ATP, which is the end product of these pathways. The ATP bioluminescence assay serves as an excellent screening tool for cell biologists interested in studying the effect of physiological and pathological factors on cell metabolism and viability. As always, thanks for watching!

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