4.11: Il saggio di bioluminescenza ATP

Il saggio di bioluminescenza dell'ATP è una tecnica comune utilizzata per quantificare i livelli di ATP e rilevare le cellule viventi metabolicamente attive. L'ATP o adenosina trifosfato è la principale fonte di energia per tutti gli organismi viventi, e da ?tutti? intendiamo TUTTI. A livello cellulare, l'ATP viene generato attraverso una serie di processi metabolici chiamati respirazione cellulare.

Oggi discuteremo brevemente i percorsi coinvolti nella respirazione cellulare. Successivamente, introdurremo i principi alla base del saggio di bioluminescenza dell'ATP e esamineremo un protocollo passo dopo passo per l'esecuzione di questo metodo. Infine, vedremo come gli scienziati stanno applicando questa tecnica nella loro ricerca attuale.

Cominciamo introducendo la respirazione cellulare. Questo fenomeno coinvolge diversi processi metabolici, ma ci concentreremo su quello che ha a che fare con il metabolismo del glucosio.

Nel citoplasma, la via della glicolisi converte il glucosio in piruvato e nel processo genera due molecole di ATP. Il piruvato viene trasportato nei mitocondri, dove viene convertito in acetil-coenzima A?un processo che genera anche anidride carbonica. Mentre è ancora nei mitocondri, l'acetil-coenzima A entra quindi nel ciclo dell'acido tricarbossilico o TCA, durante il quale l'anidride carbonica viene nuovamente generata, così come le molecole ad alta energia di NADH e FADH2. Queste molecole alla fine "trasportano? elettroni nella catena di trasporto degli elettroni o ETC.

All'interno dell'ETC, gli elettroni vengono trasferiti in sequenza tra diversi complessi proteici nella membrana mitocondriale interna, prima di convertire l'ossigeno in acqua. Durante questo processo, i protoni vengono "pompati" nello spazio intermembrana dei mitocondri. L'ATP viene effettivamente prodotto quando questi protoni rientrano nella matrice mitocondriale mentre passano attraverso una proteina chiamata ATP sintasi. Insieme, il ciclo TCA e l'ETC portano alla sintesi di 36 molecole di ATP. La scomposizione di altre molecole nutritive, come grassi e proteine, può anche alimentare il ciclo TCA e l'ETC, portando alla produzione di ATP.

Ora che sappiamo come le cellule generano ATP, impariamo a conoscere i principi alla base del saggio di bioluminescenza dell'ATP, che viene comunemente utilizzato per misurare i livelli intracellulari di questa molecola.

Strutturalmente, l'ATP ha una base adenina, uno zucchero ribosio e tre gruppi fosfato, questi ultimi collegati da legami ad alta energia. Questi legami rilasciano energia quando vengono rotti e il saggio di bioluminescenza dell'ATP sfrutta questa energia.

Fondamentalmente, questo test richiede il composto luciferina, che si ottiene da organismi "luminosi" come le lucciole, e il suo corrispondente enzima catalizzatore chiamato luciferasi. In presenza di ossigeno, la luciferasi ricava energia dall'ATP e converte la luciferina in ossiluciferina. I sottoprodotti di questa reazione sono il pirofosfato, che è costituito da due gruppi fosfato ottenuti dall'ATP che lo converte in adenosina monofosfato o AMP anidride carbonica, e la luce o luminescenza. La luminescenza viene letta da un luminometro, una macchina che quantifica l'emissione di luce. Poiché la quantità di luminescenza prodotta è direttamente proporzionale alla quantità di ATP, questo serve un buon indicatore della vitalità cellulare e del metabolismo.

Ora che hai compreso i principi alla base del saggio di bioluminescenza dell'ATP, delineiamo un protocollo generale.

In primo luogo, le cellule vengono seminate in una piastra a 96 pozzetti contenente terreni di coltura. Le celle sono piastrate a varie densità in triplicato, per tenere conto della variazione dipendente dalla densità. Poiché i pozzi più esterni non sono circondati da altri pozzi su tutti e quattro i lati, la temperatura e il tasso di evaporazione in questi pozzi possono essere variabili. Pertanto, le celle non vengono piastrate nei pozzetti esterni, ma vengono riempite d'acqua per evitare l'evaporazione a livello di piastra e la variazione di temperatura che possono influenzare la reazione. Le piastre vengono quindi incubate durante la notte a 37 anni? C per consentire alle cellule di aderire alle piastre di coltura.

Quindi, il terreno viene rimosso, la luciferasi e la luciferina vengono aggiunte a ciascun pozzetto e la piastra viene posta su uno shaker per 5-15 minuti per facilitare la reazione. Successivamente, una parte della miscela da ciascun pozzetto viene trasferita in una piastra bianca a 96 pozzetti; Le lastre bianche vengono spesso utilizzate in quanto riflettono la luce verso l'alto, consentendo letture della luminescenza più accurate. Inoltre, le bolle dovrebbero essere evitate, in quanto potrebbero interferire con le analisi successive. Poiché il segnale di luminescenza può diminuire nel tempo, la lastra viene letta entro 10-12 minuti su un luminometro.

Per analizzare i risultati del luminometro, viene calcolato un valore medio di luminescenza da pozzetti con la stessa densità di celle. Confrontando i dati sulla luminescenza raccolti in questo modo sia da campioni di controllo sani che da cellule trattate, i ricercatori possono valutare gli effetti di un trattamento specifico sulla vitalità e sul metabolismo, in particolare cercando una diminuzione della luminescenza nel gruppo sperimentale.

Ora che hai visto come eseguire un saggio di bioluminescenza dell'ATP, discutiamo le sue applicazioni di ricerca.

Gli scienziati cercano sempre di sviluppare nuovi antivirali che non danneggino o uccidano le cellule ospiti. In questo studio, le cellule di mammifero sono state seminate in una piastra multipozzetto e infettate con un virus specifico. A questi campioni sono stati aggiunti vari composti antivirali e sono state generate curve logaritmiche concentrazione-risposta per calcolare la concentrazione efficace cinquanta o EC50. EC50 è la concentrazione del composto alla quale la vitalità cellulare è del 50 percento. Questo è un parametro comunemente usato per valutare la citotossicità di un composto.

I livelli di ATP possono anche fornire indizi sull'attività mitocondriale in varie condizioni. Qui, il test di bioluminescenza dell'ATP è stato eseguito su preparazioni di mitocondri derivate da cellule epatiche e muscolari di roditori, che hanno aiutato i ricercatori a valutare l'entità della funzione mitocondriale nei tessuti normali. È importante sottolineare che questo protocollo potrebbe essere esteso per fornire un modo per esaminare la funzione mitocondriale negli stati patologici.

Gli scienziati stanno anche utilizzando questo test per studiare potenziali trattamenti antitumorali nei sistemi in vivo. In questo esempio, le cellule tumorali umane sono state modificate per esprimere la luciferasi e iniettate nel cervello di topi vivi. Dopo che le cellule tumorali si sono stabilite in questi animali, sono state trattate con un farmaco antitumorale. Un successivo test di bioluminescenza dell'ATP in vivo ha rivelato che le cellule tumorali nei topi esposti al farmaco avevano livelli di ATP più bassi.

Avete appena visto l'introduzione di JoVE al saggio di bioluminescenza dell'ATP. Ora dovresti avere familiarità con le vie di respirazione cellulare e il protocollo utilizzato per misurare l'ATP, che è il prodotto finale di queste vie. Il saggio di bioluminescenza dell'ATP è un eccellente strumento di screening per i biologi cellulari interessati a studiare l'effetto di fattori fisiologici e patologici sul metabolismo e sulla vitalità cellulare. Come sempre, grazie per la visione!